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    脫脂蛋黃蛋白粉酶水解實(shí)驗(yàn)研究

    2012-09-05 14:21:34李建穎趙彥巧吳子健詹鳴昕
    食品研究與開發(fā) 2012年12期
    關(guān)鍵詞:蛋白粉底物水解

    李建穎,趙彥巧,吳子健,詹鳴昕

    (天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院,天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300134)

    目前醫(yī)藥企業(yè)提取完藥用卵磷脂后,就將蛋黃粉下腳料廢棄,其實(shí)提取完藥用卵磷脂后的蛋黃粉還含有一定量的雞蛋蛋白質(zhì)。雞蛋蛋白質(zhì)是一種優(yōu)質(zhì)蛋白,消化率達(dá)98%,生物價(jià)達(dá)94,其氨基酸組成符合人體需要的模式[1]。如何更好地利用蛋黃粉的下腳料,是目前醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)中一個(gè)值得研究的問題。高蛋白粉是一種有特色的產(chǎn)品,其蛋白質(zhì)含量高達(dá)80%以上,脂肪和膽固醇含量較低,長期食用,沒有動物蛋白的副作用,不會引起肥胖、高血脂、心腦血管等疾病,具有較高的營養(yǎng)價(jià)值,也有較高的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益[2]。目前,國內(nèi)外對雞蛋蛋白多肽的功能特性的研究報(bào)道較少。目前針對蛋黃研究產(chǎn)品僅有蛋黃油、卵黃免疫球蛋白、卵黃高磷蛋白,品種較少,還應(yīng)將蛋黃中其他的蛋白質(zhì)成分及其多肽進(jìn)行充分利用[3]。因此,本文對蛋黃蛋白多肽的功能特性進(jìn)行了研究,可為雞蛋蛋白多肽在嬰幼兒、老年人、病人等蛋白吸收機(jī)能較差人群的食品開發(fā)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)和參考。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備

    蛋黃粉:購于北京金健力蛋粉廠;氫氧化鈉、濃鹽酸、三氯乙酸、甲醛、無水碳酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、95%乙醇、無水乙醚等試劑:購于天津市江天化工技術(shù)有限公司,皆為分析純;丙酮、硫酸:購于天津市化學(xué)試劑批發(fā)公司,分析純;福林試劑B:購于鼎瑞化工(上海)有限公司,分析純;干酪素、L-酪氨酸:購于天津市光復(fù)化工精細(xì)研究所;胃蛋白酶、胰蛋白酶:購于中國上海化學(xué)試劑有限公司。

    PHS-3B型精密pH計(jì)、FA1004型電子分析天平:上海精密科學(xué)儀器有限公司;XMTD-204型數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋、EMS-2型加熱定時(shí)磁力攪拌器:天津市歐諾儀器儀表有限公司;SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵:鄭州長城科工貿(mào)有限公司;RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:上海亞英生化儀器廠;DGG-H-3型電熱鼓風(fēng)干燥箱 :天津市天宇實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;UV-7054單光束紫外-可見分光光度計(jì):上海欣茂儀器有限公司;DL-6000型低速冷凍離心機(jī):上海安亭科學(xué)儀器廠;全自動凱氏定氮儀:蘇州市天威儀器有限公司。

    1.2 脫脂蛋黃蛋白粉的制備

    采用乙醇浸取法對蛋黃粉脫脂去油,具體操作方法[4]:稱取蛋黃粉加入錐形瓶中,加入15倍量乙醇脫脂,溫度40℃,間歇攪拌4 h,過濾,沉淀用少量溶劑洗,抽干,放入干燥箱中干燥,即得。

    1.3 蛋白酶解液的制備

    稱取一定量的蛋白粉,加水勻漿,濃度為5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))左右,加1 mol/L氫氧化鈉或者1 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)體系pH,加入指定重量的酶,置于一定溫度的水浴鍋中水浴中加熱一定時(shí)間后,在95℃下滅酶10 min,冷卻后,于6 000 r/min下離心15 min,取上清液即得酶解液。取酶解液,用半微量凱氏定氮法[5]測定總氮含量,用電位滴定法[6]測定氨基氮含量。

    1.4 水解度的測定

    蛋白質(zhì)的水解度(DH)定義為在水解過程中打開的肽鍵占蛋白質(zhì)肽鍵總數(shù)的百分比,其計(jì)算公式如下:

    2 結(jié)果與討論

    2.1 胃蛋白酶水解蛋白粉最適溫度的選擇

    固定蛋白粉濃度為5%(g/mL,下同),酶濃度為1%,pH 為 2.0,溫度分別設(shè)為 30、38、40、45、50 ℃,反應(yīng)4 h,其水解度測定結(jié)果見圖1。

    由圖1可以看出,從30℃開始隨著溫度的升高,酶水解度逐漸增大,到38℃時(shí)水解度達(dá)到最大,其水解度為16.12%。隨著溫度繼續(xù)升高,蛋白質(zhì)水解度急劇下降,到50℃達(dá)到最低。因此,可認(rèn)為胃蛋白酶的最適溫度為38℃。

    2.2 胃蛋白酶水解蛋白粉最適pH的選擇

    固定蛋白粉濃度為5%,酶濃度為1%,溫度為38 ℃,分別調(diào)節(jié) pH 為 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0,反應(yīng) 4 h,其水解度見圖2。

    由圖2可以看出,在pH在1.0時(shí),隨著pH的升高,水解度逐漸增大,當(dāng)pH達(dá)到2.0時(shí),水解度達(dá)到最大值,其水解度為16.12%。隨著pH繼續(xù)增大,水解度程下降趨勢。因此,胃蛋白酶的最佳pH為2.0。

    2.3 胃蛋白酶水解蛋白粉最佳底物濃度選擇

    固定酶濃度為1%,溫度為38℃,pH為2.0,分別配制蛋白粉濃度為2%、3%、4%、5%、6%,反應(yīng)4 h,其水解度見圖3。

    由圖3可以看出,當(dāng)?shù)孜餄舛仍?%~3%時(shí),蛋白質(zhì)水解度隨底物濃度的增加而極具增大,當(dāng)?shù)孜餄舛仍?%~4%與5%~6%時(shí),蛋白質(zhì)水解度隨底物濃度的增加而減小。在底物濃度為5%時(shí),蛋白質(zhì)水解度達(dá)到最大值,其水解度為16.49%。因此,胃蛋白酶酶解的最佳底物濃度為5%。

    2.4 胃蛋白酶水解蛋白粉最佳酶濃度選擇

    固定蛋白粉濃度為5%,pH為2.0,溫度為38℃,酶添加量分別為 0.2%、0.5%、1.0%、2.0%,3.0%,反應(yīng)4 h,其水解度見圖4。

    由圖4可以看出,隨著酶濃度的增加,蛋白質(zhì)的水解度逐漸增大。當(dāng)酶濃度增加到1.0%時(shí),蛋白質(zhì)的水解度隨酶濃度的增加變化不大。因此,在工業(yè)化生產(chǎn)中,要綜合考慮水解度及生產(chǎn)成本之間的關(guān)系,為達(dá)到高水解度低成本,選用最適胃蛋白酶添加量為1%,其水解度可達(dá)15.90%。

    2.5 胃蛋白酶水解蛋白粉最佳水解時(shí)間的選擇

    固定蛋白粉濃度為5%,酶濃度為0.2%,溫度為38 ℃,pH 為 2.0,在酶解時(shí)間為 1、2、3、4、5 h 期間,分別測其水解度,結(jié)果見圖5。

    由圖5可以看出,蛋白質(zhì)的水解度隨著水解時(shí)間的延長而增大。當(dāng)水解時(shí)間達(dá)到4 h時(shí),水解度隨著水解時(shí)間的增大而變化不大。因此,確定胃蛋白酶的最佳水解時(shí)間為4 h,此時(shí)胃蛋白酶水解蛋白粉的水解度為16.77%。

    2.6 胃蛋白酶水解正交試驗(yàn)

    根據(jù)單因素試驗(yàn)所得結(jié)果可知,溫度、底物濃度、酶濃度、酶解時(shí)間是影響水解度的主要因素,采用L9(34)的正交試驗(yàn),找出最佳試驗(yàn)條件。正交試驗(yàn)方案及結(jié)果如表1及表2所示。

    表1 因素水平表Table 1 The table of factors and levels

    由表2可以看出:各因素對蛋白粉水解度影響的主次順序?yàn)锳>B>C>D,即溫度對蛋白粉的水解度影響最大,其次是底物濃度、酶濃度,酶解時(shí)間。根據(jù)k值可確定最優(yōu)水平組合為A2B3C3D2,即最佳水解條件為:水解溫度為38℃,底物濃度為5%,酶濃度為2.0%,水解時(shí)間為4 h。

    表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiments

    2.7 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

    根據(jù)以上分析,進(jìn)行如下驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),結(jié)果見表3。

    表3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of the confirmatory experiment

    可以看出,實(shí)驗(yàn)是穩(wěn)定可靠的。經(jīng)過驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),得到胃蛋白酶水解的最佳工藝條件,其條件為:水解溫度為38℃,底物濃度為5%,酶濃度為2.0%,水解時(shí)間為4h。此條件下蛋白粉的平均水解度可達(dá)15.76%。

    2.8 雙酶水解蛋白粉

    采用兩步水解法[7-8]。根據(jù)正交試驗(yàn)的優(yōu)化水解條件,先用胃蛋白酶在優(yōu)化條件下先將蛋白粉水解至一定程度,測定水解度。再用胰蛋白酶繼續(xù)將部分水解的蛋白粉水解至不同程度,其他酶解條件為底物濃度6%、酶濃度0.5%、溫度55℃、pH為7.5、水解4 h。以考察胃蛋白酶—胰蛋白酶雙酶水解對水解效果的影響,其結(jié)果如表4所示。

    由表4可知,由胃蛋白酶—胰蛋白酶組合酶水解蛋白粉,可以取得良好的水解效果,水解度明顯高于胃蛋白酶單酶水解。

    表4 雙酶水解對水解效果的影響Table 4 The comparison results of double enzyme hydrolysis and single enzyme hydrolysis

    3 結(jié)論

    1)胃蛋白酶水解的最佳工藝條件:稱取5 g蛋白粉,加100 mL水勻漿,加1mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH為2.0,加入2 g胃蛋白酶,38℃條件下水解4 h后,95℃下滅酶10 min,此條件下平均水解度為15.76%。

    2)胃蛋白酶—胰蛋白酶組合水解最佳工藝條件:在pH為2.0,溫度為38℃,底物濃度為6%的條件下,先加入濃度為2.0%的胃蛋白酶水解4 h,而后調(diào)節(jié)pH為7.5,溫度55℃,再加入濃度為0.5%的胰蛋白酶水解4 h,此時(shí)水解度高達(dá)20.41%。因此,胃蛋白酶—胰蛋白酶組合酶水解蛋白粉的水解效果明顯優(yōu)于胃蛋白酶單酶水解。

    [1]邱寧,馬美湖.雞蛋蛋白質(zhì)組學(xué)研究現(xiàn)狀與展望[J].中國家禽,2011,33(2):4-10

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