脫脂蛋黃蛋白粉酶水解實(shí)驗(yàn)研究

李建穎，趙彥巧，吳子健，詹鳴昕

（天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300134）

目前醫(yī)藥企業(yè)提取完藥用卵磷脂后，就將蛋黃粉下腳料廢棄，其實(shí)提取完藥用卵磷脂后的蛋黃粉還含有一定量的雞蛋蛋白質(zhì)。雞蛋蛋白質(zhì)是一種優(yōu)質(zhì)蛋白，消化率達(dá)98%，生物價(jià)達(dá)94，其氨基酸組成符合人體需要的模式[1]。如何更好地利用蛋黃粉的下腳料，是目前醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)中一個(gè)值得研究的問題。高蛋白粉是一種有特色的產(chǎn)品，其蛋白質(zhì)含量高達(dá)80%以上，脂肪和膽固醇含量較低，長期食用，沒有動物蛋白的副作用，不會引起肥胖、高血脂、心腦血管等疾病，具有較高的營養(yǎng)價(jià)值，也有較高的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益[2]。目前，國內(nèi)外對雞蛋蛋白多肽的功能特性的研究報(bào)道較少。目前針對蛋黃研究產(chǎn)品僅有蛋黃油、卵黃免疫球蛋白、卵黃高磷蛋白，品種較少，還應(yīng)將蛋黃中其他的蛋白質(zhì)成分及其多肽進(jìn)行充分利用[3]。因此，本文對蛋黃蛋白多肽的功能特性進(jìn)行了研究，可為雞蛋蛋白多肽在嬰幼兒、老年人、病人等蛋白吸收機(jī)能較差人群的食品開發(fā)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備

蛋黃粉：購于北京金健力蛋粉廠；氫氧化鈉、濃鹽酸、三氯乙酸、甲醛、無水碳酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、95%乙醇、無水乙醚等試劑：購于天津市江天化工技術(shù)有限公司，皆為分析純；丙酮、硫酸：購于天津市化學(xué)試劑批發(fā)公司，分析純；福林試劑B：購于鼎瑞化工（上海）有限公司，分析純；干酪素、L-酪氨酸：購于天津市光復(fù)化工精細(xì)研究所；胃蛋白酶、胰蛋白酶：購于中國上海化學(xué)試劑有限公司。

PHS-3B型精密pH計(jì)、FA1004型電子分析天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；XMTD-204型數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋、EMS-2型加熱定時(shí)磁力攪拌器：天津市歐諾儀器儀表有限公司；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞英生化儀器廠；DGG-H-3型電熱鼓風(fēng)干燥箱 ：天津市天宇實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；UV-7054單光束紫外-可見分光光度計(jì)：上海欣茂儀器有限公司；DL-6000型低速冷凍離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；全自動凱氏定氮儀：蘇州市天威儀器有限公司。

1.2 脫脂蛋黃蛋白粉的制備

采用乙醇浸取法對蛋黃粉脫脂去油，具體操作方法[4]：稱取蛋黃粉加入錐形瓶中，加入15倍量乙醇脫脂，溫度40℃，間歇攪拌4 h，過濾，沉淀用少量溶劑洗，抽干，放入干燥箱中干燥，即得。

1.3 蛋白酶解液的制備

稱取一定量的蛋白粉，加水勻漿，濃度為5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）左右，加1 mol/L氫氧化鈉或者1 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)體系pH，加入指定重量的酶，置于一定溫度的水浴鍋中水浴中加熱一定時(shí)間后，在95℃下滅酶10 min，冷卻后，于6 000 r/min下離心15 min，取上清液即得酶解液。取酶解液，用半微量凱氏定氮法[5]測定總氮含量，用電位滴定法[6]測定氨基氮含量。

1.4 水解度的測定

蛋白質(zhì)的水解度（DH）定義為在水解過程中打開的肽鍵占蛋白質(zhì)肽鍵總數(shù)的百分比，其計(jì)算公式如下：

2 結(jié)果與討論

2.1 胃蛋白酶水解蛋白粉最適溫度的選擇

固定蛋白粉濃度為5%（g/mL，下同），酶濃度為1%，pH 為 2.0，溫度分別設(shè)為 30、38、40、45、50 ℃，反應(yīng)4 h，其水解度測定結(jié)果見圖1。

由圖1可以看出，從30℃開始隨著溫度的升高，酶水解度逐漸增大，到38℃時(shí)水解度達(dá)到最大，其水解度為16.12%。隨著溫度繼續(xù)升高，蛋白質(zhì)水解度急劇下降，到50℃達(dá)到最低。因此，可認(rèn)為胃蛋白酶的最適溫度為38℃。

2.2 胃蛋白酶水解蛋白粉最適pH的選擇

固定蛋白粉濃度為5%，酶濃度為1%，溫度為38 ℃，分別調(diào)節(jié) pH 為 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0，反應(yīng) 4 h，其水解度見圖2。

由圖2可以看出，在pH在1.0時(shí)，隨著pH的升高，水解度逐漸增大，當(dāng)pH達(dá)到2.0時(shí)，水解度達(dá)到最大值，其水解度為16.12%。隨著pH繼續(xù)增大，水解度程下降趨勢。因此，胃蛋白酶的最佳pH為2.0。

2.3 胃蛋白酶水解蛋白粉最佳底物濃度選擇

固定酶濃度為1%，溫度為38℃，pH為2.0，分別配制蛋白粉濃度為2%、3%、4%、5%、6%，反應(yīng)4 h，其水解度見圖3。

由圖3可以看出，當(dāng)?shù)孜餄舛仍?%～3%時(shí)，蛋白質(zhì)水解度隨底物濃度的增加而極具增大，當(dāng)?shù)孜餄舛仍?%～4%與5%～6%時(shí)，蛋白質(zhì)水解度隨底物濃度的增加而減小。在底物濃度為5%時(shí)，蛋白質(zhì)水解度達(dá)到最大值，其水解度為16.49%。因此，胃蛋白酶酶解的最佳底物濃度為5%。

2.4 胃蛋白酶水解蛋白粉最佳酶濃度選擇

固定蛋白粉濃度為5%，pH為2.0，溫度為38℃，酶添加量分別為 0.2%、0.5%、1.0%、2.0%，3.0%，反應(yīng)4 h，其水解度見圖4。

由圖4可以看出，隨著酶濃度的增加，蛋白質(zhì)的水解度逐漸增大。當(dāng)酶濃度增加到1.0%時(shí)，蛋白質(zhì)的水解度隨酶濃度的增加變化不大。因此，在工業(yè)化生產(chǎn)中，要綜合考慮水解度及生產(chǎn)成本之間的關(guān)系，為達(dá)到高水解度低成本，選用最適胃蛋白酶添加量為1%，其水解度可達(dá)15.90%。

2.5 胃蛋白酶水解蛋白粉最佳水解時(shí)間的選擇

固定蛋白粉濃度為5%，酶濃度為0.2%，溫度為38 ℃，pH 為 2.0，在酶解時(shí)間為 1、2、3、4、5 h 期間，分別測其水解度，結(jié)果見圖5。

由圖5可以看出，蛋白質(zhì)的水解度隨著水解時(shí)間的延長而增大。當(dāng)水解時(shí)間達(dá)到4 h時(shí)，水解度隨著水解時(shí)間的增大而變化不大。因此，確定胃蛋白酶的最佳水解時(shí)間為4 h，此時(shí)胃蛋白酶水解蛋白粉的水解度為16.77%。

2.6 胃蛋白酶水解正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)所得結(jié)果可知，溫度、底物濃度、酶濃度、酶解時(shí)間是影響水解度的主要因素，采用L9（34）的正交試驗(yàn)，找出最佳試驗(yàn)條件。正交試驗(yàn)方案及結(jié)果如表1及表2所示。

表1 因素水平表Table 1 The table of factors and levels

由表2可以看出：各因素對蛋白粉水解度影響的主次順序?yàn)锳＞B＞C＞D，即溫度對蛋白粉的水解度影響最大，其次是底物濃度、酶濃度，酶解時(shí)間。根據(jù)k值可確定最優(yōu)水平組合為A2B3C3D2，即最佳水解條件為：水解溫度為38℃，底物濃度為5%，酶濃度為2.0%，水解時(shí)間為4 h。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiments

2.7 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)以上分析，進(jìn)行如下驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表3。

表3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of the confirmatory experiment

可以看出，實(shí)驗(yàn)是穩(wěn)定可靠的。經(jīng)過驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到胃蛋白酶水解的最佳工藝條件，其條件為：水解溫度為38℃，底物濃度為5%，酶濃度為2.0%，水解時(shí)間為4h。此條件下蛋白粉的平均水解度可達(dá)15.76%。

2.8 雙酶水解蛋白粉

采用兩步水解法[7－8]。根據(jù)正交試驗(yàn)的優(yōu)化水解條件，先用胃蛋白酶在優(yōu)化條件下先將蛋白粉水解至一定程度，測定水解度。再用胰蛋白酶繼續(xù)將部分水解的蛋白粉水解至不同程度，其他酶解條件為底物濃度6%、酶濃度0.5%、溫度55℃、pH為7.5、水解4 h。以考察胃蛋白酶—胰蛋白酶雙酶水解對水解效果的影響，其結(jié)果如表4所示。

由表4可知，由胃蛋白酶—胰蛋白酶組合酶水解蛋白粉，可以取得良好的水解效果，水解度明顯高于胃蛋白酶單酶水解。

表4 雙酶水解對水解效果的影響Table 4 The comparison results of double enzyme hydrolysis and single enzyme hydrolysis

3 結(jié)論

1）胃蛋白酶水解的最佳工藝條件：稱取5 g蛋白粉，加100 mL水勻漿，加1mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH為2.0，加入2 g胃蛋白酶，38℃條件下水解4 h后，95℃下滅酶10 min，此條件下平均水解度為15.76%。

2）胃蛋白酶—胰蛋白酶組合水解最佳工藝條件：在pH為2.0，溫度為38℃，底物濃度為6%的條件下，先加入濃度為2.0%的胃蛋白酶水解4 h，而后調(diào)節(jié)pH為7.5，溫度55℃，再加入濃度為0.5%的胰蛋白酶水解4 h，此時(shí)水解度高達(dá)20.41%。因此，胃蛋白酶—胰蛋白酶組合酶水解蛋白粉的水解效果明顯優(yōu)于胃蛋白酶單酶水解。

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