響應(yīng)面法優(yōu)化桃花多糖提取工藝

耿明江，席榮英，喻傳華，李歡歡，耿海局，陳振中

（1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院化學(xué)教研室，河南新鄉(xiāng) 453003；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院分析測(cè)試實(shí)驗(yàn)室，河南新鄉(xiāng) 453003；3.新鄉(xiāng)第一中學(xué)，河南新鄉(xiāng) 453000；4.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院08級(jí)藥劑專業(yè)，河南新鄉(xiāng) 453003）

多糖是廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中的一類天然高分子化合物。近年來(lái)的研究表明許多多糖具有抗腫瘤[1-3]、抗衰老[3-4]、抗炎性[5]、降血糖[3，6-8]、降血脂[3，8]、增加免疫力[3，9-10]等多種生理功能。桃花是薔薇科落葉喬木桃（Prunus persica）的花朵，古籍記載桃花“味苦，平，無(wú)毒”[11]，具有“破石淋，利大小便”[11]等作用。

響應(yīng)面法是利用多元二次回歸方程來(lái)擬合各因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，進(jìn)而分析回歸方程得出最優(yōu)工藝參數(shù)的一種統(tǒng)計(jì)方法。Box-Behnken設(shè)計(jì)因具有因素水平少、試驗(yàn)水平少等優(yōu)點(diǎn)而成為響應(yīng)面法中常用的設(shè)計(jì)方案，已廣泛用于各類條件優(yōu)化試驗(yàn)中。本文在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法優(yōu)化桃花多糖（polysaccharide from peach blossoms，PPB）的最優(yōu)提取工藝參數(shù)，以期為桃花多糖提取及其深入研究提供實(shí)驗(yàn)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

桃花，2011年4月采集于衛(wèi)輝市唐莊鎮(zhèn)，經(jīng)手工除雜、室內(nèi)陰晾三天后粉碎，再置于2.5 kPa條件下恒溫（40℃）干燥72 h，密封避光貯藏備用。D-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，中國(guó)藥品生物制品檢定所；乙醇、石油醚、三氯乙酸等所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，使用前未做進(jìn)一步純化處理。實(shí)驗(yàn)用水均為去離子水。

1.2 主要儀器

UV2550紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：島津（日本）；R-206旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海申生科技有限公司；SBH-11循環(huán)水式真空泵：鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；DZF-1恒溫真空干燥箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；FA2104電子分析天平：上海躍平儀器有限公司；FD-1A-80真空冷凍干燥機(jī)：北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；TSH-4000離心機(jī)：天津醫(yī)療器械廠；HH-S.Z恒溫水浴鍋：鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 多糖的提取

脫脂桃花粉末→熱水提取→流水冷卻→離心→上清液→4℃醇沉過(guò)夜→離心→沉淀復(fù)溶→脫蛋白→離心→上清液濃縮→冷凍干燥→灰白色粗多糖粉末。

1.3.2 多糖提取率的計(jì)算

本文在單因素試驗(yàn)還是響應(yīng)面試驗(yàn)中原料質(zhì)量均為（4.000±0.001）g。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

影響多糖得率的因素比較多，本試驗(yàn)主要從提取溫度、提取時(shí)間、料液比等幾方面進(jìn)行單因素試驗(yàn)[2]。提取溫度選擇 50、60、70、80、90、100 ℃ 6 個(gè)水平，提取時(shí)間選取 1、2、3、4、5 h 5 個(gè)水平，料液比選取 1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30（g/mL）5 個(gè)水平分別進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3.4 響應(yīng)面分析的實(shí)驗(yàn)方案和因素水平

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，在溫度、時(shí)間和料液比3個(gè)單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)原理，以多糖提取率為響應(yīng)值采用三因素三水平的響應(yīng)分析法進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)。試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面法設(shè)計(jì)因素和水平Table 1 Factors and levels of response surface design

2 結(jié)果與分析

2.1 PPB紫外光譜測(cè)定

PPB紫外光譜測(cè)定見(jiàn)圖1。

從圖1可知，脫蛋白前PPB在278 nm波長(zhǎng)處有比較明顯的吸收峰（a線），經(jīng)三氯乙酸處理后的PPB在該波長(zhǎng)下的吸收峰消失（b線）。由此說(shuō)明經(jīng)三氯乙酸處理后PPB中已經(jīng)不含蛋白質(zhì)。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 提取溫度對(duì)多糖提取率的影響

提取溫度對(duì)多糖提取率的影響見(jiàn)圖2。

由圖 2（a）可知，在50℃～100℃的溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，PPB得率在相應(yīng)增大，但考慮到溫度較高時(shí)水分揮發(fā)比較劇烈不易操作，因此選取80℃作為合適的提取溫度。

2.2.2 提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響

由圖2（b）可知，當(dāng)提取時(shí)間控制在1 h～5 h的范圍內(nèi)時(shí)，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，PPB得率在相應(yīng)增大，只是當(dāng)提取時(shí)間超過(guò)3 h后，PPB得率增加的趨勢(shì)變得較為平緩，因此選擇3 h作為合適的提取時(shí)間。

2.2.3 料液比對(duì)多糖提取率的影響

由圖2（c）可知，料液比介于1∶10和1∶20之間時(shí)，PPB得率會(huì)隨著溶劑體積的增加而相應(yīng)增大，并且在1∶20（g/mL）時(shí)達(dá)到最大，這可能是因?yàn)樵谠摿弦罕葪l件下PPB的溶出達(dá)到了一個(gè)最大值，此后隨著溶劑體積的增加PPB得率會(huì)相應(yīng)減小，可能與隨著溶劑體積的增加在后處理過(guò)程中PPB損失較多有關(guān)。

2.3 響應(yīng)面法試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面分析方案及試驗(yàn)結(jié)果

響應(yīng)面試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2，其中實(shí)驗(yàn)序號(hào)1～12為析因?qū)嶒?yàn)，13～17為5個(gè)中心實(shí)驗(yàn)，用來(lái)估計(jì)實(shí)驗(yàn)誤差。運(yùn)用Design Expert 7.1.6軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析?；貧w分析與方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案與試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Response surface design and test results

概率P值越小則相應(yīng)變量的顯著性越高。從表3回歸模型方差分析可以看出，模型是顯著的（P=0.003 7），該模型R2=0.923 9，說(shuō)明該模型與實(shí)驗(yàn)擬合較好，可用該模型對(duì)PPB提取得率進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)，對(duì)實(shí)踐具有指導(dǎo)意義。由F檢驗(yàn)可以得到各因子的貢獻(xiàn)率為：A＞B＞C，即在所選取的各因素水平范圍內(nèi)，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響排序?yàn)椋禾崛囟龋咎崛r(shí)間＞料液比。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

2.3.2 因素間的交互影響

固定任何一個(gè)因素在其編碼值為0的水平，分析另外兩個(gè)因素交互對(duì)PPB得率的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3直觀地反映了各因素交互作用對(duì)PPB得率的影響，比較a、b、c三組圖可以得知，提取溫度因素曲線較陡峭，對(duì)PPB得率的影響最為顯著，其次是提取時(shí)間，最后是料液比。這與前面方差分析結(jié)果一致。等高線的中心點(diǎn)不在相應(yīng)坐標(biāo)范圍之內(nèi)，說(shuō)明PPB最佳提取條件不在各因素相應(yīng)編碼－1～1的范圍之內(nèi)。

2.3.3 方程求解及最佳條件

對(duì)表2進(jìn)行回歸擬合后，得回歸方程為：

對(duì)回歸方程取一階偏導(dǎo)等于0，整理得方程組：

解方程組得：A=1.37；B=1.73；C=0.17，即最佳提取條件為 93.7 ℃，時(shí)間 4.73 h，料液比為 1∶20.85（g/mL）?？紤]到實(shí)際操作的方便性，將最佳提取條件修正為：提取溫度 94 ℃、提取時(shí)間 4.7 h、料液比為 1∶21（g/mL）。

為了驗(yàn)證響應(yīng)面法的可行性，采用上述最優(yōu)提取條件進(jìn)行PPB得率驗(yàn)證試驗(yàn)，5次平行試驗(yàn)得到實(shí)際得率為11.08%，與理論預(yù)測(cè)值11.3%誤差約為1.95%，表明該優(yōu)化條件參數(shù)可靠，具有實(shí)用價(jià)值。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 驗(yàn)證性試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of verifiable experiment

3 結(jié)論

通過(guò)單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，在此基礎(chǔ)上采用Design－Expert 7.1.6軟件Box－Benhnken試驗(yàn)原理設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面分析法試驗(yàn)，確定PPB最佳提取工藝為：提取溫度 94 ℃、提取時(shí)間 4.7 h、料液比為 1∶21（g/mL），多糖得率為11.3%。

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[11](明)李時(shí)珍,撰.王育杰,整理.本草綱目(中)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2005:1424－1425