馬糞海膽生殖腺多糖的抑菌和抗氧化活性研究

王少華，張慧，郭承華，*

（1.中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東青島 266003；2.煙臺大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東煙臺 264005）

馬糞海膽（Hemicentrous pulcherrimus），屬于棘皮動物門（Echinodermata），海膽綱（Echinoidea），是中國及日本沿海的特有品種，主要分布在我國黃渤海沿岸、浙江、福建沿海以及日本。有關(guān)馬糞海膽生殖腺營養(yǎng)成分、粗多糖提取工藝等已有研究報道[1-2]，但對馬糞海膽生殖腺粗多糖的抑菌和抗氧化活性的研究未見報道。

自由基學(xué)說[3]認(rèn)為機體在生命活動過程中會不斷的產(chǎn)生氧自由基，這些自由基時刻危害著人類的健康。在正常機體中，氧自由基的數(shù)量始終處于機體自身維持的穩(wěn)定狀態(tài)，但當(dāng)機體功能出現(xiàn)異常或損壞時，這些氧自由基的數(shù)量就會大增，引起一系列疾病[4]。因此，開發(fā)抗氧化藥物已受到越來越多的關(guān)注[5]。隨著社會的發(fā)展，一些由細(xì)菌和真菌引起的疾病也越來越受到人們的重視，隨著陸地藥物的大量開采和化學(xué)藥劑所帶來的負(fù)面影響越來越大，尋找一種來源便利廣泛，且無毒副作用的新型藥物迫在眉睫。本文以黃海海域馬糞海膽生殖腺作為實驗材料，首次對其由不同提取方法得到的粗多糖進行抑菌和抗氧化活性測定，為馬糞海膽資源的開發(fā)利用提供必要的數(shù)據(jù)支持和理論參考。

1 材料、儀器及試劑

1.1 材料

實驗用材料鮮馬糞海膽：市售，2009年4月購于煙臺市芝罘區(qū)紅利海鮮市場。

1.2 主要儀器

Rotavapor R－220：瑞士 BUCHI公司；RE－52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；微弱發(fā)光儀BPCL－2－G：中國科學(xué)院生物物理研究所；精密pH計：新加坡EUTECH公司；DFZ－6020型真空干燥箱：上海博訊實業(yè)有限公司。

1.3 試劑

大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、假絲酵母菌、啤酒酵母菌、黃曲霉、黑曲霉由煙臺大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實驗室梁麗琨副教授提供。所用試劑均為分析純。

2 方法

2.1 多糖的提取

取新鮮馬糞海膽，破開外殼，取出黃色的生殖腺，剔除黑色的內(nèi)臟等其他雜質(zhì)，烘干，粉碎復(fù)溶，離心取上清，室溫條件下等體積丙酮浸泡8 h脫脂，將殘渣晾干后，70 ℃水浴，料水比為 1∶20，攪拌浸提 4 h，重復(fù)3次，合并提取液并濃縮，將殘渣用5%NaOH，料水比為1∶20，低溫浸泡4 h，重復(fù)3次，合并提取液并濃縮。將兩份提取液用Sevag法脫蛋白[6]。分別向脫蛋白后的提取液中加入乙醇，使溶液的終乙醇濃度分別為50%、70%、90%，分別收集醇沉后的沉淀，干燥，得6種粗多糖，即50%水提多糖，命名為S5，70%水提多糖，命名為S7，90%水提多糖，命名為S9；50%堿提多糖，命名為J5，70%堿提多糖，命名為J7，90%堿提多糖，命名為J9。采用苯酚－硫酸法測定多糖含量[7]。

2.2 抗氧化活性及抑菌活性的測定

對 S5、S7、S9、J5、J7、J9 的還原能力的測定采用參考文獻的鐵氰化鉀反應(yīng)體系[8]進行測定。對S5、S7、S9、J5、J7、J9的羥自由基的清除能力的測定采用參考文獻的鄰二氮菲－金屬鐵離子－過氧化氫法[9]進行。對S5、S7、S9、J5、J7、J9 的超氧離子清除能力的測定采用參考文獻的鄰苯三酚自氧化法反應(yīng)體系[10]進行。以上測定均采用 VC做為陽性對照。對 S5、S7、S9、J5、J7、J9 的抑菌活性的測定采用參考文獻的濾紙片法[11]進行。采用氯霉素（細(xì)菌）和硝酸咪唑康（真菌）做為陽性對照。

3 結(jié)果與討論

3.1 苯酚硫酸法測定多糖含量結(jié)果

苯酚－硫酸法測定多糖含量回歸方程Y=8.1723X－0.056 7（R2=0.999 2），式中：Y 為吸光度；X 為糖濃度，單位為mg/mL。硫酸苯酚法測定糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

根據(jù)回歸方程，求得 S5、S7、S9 和 J5、J7、J9 多糖濃度分別為1.98、2.09、2.92mg/mL 和1.78、2.19、2.25mg/mL。

3.2 抗氧化活性及抑菌活性測定結(jié)果

3.2.1 還原能力的測定結(jié)果

采用鐵氰化鉀法測定 S5、S7、S9、J5、J7、J9 的還原能力，實驗測得的S5、S7和S9的吸光度分別為0.17、0.32和 0.36，J5、J7和 J9的吸光度分別為 0.23、0.35和0.45，均為正值，說明 S5、S7、S9、J5、J7、J9 均具有還原能力，且其還原能力大小順序為：J9＞S9＞J7＞S7＞J5＞S5。

3.2.2 對羥基清除能力的測定結(jié)果

采用鄰二氮菲－金屬鐵離子－過氧化氫法測定S5、S7、S9、J5、J7、J9 對羥基的清除能力，結(jié)果如圖 2 所示。

由圖 2 可知，S5、S7、S9、J5、J7、J9 對羥基均具有不同程度的清除作用，在粗多糖濃度為0～4 mg/mL時，S9對羥基的清除作用最大，S5次之。其余波動較大，且相差不大。在粗多糖濃度為4 mg/mL～8 mg/mL時，S5、S7、S9、J5、J7、J9 對羥基的清除作用的大小順序為：S5＞S9＞J7＞S7＞J9＞J5。在粗多糖濃度為 10 mg/mL到實驗設(shè)置的最大多糖濃度12 mg/mL時，S5、S7、S9、J5、J7、J9 對羥基的清除作用的大小順序為：J9＞S9＞J5＞S7＞J7＞S5。

3.2.3 對超氧離子清除能力的測定結(jié)果

采用鄰苯三酚自氧化法測定 S5、S7、S9、J5、J7、J9對超氧離子的清除能力，其結(jié)果如圖3所示。

由圖 3 可知，S5、S7、S9、J5、J7、J9 對超氧離子均具有不同程度的清除作用，在粗多糖濃度為0～7 mg/mL時，J7對超氧離子的清除作用最大，S9次之，J9第三。其余波動較大，且相差不大。在粗多糖濃度為7 mg/mL～8 mg/mL 時，S5、S7、S9、J5、J7、J9 對羥基的清除作用的大小順序為：S9＞J7＞J9＞S7＞J5＞S5。在粗多糖濃度為8 mg/mL～9 mg/mL 時，S5、S7、S9、J5、J7、J9 對羥基的清除作用的大小順序為：S9＞J9＞J7＞S7＞J5＞S5。在粗多糖濃度為10.5 mg/mL到實驗設(shè)置的最大多糖濃度12 mg/mL時，其對羥基的清除作用的大小順序為：J9＞S9＞S7＞J5＞J7＞S5。

3.2.4 抑菌活性的測定結(jié)果

采用濾紙片法對6種多糖提取液進行了抑菌活性的測定，結(jié)果如表1所示。

由表1可知，6種多糖提取液對細(xì)菌和真菌均有不同程度的抑菌作用。對金黃色葡萄球菌來說，J9的抑菌活性最強，依次為 S9、J7、S7、J5、S5 的抑菌活性最小，大腸桿菌亦然；而對黃曲霉、黑曲霉、啤酒酵母菌和假絲酵母菌的作用結(jié)果均顯示，J9的抑菌活性最強，其次為 J7，在其次分別為 S9、S7、J5，S5 的抑菌活性最小。

4 結(jié)論

通過上述實驗結(jié)果可知，馬糞海膽生殖腺的粗多糖提取物具有抗氧化還原活性和抑菌活性。無論是在抗氧化還原方面，還是抑菌方面，J9的活性都是最大的，其次S9和J7表現(xiàn)也都很突出，這為以后更深層次的研究馬糞海膽生殖腺粗多糖的抗氧化和抑菌機理和進一步更好的發(fā)展海膽資源提供了基礎(chǔ)的理論數(shù)據(jù)。

表1 不同多糖的抑菌效果對比Table 1 The comparison of the bacteriostasis resuits by different polysaccharides cm

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