用于大容量人源天然噬菌體抗體庫的表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

潘 博 付文卓 王曉娜 張寶中 米志強(qiáng) 安小平 劉大斌李 存 姜煥煥 陳 斌 童貽剛*

(1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病所國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100071;2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院國家海綿狀腦病實(shí)驗(yàn)室，北京100193;3.首都醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)與測試中心，北京100069)

噬菌體抗體庫技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用為抗體技術(shù)領(lǐng)域帶來了巨大的變化，已被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等各個(gè)研究領(lǐng)域，通過基因工程和噬菌體展示技術(shù)的結(jié)合，能得到人源化的針對(duì)幾乎所有抗原表位的抗體，這極大地推動(dòng)了各種性能優(yōu)良抗體及多功能抗體融合蛋白的開發(fā)和應(yīng)用［1-3］。噬菌體抗體庫模擬了天然抗體庫，使得人們可以不經(jīng)過復(fù)雜的免疫過程，而是直接利用抗原就可以從抗體庫中篩選出特異性抗體成為可能。它既解決了人源性單克隆抗體的來源困難、人體雜交瘤系統(tǒng)的低效及鼠單抗的動(dòng)物源性等難題，也使得單克隆抗體的制備變得簡單易行，穩(wěn)定有效，使人單克隆抗體的制備有了突破。但是，此技術(shù)目前還有許多問題尚待解決，如在保證抗體庫的多樣性和呈現(xiàn)效率的同時(shí)，如何提高有效庫容量、如何在構(gòu)建抗體庫時(shí)提高抗體基因的連接效率問題上，還有待進(jìn)一步解決。為了克服這些問題，本研究擬在本室多年抗體工程研究的基礎(chǔ)上，構(gòu)建含自殺基因的新型、高效抗體庫表達(dá)載體pDF-D-SacB。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒

噬菌體VCSM13、BSl365菌、表達(dá)載體pDF由海軍總醫(yī)院周麗君教授饋贈(zèng);Puc19-SacB質(zhì)粒由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院疾病預(yù)防控制所黃留玉研究員饋贈(zèng);帶有抗乙肝病毒表面抗原人Fab段基因的質(zhì)粒B4HFLF由本室保存。

1.2 主要試劑

Phusion，BssH Ⅱ，Xba Ⅰ，Nco Ⅰ，NheⅠ，BglⅡ，堿性磷酸酶，由美國New England Biolabs(NEB)公司生產(chǎn);EcoR Ⅰ，DraⅠ，T4 DNA Ligase，T4 Plolynucleotide Kinnase(PNK)由日本TaKaRa中國大連分公司生產(chǎn);EasyPure Plasmid MiniPrep Kit，EasyPure Quick Gel Extraction Kit由中國北京全式金生物有限公司提供;5000 DNA Marker，DL2 000 DNA Marker由中國北京博邁德科技有限公司生產(chǎn)。

1.3 引物設(shè)計(jì)及合成

為了提高輕鏈抗體基因連接效率，設(shè)計(jì)了2條引物來改造原始噬菌粒載體pDF上用以連接輕鏈抗體基因的酶切位點(diǎn)BssHⅡ，其新的酶切位點(diǎn)為BglⅡ，同時(shí)設(shè)計(jì)用于克隆SacB自殺基因的引物序列來構(gòu)建抗體庫載體，具體引物序列詳見表1，以及用于克隆抗乙肝表面抗原抗體的引物序列，具體引物詳見表2，所有引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 引物序列Tab.1 Primers

表2 引物序列Tab.2 Primers

1.4 表達(dá)載體pDF-D-SacB的構(gòu)建

1.4.1 驗(yàn)證SacB的自殺功能

從平板上挑取攜帶有pUC19-SacB質(zhì)粒的單克隆至3 mL含有氨卞抗性液體LB培養(yǎng)基中，在37℃搖床中220 r/min振搖10 h至對(duì)數(shù)生長期;取上述菌液200 μL分別加入到預(yù)先準(zhǔn)備好5 mL含有氨卞抗性液體LB培養(yǎng)基和含有氨卞抗性及5%蔗糖液體LB培養(yǎng)基2支試管中，在37℃搖床上220 r/min振搖5 h，將2支試管的菌液分別從10-1稀釋至10-9，各取每個(gè)稀釋梯度的菌液5 μL，加入到預(yù)先準(zhǔn)備的含有氨卞抗性固體LB培養(yǎng)基平板上相應(yīng)的格子中，放入37℃溫箱中，次日觀察結(jié)果。

1.4.2 構(gòu)建質(zhì)粒pDF-D-SacB

以Puc19-SacB為模板，pDF-BssH和pDF-R-Xba為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得輕鏈區(qū)域SacB基因并純化回收，用BssHⅡ和XbaⅠ進(jìn)行酶切，與同樣經(jīng)電泳分離、純化、酶切的PSGX載體用T4 DNA連接酶16℃連接，連接物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌，鋪盤挑取單集落，提取質(zhì)粒DNA，以HindⅢ內(nèi)切酶鑒定陽性克隆PSBX;再用BssHⅡ50℃酶切質(zhì)粒PSBX 3.5 h后，加入1 μL CIP，溫度降至37℃酶切1 h后進(jìn)行回收。將引物DDTB-F和DDTB-R 各取 2 μL，加 H2O 到總體積為 20 μL，放入PCR儀中由98℃ ～20℃進(jìn)行退火，取出17 μL與10×T4 DNA Ligase Buffer 2 μL 混合，再加入1 μL T4 Plolynucleotide Kinnase，37℃反應(yīng)30 min，而后70℃反應(yīng)10 min，將兩者進(jìn)行常規(guī)連接、轉(zhuǎn)化、挑克隆后，用BglⅡ與EcoRⅤ鑒定，獲得陽性克隆PSGX;再以Puc19-SacB為模板，引物pDF-Nco和pDF-R-Nhe進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得重鏈區(qū)域SacB基因并純化回收，用NheⅠ和NcoⅠ進(jìn)行酶切，與同樣經(jīng)電泳分離、純化、酶切的PSGX載體用T4 DNA連接酶16℃連接，常規(guī)轉(zhuǎn)化、鋪盤、挑取單集落，提取質(zhì)粒后用EcoRⅠ對(duì)重組子進(jìn)行酶切鑒定，獲得噬菌粒載體pDF-D-SacB。

1.5 構(gòu)建重組質(zhì)粒pDF-SacB-HBsL和pDFSacB-HBsH

以質(zhì)粒B4HFLF為模板，用表1、表2中的兩組引物PCR分別擴(kuò)增抗乙肝表面抗原抗體的κ鏈、Fd段基因，反應(yīng)條件為:95℃熱啟動(dòng)2 min;95℃變性20s，65℃退火20s，72℃延伸l 5s，35個(gè)循環(huán)后72℃延伸5 min。將輕鏈和重鏈PCR產(chǎn)物用凝膠電泳分離、純化后分別用BglⅡ、XbaⅠ和NcoⅠ、NheⅠ雙酶切4 h，與同樣經(jīng)電泳分離、純化、酶切的pDF-D-SacB載體用T4 DNA連接酶16℃連接16 h，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌Trans1-Blue而后鋪板，分別用該4種酶進(jìn)行酶切鑒定;挑取含有適當(dāng)表達(dá)載體的單集落Trans1-Blue菌，接種到含100 μg/mL氨芐青霉素和10 g/L葡萄糖的LB培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)過液，取30 μL過夜菌接種到3 mL含100 μg/mL氨芐青霉素的SB培養(yǎng)液，37℃震蕩培養(yǎng)至A600約為0.5，加入20 μL輔助噬菌體VCSM13。30℃震蕩培養(yǎng)過夜，次日離心收集上清，取10 μL適當(dāng)稀釋的上清樣品，與100 μL對(duì)數(shù)增長期的 Trans1-Blue菌混合，室溫孵育30 min，鋪含Amp的LB盤，37℃培養(yǎng)過夜，次日計(jì)數(shù)，估算滴度。

1.6 抗體基因的細(xì)胞內(nèi)重組

挑取單集落BSl365菌，在含有50 μg/mL卡那霉素和10g/L葡萄糖的2YT培養(yǎng)基中生長至對(duì)數(shù)生長期(A600=0.5)。通過滴度測定，將上述兩種噬菌體上清以相同的滴度混合，以20個(gè)噬菌體顆?！?個(gè)細(xì)胞的比例感染BS1365菌，37℃溫育60 min，加入Amp補(bǔ)至100 μg/mL，30℃振搖過夜。次日取過夜培養(yǎng)菌加入到3 mL含Amp的2TY培養(yǎng)液中，37 ℃培養(yǎng)至 A600=0.5，加入20 μL VCSM13，37 ℃震蕩培養(yǎng)過夜。次日離心回收上清，測定噬菌體滴度，將噬菌體感染對(duì)數(shù)生長期的大腸桿菌Trans1-Blue，鋪含Amp的培養(yǎng)盤，37℃ 培養(yǎng)過夜，次日挑取單個(gè)集落，擴(kuò)增培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，通過內(nèi)切酶譜進(jìn)行分析鑒定。

1.7 用酶聯(lián)免疫吸附劑測定方法檢測噬菌體

將乙肝表面抗原以pH9.8的碳酸鹽緩沖液稀釋至 7.62 μg/mL，以 50 μL/孔包被 ELISA 板，4 ℃ 過夜，次日棄去孔內(nèi)液體，以12%的脫脂牛奶100 μL 37℃封閉2 h后，PBST洗滌5次，加入待測噬菌體抗體樣本及對(duì)照，37℃孵育2 h后，再以PBST洗滌5次，加入3∶1 000稀釋的HRP-羊抗M13(Pharmacia)，37℃孵育2 h，最后PBST洗滌5次后加OPD底物顯色，讀取A450值。

2 結(jié)果

2.1 驗(yàn)證SacB基因的自殺活性

在含有Amp抗性液體LB培養(yǎng)基中生長的大腸桿菌，在10-1～10-5均有克隆，且10-1～10-3稀釋倍數(shù)克隆無法計(jì)數(shù)，在10-4有86個(gè)單克隆，在10-5有11個(gè)單克隆;而在含有Amp抗性及5%蔗糖液體LB培養(yǎng)基中生長的大腸桿菌10-1～10-5均無克隆。表明大腸桿菌在是否含蔗糖的培養(yǎng)基環(huán)境里，生長相差5個(gè)數(shù)量級(jí)，說明PUC19-SacB質(zhì)粒帶有自殺功能，詳見圖1和圖2。

圖2 帶有PUC19-SacB質(zhì)粒的大腸桿菌在Amp平板上的生長的情況Fig.2 The growth condition of E.coli with PUC19-SacB plasmid on Amp plate

2.2 新型噬菌體抗體表達(dá)載體pDF-D-SacB的構(gòu)建

首先構(gòu)建PSBX質(zhì)粒，隨后又改變其酶切位點(diǎn)構(gòu)建了PSGX質(zhì)粒，最后用本室發(fā)明的回收方法［4］對(duì)SacB基因進(jìn)行回收，得到了SacB基因后(圖3)，以內(nèi)切酶NcoⅠ和NheⅠ分別對(duì)PSGX和SacB基因進(jìn)行酶切，隨后進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化并隨機(jī)挑取10個(gè)單克隆提取質(zhì)粒，利用內(nèi)切酶EcoRⅠ進(jìn)行鑒定(圖4)。

圖3 PCR擴(kuò)增SacB基因純化回收Fig.3 PCR products of SacB gene and purification

圖4 EcoRⅠ酶切鑒定1%凝膠電泳圖Fig.4 1%agarose gel electrophoretic profile of digestion of clone with EcoR I

2.3 pDF-D-SacB細(xì)胞內(nèi)重組

為了鑒定pDF-D-SacB能否在表達(dá)Cre蛋白酶的細(xì)菌內(nèi)發(fā)生loxp和loxp511介導(dǎo)的重組，分別構(gòu)建了僅含抗HBsAg的輕鏈和重鏈的質(zhì)粒pDF-SacBHBsL和pDF-SacB-HBsH，并用DraⅠ酶切鑒定(圖5、圖6)，分別制備含有2者的 phagemid-噬菌體上清，等量混合后，以20個(gè)病毒顆粒∶1個(gè)細(xì)胞感染可表達(dá)Cre蛋白酶的細(xì)菌BS1365，使多副本載體進(jìn)入同一個(gè)細(xì)胞，載體之間發(fā)生重組，獲取重組后的質(zhì)粒，進(jìn)行內(nèi)切酶譜分析。這2種載體經(jīng)Cre-Loxp介導(dǎo)的重組后，應(yīng)產(chǎn)生4種不同載體，除2種親本載體外，還有同時(shí)含有輕重鏈的pDF-HBsH-L和無抗體基因的pDF-D-SacB。一共進(jìn)行了9次重組實(shí)驗(yàn)，鑒定了180個(gè)克隆，所獲4種載體的比例大體符合隨機(jī)重組的規(guī)律。

圖5 DraⅠ酶切鑒定1%凝膠電泳圖Fig.5 1%agarose gel electrophoretic profile of digestion of clone with Dra Ⅰ

圖6 DraⅠ酶切鑒定1%凝膠電泳圖Fig.6 1%agarose gel electrophoretic profile of digestion of clone withDraⅠ

2.4 pDF-D-SacB載體表達(dá)活性的鑒定

為了鑒定新構(gòu)建的pDF-D-SacB載體是否能表達(dá)功能性的噬菌體抗體，利用經(jīng)重組后得到的質(zhì)粒pDF-HBsH-L，用其表達(dá)噬菌體抗體，并以未插入任何基因的原始質(zhì)粒pDF載體所表達(dá)的噬菌體蛋白作為陰性對(duì)照，ELISA檢測其與HBsAg的結(jié)合活性，讀取各孔450 nm處的吸光值，結(jié)果詳見表3。pDFHBsH-L所表達(dá)的蛋白經(jīng)10倍稀釋后測得的每組數(shù)值之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，即隨著蛋白濃度的下降A(chǔ)450值也呈現(xiàn)遞減下降，說明抗原與樣品之間的結(jié)合是特異性的;而陰性對(duì)照pDF所表達(dá)的蛋白經(jīng)10倍稀釋后測得的每組數(shù)值之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即隨著蛋白濃度的下降A(chǔ)450值未呈遞減下降，呈現(xiàn)無規(guī)律性，且 3，4，5，6，7 組 A450 值均低于0.1，說明抗原與樣品之間的結(jié)合是非特異性的。

表3 2種樣品濃度10倍遞減稀釋Tab.3 Two kinds of sample concentration decreasing diluted 10 times (±s)

表3 2種樣品濃度10倍遞減稀釋Tab.3 Two kinds of sample concentration decreasing diluted 10 times (±s)

The results presented as mean±standard deviation，means in the same row with completely different capital letters are significantly different(P＜0.01)，with the small letters are significantly difference(P＜0.05).

Item Diluted 10 times 1 2 3 4 5 6 7 pDF 0.167±0.0036dD 0.133±0.0036cC 0.071±0.0072abAB 0.083±0.0111bB pDF-HBsH-L 0.610±0.0100gG 0.061±0.0035aA 0.387±0.0030fF 0.293±0.0072eE 0.068±0.0061abAB 0.068±0.0080abAB 0.273±0.0046dD 0.212±0.0061cC 0.154±0.0078bB 0.127±0.0053aA

2.5 大容量噬菌體抗體庫表達(dá)載體pDF-D-SacB的鑒定

本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建pDF-D-SacB噬粒載體后，將抗乙肝表面抗原的抗體輕、重鏈基因分別克隆于該載體構(gòu)建兩個(gè)初級(jí)質(zhì)粒，而后經(jīng)重組得到噬粒載體pDF-HBsHL，再將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，以噬菌體VCSM13進(jìn)行拯救，得到含有抗乙肝表面抗原的Fab段噬菌體抗體。我們利用該抗體與乙肝表面抗原作結(jié)合活性分析，并用未插入任何基因的原始噬粒pDF所表達(dá)的蛋白作為陰性對(duì)照，分別進(jìn)行10倍的遞減稀釋作ELISA檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，包被的乙肝抗原量不變，將抗乙肝表面抗原抗體輕、重鏈基因插入到噬粒載體pDF-DSacB中，其pDF-HBsH-L噬粒表達(dá)的噬菌體蛋白與乙肝表面抗原的結(jié)合能力，要遠(yuǎn)高于未插入任何基因時(shí)原始噬粒pDF所表達(dá)的噬菌體蛋白與乙肝表面抗原的結(jié)合能力(在每一對(duì)比組中，陽性都遠(yuǎn)高于陰性)，且隨著特異性pDF-HBsH-L噬菌體抗體濃度的降低A450值均會(huì)下降，該值的下降程度大致呈現(xiàn)有規(guī)律的遞減一次函數(shù);而未插入任何基因的原始噬粒pDF所表達(dá)的蛋白與乙肝表面抗原的A450值則基本趨于0.1以下。理論上，由于pDF所表達(dá)的蛋白不與乙肝表面抗原相結(jié)合，遞減稀釋pDF所表達(dá)的蛋白與乙肝表面抗原結(jié)合能力應(yīng)保持在同一數(shù)值;但實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，在陰性對(duì)照pDF中，第7組A450值要略高于對(duì)比組3、4、5和6(對(duì)比組A450值也呈現(xiàn)一定的遞減趨勢)，而低于對(duì)比組1和2，其原因可能是由于在噬菌體純化物中存在大腸桿菌殘?bào)w，而菌體中可能含有內(nèi)源性HRP，使得對(duì)照組出現(xiàn)較低程度的非特異性著色，當(dāng)倍比稀釋至102，其非特異性著色降至顯色劑本底著色OD值0.1以下。

3 討論

抗體工程領(lǐng)域中最突出的研究進(jìn)展就是噬菌體抗體庫技術(shù)，該技術(shù)的出現(xiàn)開創(chuàng)了一條簡便、快捷的基因工程抗體生產(chǎn)路線［5］。本課題組在國內(nèi)外噬菌體抗體庫技術(shù)進(jìn)展的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了一個(gè)適用于大容量噬菌體抗體庫的表達(dá)載體pDF-D-SacB，它具有以下特點(diǎn):

3.1 在抗體庫載體輕、重鏈區(qū)域插入自殺基因

枯草芽孢桿菌中的果聚糖蔗糖轉(zhuǎn)移酶催化以蔗糖為底物合成果聚糖的反應(yīng)，其SacB基因編碼的蛋白為分泌型的蔗糖果聚糖酶，此酶能催化蔗糖，水解產(chǎn)生葡萄糖和果聚糖［6］。盡管枯草芽孢桿菌SacB基因?qū)е略S多革蘭陰性菌和革蘭陽性菌死亡的原理尚不清楚，但基因SacB已經(jīng)被用于克隆研究，而且也獲得了SacB基因轉(zhuǎn)化的煙草、番茄、楊樹［7］?；谶@種特性，SacB基因賦予細(xì)胞的蔗糖敏感特性作為一種陰性篩選克隆的標(biāo)記，在生物研究中特別是在基因克隆等遺傳操作中有著廣泛的應(yīng)用［8］。Fab抗體庫的質(zhì)量很大程度上取決于抗體基因的插入效率，而在大多數(shù)情況下，抗體基因的插入效率并不很高，這樣就會(huì)產(chǎn)生很多的無效克隆，而輕鏈或重鏈中的任何一個(gè)位置沒有抗體基因插入都會(huì)導(dǎo)致克隆的無效，這樣就會(huì)大大增加無效克隆的比例。為了克服這一問題，本研究組擬在本室多年抗體工程研究的基礎(chǔ)上，采用可誘導(dǎo)的自殺基因和以國內(nèi)自主構(gòu)建且普遍使用的基于pDAN5［9］的抗體庫表達(dá)載體pDF為骨架，構(gòu)建新型、高效的pDF-D-SacB表達(dá)載體。在抗體輕鏈和重鏈的克隆位點(diǎn)分別引入SacB自殺基因，以此作為反向篩選基因，當(dāng)抗體基因插入自殺載體后，自殺基因便失去功能;而沒有插入抗體基因的自殺載體，表達(dá)自殺基因的革蘭陰性菌，在含有蔗糖的培養(yǎng)基中生長時(shí)，會(huì)將蔗糖分解為對(duì)細(xì)菌有毒的產(chǎn)物，從而殺死表達(dá)自殺蛋白的細(xì)菌。因此，SacB作為反篩基因常與抗性基因等正向篩選基因聯(lián)合，用于構(gòu)建細(xì)菌的無痕缺失突變株。用這種方法構(gòu)建的抗體庫，不僅容量大，而且質(zhì)量更高，理論上可以得到近于100%的有效克隆，以避免無效克隆的產(chǎn)生。

3.2 選擇了更合理的抗體基因克隆位點(diǎn)

隨著抗體胚系可變區(qū)基因序列的闡明，本課題組目前廣泛應(yīng)用于噬菌體抗體庫中的表達(dá)載體內(nèi)切酶位點(diǎn)的選擇并不合理，因此本課題組在pDF-D-SacB中選用了抗體胚系可變區(qū)基因中不存在的內(nèi)切酶位點(diǎn)，以保證內(nèi)切酶序列不會(huì)影響到成熟抗體分子氨基端的序列。除此之外，PCR產(chǎn)物及噬菌粒載體兩端酶切位點(diǎn)的酶解效率直接影響到抗體基因的連接效率，進(jìn)而影響整個(gè)抗體庫的質(zhì)量。在原噬菌粒載體pDF上用于連接輕鏈抗體基因的酶切位點(diǎn)BssHⅡ和XbaⅠ，酶切溫度分別是50℃和37℃，所用Buffer的離子濃度也相差甚遠(yuǎn)，在構(gòu)建噬菌體抗體庫的試驗(yàn)過程中顯示，酶切噬菌粒載體和抗體基因時(shí)，難以控制酶切的時(shí)間及酶的用量，且酶切不完全，連接效率低下，若要保證抗體庫的容量和多樣性，則必須進(jìn)行多次酶切、連接和轉(zhuǎn)化，致使工作量大大地增加。為了能夠解決這一問題，通過借鑒本室對(duì)于酶切位點(diǎn)改造的研究［10］以及大量的實(shí)驗(yàn)摸索，用上述方法將酶切位點(diǎn)BssHⅡ改為BglⅡ，從而極大地提高了抗體基因的連接效率，減少了工作量。

綜上所述，pDF-D-SacB在構(gòu)建后經(jīng)檢測，具有正常的噬菌體抗體表達(dá)功能，能夠在分泌Cre細(xì)菌中發(fā)生Cre-LoxP介導(dǎo)的同源重組，為大容量噬菌體抗體庫的構(gòu)建提供了有效工具;本實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)能夠支持對(duì)表達(dá)載體pDF-D-SacB用于構(gòu)建大容量噬菌體抗體庫的定性分析，其定量分析還有待進(jìn)一步研究。

［1］Kim S H，Hwang S Y，Lee Y S，et al.Single-chain antibody fragment specific for Plasmodium vivax Duffy binding protein［J］.Clin Vaccine Immunol，2007:726-731.

［2］杜東霞，吳劍，李小曼，等.噬菌體抗體庫淘篩方法的比較研究［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2009，9(4):730-732.

［3］潘博，童貽剛.噬菌體抗體庫技術(shù)及其應(yīng)用研究進(jìn)展［J］.生物技術(shù)通訊，2010，21(4):581-585.

［4］朱曉峰，安小平，陳錦輝，等.一種簡便、高效、經(jīng)濟(jì)的從凝膠中回收DNA的方法［J］.生物技術(shù)通訊，2006，17(4):603-604.

［5］Griffiths A D，Duncan A R.Strategies for selection of antibodies by phage display［J］.Curr Opin Biotechnol，1998，9(1):102-108.

［6］Irani V R，Lee S H，Eckstein T M，et al.Utilization of a ts-sacB selection system for the generation of a Mycobacteriu-m avium serovar-8 specific glycopeptidolipid allelic exchange mutant［J］.Ann Clin Microbiol Anti-microb，2004，3:18.

［7］Quénée L，Lamotte D，Polack B.Combined sacB-based negative selection and cre-lox antibiotic marker recycling for efficient gene deletion in pseudomonas aeruginosa［J］.Biotechniques，2005，38(1):63-67.

［8］Mizoguchi H K，Tanaka-Masuda K，Mori H.A simple method for multiple modification of the Escherichia coli K-12 chromosome［J］.Biosci Biotechnol Biochem，2007，71(12):2905-2911.

［9］Sblattero D，Bradbury A.Exploiting recombination in single bacteria to make large phage antibody libraries［J］.Nat Biotechnol，2000，18(1):75-80.

［10］Zhang B Z，Zhang X，An X P，et al.An easy-to-vse sitedirected mutagenesis method with a designed restric-tion site for convenient and reliable mutant screening［J］.J Zhejiang Univ Sci B，2009，10(6):479-482.