芬太尼對蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣的影響

劉玉明，馬建榮

(中南大學湘雅醫(yī)院神經外科，湖南長沙410007)

芬太尼對蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣的影響

劉玉明，馬建榮

(中南大學湘雅醫(yī)院神經外科，湖南長沙410007)

目的研究芬太尼(Fentanyl)對蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣的影響及其作用機制。方法選用健康成年家兔72只，隨機分成假手術對照組(A組)、SAH組(B組)、芬太尼靜脈干預組(C組)、芬太尼肌注干預組(D組)。每天進行神經生物學評分，并在實驗24 h、72 h、7 d后處死，取基底動脈進行H-E染色，觀察管壁情況，同時取左側海馬分別行HE染色及免疫組化染色，觀測神經元密度、Bcl-2及Bax的表達。結果SAH后Bcl-2、Bax表達均增加，芬太尼干預后Bcl-2表達升高，Bax表達下降。B組的神經生物學評分、神經元密度、Bcl-2及Bax的表達與C、D組差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。結論芬太尼可抑制CVS后細胞凋亡，可能通過促進SAH家兔Bcl-2的表達而抑制Bax表達。

腦血管痙攣；芬太尼；家兔；腦保護；Bax；Bcl-2

腦血管痙攣(CVS)作為蛛網(wǎng)膜下腔出血(Subarachnoid hemorrhage，SAH)后的常見并發(fā)癥以及致殘、致死的重要原因，已經得到多家研究證實[1]，其發(fā)生率達30%～90%，常導致十分嚴重的腦組織缺血缺氧或者遲發(fā)性的缺血性腦損害，甚至出現(xiàn)腦梗死。目前盡管對SAH后CVS的機理進行了廣泛的研究，但其發(fā)病機制仍未完全闡明。既往研究表明，阿片受體激動劑能夠減輕組織的缺血再灌注損傷[2]，本實驗的目的在于通過建立SAH模型，觀察實驗中家兔基底動脈管壁變化和腦組織切片中神經元存活數(shù)及Bax、Bcl-2表達強度的變化情況，從而研究芬太尼對于SAH后CVS的腦組織有無保護作用以及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 動物及分組選取健康的成年家兔72只(湘雅醫(yī)學院動物學部提供)，性別不限，兔齡3～4個月，體重1.5～2.5 kg。隨機分成4組，每組18只，每組都依次按照設計的三個時間點(24 h、72 h、7 d)隨機再分為3個亞組，故共含12個亞組。A組為對照的假手術組，B組為SAH組，C組為芬太尼靜脈干預組，D組為芬太尼肌注干預組。

1.2 藥品及試劑芬太尼(湖北宜昌人福藥業(yè)，每支0.1 mg)，SA1022型SABC型免疫組化試劑盒，多聚體抗兔IgG-HRP(SV0002-12)，DAB顯色試劑盒(AR1022)，Bcl-2多抗，Bax多抗(均為武漢博士德公司)。

1.3 制作實驗動物模型、藥物干預及標本處理采用枕大池二次注血法+一側頸內動脈結扎法[3]，手術中采用10%水合氯醛(200 mg/kg)經耳緣靜脈注射行全身麻醉。先行結扎右側頸內動脈：將家兔仰臥，束縛四肢及兔牙，固定于實驗臺四角，頸部中部及右側備皮，75%酒精消毒，加用1%利多卡因行局部麻醉，選頸部正中偏右側切口，長約5 cm，找到右側頸總動脈，遠、近端穿線，遠心端先結扎。用22 G頭皮針朝向近心端插入頸內動脈，抽取動脈血(約2 ml)備用，結扎近心端，關閉切口，消毒。快速將家兔改俯臥為，再次固定，行枕大池注血操作：項背部備皮、消毒、局麻同前，切口取枕外粗隆至第二頸椎的枕下正中部位，長約3 cm，顯露至寰枕筋膜，采用自制穿刺針小心穿刺，進針深度為超過筋膜約1 mm，緩慢回抽，抽出腦脊液約1.5 ml，再緩慢注入上述采取的自體動脈血1 ml，雙擊電凝電凝穿刺部位防止腦脊液漏。止血，抗生素(無菌生理鹽水稀釋的慶大霉素)沖洗，縫合，消毒。讓家兔保持頭低腳高位30 min，以保證基底池有注入的血。48 h后行枕大池第二次注血，操作基本同前。假手術組僅做兩次同樣的手術切口來顯露右側頸總動脈和寰枕筋膜，并行兩次結扎右側頸總動脈的手術操作。

1.4 方法枸櫞酸芬太尼注射液用法：C組按0.05 mg·kg-1·次-1用生理鹽水稀釋10倍后緩慢耳緣靜脈注射；D組按0.05 mg·kg-1·次-1稀釋一倍后行大腿肌肉注射，均為2次/d，中間間隔1 h。根據(jù)實驗設計分別再飼養(yǎng)24 h、72 h、7 d后處死并采集標本。先行灌注再斷頭取腦，灌注前予10%水合氯醛(200 mg/kg)耳緣靜脈注射麻醉。將家兔仰臥位固定于實驗臺上，開胸，于膈肌上用止血鉗夾閉胸主動脈及下腔靜脈，再經心尖行左心室插管。插管成功后剪開右心耳，先用300 ml生理鹽水加壓(灌注液體液平面與試驗臺的垂直距離＞70 cm)沖洗至沖洗液變淡紅色或澄清，再用4%多聚甲醛溶液灌注，直至流出液體變清或家兔雙上肢抽搐后僵硬，迅速斷頭取腦。在視交叉后方1.4 cm及2.0 cm處垂直于基底動脈，切開腦干獲取帶基底動脈的腦組織冠狀切片，同時沿著縱裂剖開標本大腦，分離獲取左側海馬組織。兩種組織標本進行常規(guī)操作，獲取病理切片，再進行H-E染色及Bcl-2、Bax免疫組化。

1.5 數(shù)據(jù)、圖片采集

1.5.1 家兔神經生物學評分方法于家兔處死前，每組實驗動物每天進行一次神經生物學評分，內容包含攝食及神經功能障礙的有無及障礙程度，詳細的評分標準如下：(1)攝食評分：食量100%，1分；50%～99%，2分；＜50%，3分；0%，4分。(2)神經功能障礙分級(4級)：正常，1級；輕度或可疑障礙(嗜睡、活動減少)，2級；中度障礙不伴運動異常(肢體無力)，3級；重度障礙伴運動異常(劃圈運動或行走困難)；4級。

1.5.2 基底動脈的HE切片觀察采用雙盲法，使用光學顯微鏡將圖像放大100倍，觀測基底動脈血管形態(tài)，并進行圖像采集。

1.5.3 左側海馬的神經元切片觀察采取雙盲法，應用400倍的光學顯微鏡，在顯微鏡下選取500μm長度海馬CA1區(qū)，計數(shù)此范圍內正常的神經元細胞數(shù)量，從而獲得神經元密度(個/mm)(該區(qū)的正常神經元數(shù)與該區(qū)長度的比值)。共求得8個數(shù)據(jù)，求出平均值，即為這個實驗標本的觀測指標，作為評價缺血程度的指標。

1.5.4 觀察免疫組化結果采取標本及切片都嚴格根據(jù)免疫組化試劑使用說明書來操作。正常情況下Bcl-2、Bax表達和染色程度的關系呈正相關。具體檢測方法：400倍鏡下，在基底動脈的內皮細胞處或者海馬部位CAI區(qū)隨機取8個視野，采用Motic Images Advanced 3.0圖像分析軟件，得出Bcl-2和Bax陽性細胞光密度值，兩個指標分別取其平均光密度值作為陽性細胞的表達強度值。

1.6 統(tǒng)計學處理應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件來進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析處理。計量資料：采用均數(shù)±標準差()，多組間比較采用單因素方差分析，并進行組間資料的多重比較。數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布、方差齊者，用LSD檢驗方法；而數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布、方差不齊者，用Tamhane檢驗方法。計數(shù)資料：采納完全隨機設計的多樣本比較的秩和檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。相關的圖表制作采用Office Word 2003辦公軟件。

2 結果

2.1 神經生物學評分結果及分析具體結果見表1、表2及圖1、圖2，可見SAH后出現(xiàn)飲食量減少及神經功能障礙的家兔數(shù)量均隨時間的變化有一個漸進性增多，復又減少的過程。

表1 家兔在各時間點攝食評分中的分布情況(只)

表2 家兔在各時間點神經功能評級中的分布情況(只)

圖1 家兔在各時間點進食評分中的分布情況(只)

圖2 家兔在各時間點神經功能評級中的分布情況(只)

2.2 HE染色結果

2.2.1 各實驗組的基底動脈在鏡下的表現(xiàn)A組：基底動脈管壁表現(xiàn)為平滑、無增厚，各內皮細胞的結構較完整，內層的彈力膜清晰可見，結構亦完整；中膜的平滑肌層較薄，環(huán)繞在血管腔周圍；外膜主要包含成纖維細胞以及其周邊的疏松結締組織；在血管外膜和蛛網(wǎng)膜之間僅僅散在分布有少量細胞。B組：血管管徑縮小，內皮細胞變性、腫脹，染色質不均，出現(xiàn)空泡，內層彈力板迂曲甚至斷裂，厚薄不均；平滑肌層明顯增厚，平滑肌細胞出現(xiàn)增生、結構紊亂；血管外膜與蛛網(wǎng)膜之間可見到多數(shù)炎性細胞(如淋巴細胞、單核細胞以及中性粒細胞等)浸潤。C、D兩組血管表現(xiàn)為不太規(guī)則的輕度收縮，管腔直徑輕度減小，管壁無明顯增厚，內層彈力板無明顯皺褶，內皮細胞略有腫脹，在血管外膜與蛛網(wǎng)膜之間可在少部分見到浸潤的炎性細胞。

2.2.2 腦組織CA1區(qū)鏡下表現(xiàn)A組：神經元細胞呈圓形或者近似圓形，大小較均一，排列整齊有序，胞漿為淡淡紅色，細胞核為藍黑色，核大而圓，核仁清晰，染色質均勻分布，偶爾可見細胞凋亡。B組：有大量錐體細胞凋亡，體積縮小，細胞結構模糊不清，導致神經元數(shù)量明顯減少，殘存的神經元可見噬神經細胞現(xiàn)象。C組和D組亦見細胞凋亡表現(xiàn)，但在同時間點時要較B組為輕，細胞排列較B組整齊。說明芬太尼能對SAH后的血管痙攣和繼發(fā)的缺血損傷起到保護作用，見圖3。

圖3 兔海馬CA1區(qū)神經元形態(tài)(HE染色×400)

2.2.3 神經元密度在統(tǒng)計學比較上，假手術A組與手術三組B、C、D組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，給藥組C組和D組與未給藥組B組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，給藥干預組中，C組與D組兩組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，各個實驗組結果的具體數(shù)據(jù)參見表3。

表3 神經元密度()

表3 神經元密度()

A組B組C組D組6 6 6 6 190.82±6.49 106.27±7.09 136.53±6.32 138.42±9.36 189.02±8.19 92.50±7.96 116.35±11.64 114.25±14.87 191.62±7.8 79.15±5.69 96.03±9.78 98.57±9.84

2.3 免疫組化染色觀察結果

2.3.1 bcl-2染色結果的陽性表達Bcl-2陽性細胞在鏡下主要表現(xiàn)為胞質彌漫性染色且較均勻，胞質呈棕黃色。海馬區(qū)神經元細胞中bcl-2陽性細胞的表達：A組內表達得很少，組內比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；B、C、D組海馬CA1區(qū)bcl-2表達均有升高，但升高程度不同，與B組相比，C、D組陽性細胞數(shù)多且較強；三組bcl-2陽性細胞數(shù)在72 h時均較24 h及7 d時低，但具體最低谷在何時難以反映；C、D組在各個時間點bcl-2陽性細胞均比B組多(P＜0.05)；而C、D組兩組之間進行比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見圖4、表4。

圖4 兔海馬CA1區(qū)Bcl-2免疫組化(DAB顯色×400)

表4 家兔海馬CA1區(qū)bcl-2陽性細胞表達強度均值()

表4 家兔海馬CA1區(qū)bcl-2陽性細胞表達強度均值()

A組B組C組D組10.86±2.5 22.95±11.14 32.27±6.58 27.85±8.26 11.14±2.18 16.85±6.72 28.14±5.77 23.96±7.68 10.65±2.62 23.98±9.12 30.34±11.18 24.45±6.12

以上結果顯示：單純的進行腦組織外操作而產生的切口損傷對于腦組織內bcl-2的表達沒有明顯的影響，而蛛網(wǎng)膜下腔出血可以增加腦組織中bcl-2的表達，而加用的藥物芬太尼同樣促使SAH后腦組織內bcl-2的表達升高

2.3.2 bax染色結果的陽性表達以及對結果的分析類似Bcl-2染色的陽性細胞，、Bax陽性細胞在鏡下也主要表現(xiàn)為胞質彌漫性染色且較均勻，胞質顏色為棕黃色。計數(shù)方法同Bcl-2陽性細胞計數(shù)。從結果上看，對照組A組，在海馬神經元中，bax陽性細胞表達有限，組內比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；手術組B、C、D組bax在24 h時海馬CA1區(qū)的表達即很明顯，72 h最高，明顯高于對照組假手術A組，A組與B、C、D組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；B組同C、D組相比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，說明C、D組各時間點海馬bax陽性細胞數(shù)與B組有差別，見圖5、表5。

圖5 兔海馬CA1區(qū)Bax免疫組化(DAB顯色×400)：

表5 家兔海馬CA1區(qū)bax陽性細胞表達強度均值()

表5 家兔海馬CA1區(qū)bax陽性細胞表達強度均值()

A組B組C組D組11.04±2.63 40.32±2.2 27.54±5.11 31.08±8.27 11.09±3.03 60.91±10.04 24.38±5.98 29.96±3.35 11.09±2.89 29.48±2.78 22.15±4.75 25.95±2.84

以上結果表明：(1)單純的腦外切口損傷對腦神經細胞中的Bax的表達影響不大；(2)腦組織中Bax可在SAH后表達增加；(3)Fen干預可使SAH后神經細胞中Bax的表達下降。

3 討論

蛛網(wǎng)膜下腔出血后的CVS是多種因素作用的結果，目前具體的機制尚不完全明確。最初人們認為芬太尼只有鎮(zhèn)痛作用，后來研究表明，芬太尼能夠在組織的缺血再灌注損傷中抑制細胞的凋亡反應，機制可能如下：(1)通過激動阿片受體。Zhang等[4]在心肌缺血再灌注損傷實驗中，通過給大鼠輸注芬太尼類似物雷米芬太尼作為預處理，減輕了心肌缺血再灌注損傷，他們認為其是通過共同的信號傳導通路，來抑制Ca2+通道的開放，減輕細胞內鈣離子超載，從而使μ、δ、κ 3種阿片受體來實現(xiàn)細胞保護作用。Yamanouchi等[5]研究認為，在δ受體被激動后，可以減少枯否細胞釋放活性氧或者使細胞對活性氧產生耐受，從而使細胞獲得膜穩(wěn)定能力，減輕損傷。Zhang等[6]在心肌實驗中證明，雷米芬太尼能夠激活PKC(蛋白激酶)和mitoKATP通道，從而保護心??；在缺血再灌注損傷中，mitoKATP通道的開放能夠降低細胞凋亡。(2)通過非阿片受體依賴性途徑：芬太尼能夠抑制電壓敏感性鈣離子通道，從而產生非內皮細胞依賴性血管舒張作用；又可通過刺激血管內皮細胞，引起一氧化氮和前列環(huán)素釋放從而舒張血管。而且這些作用均與阿片受體無關[7]。(3)芬太尼能夠抑制脂多糖誘導的人外周血TNF-α的表達，作用機制可能為嗎啡和芬太尼抑制了核轉錄因子NF-κB所致[7]。本實驗通過檢測腦組織神經元密度，發(fā)現(xiàn)芬太尼干預組的神經元存活數(shù)要明顯高于SAH組，說明芬太尼在蛛網(wǎng)膜下腔出血時可以減輕神經細胞的死亡，通過觀察基底動脈管壁的變化可以發(fā)現(xiàn)芬太尼干預組較SAH組有所改善，說明芬太尼對緩解SAH后出現(xiàn)的CVS有一定的作用。

細胞凋亡是指生物體內細胞在特定的內源或外源信號誘導下，其死亡途徑被激活，并在有關基因的調控下發(fā)生的程序性死亡過程。凋亡的發(fā)生發(fā)展過程由多種調節(jié)基因參與完成，這些基因的相互作用決定著細胞凋亡的進程。其中尤以一些腫瘤前體基因和原癌基因表現(xiàn)顯著，如p53、Myc、Bcl-2家族中Bcl-2和Bax等。在這個進程當中，作為凋亡細胞內在的并且是重要的一個始動因素為半胱氨酸蛋白酶類Caspases[8]，而且Bcl-2以及Bax等多個基因可以通過參與到此Caspases途徑，起到間接地影響疾患發(fā)生時細胞出現(xiàn)的凋亡[9]。在進行Bcl-2克隆時，逐漸發(fā)現(xiàn)了Bcl-2家族的其他成員。根據(jù)其作用的不同，Bcl-2家族被分類為促生存家族(Pro-survial family)與促凋亡家族(Pro-apoptotic family)。除Bcl-2外，促生存的成員尚包括Bcl-xL、Bcl-w等，而Bax和Bak則是促凋亡的成員。研究發(fā)現(xiàn)，當腦組織受損時，Bcl-2可抑制神經細胞凋亡。其表達的增加，使即使在外界因素刺激后，細胞亦不啟動凋亡程序，但對非凋亡性死亡無保護作用[10]。而當Bax缺乏時，海馬區(qū)受損的細胞少[10]，Bax的高表達導致線粒體內的細胞色素C大量釋放，從而激活Caspases-3和Caspases-9，進而誘導出現(xiàn)凋亡[10]；Bcl-2可與Bax結合產生二聚體，從而使Bax失去活性，形成保護，Bax與Bcl-2呈對抗關系。所以凋亡的出現(xiàn)不但由凋亡抑制基因的表達程度決定，而且也因為促凋亡成員的表達程度而受到影響，最后取決于它們的相對數(shù)量，也就是相對比值(BCL-2/Bax)可能是決定細胞生死的關鍵。本實驗表明，F(xiàn)en促進了家兔SAH后CVS時Bcl-2蛋白的表達，抑制了Bax的表達，從而使Bcl-2/Bax比率升高，細胞凋亡受到抑制從而產生腦保護作用。

因此，F(xiàn)en其抗凋亡作用的部分機制可能是通過影響B(tài)cl-2、Bax蛋白表達，從而產生腦保護作用。另外可能還有其他途徑，尚需進一步研究。

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Effect of Fentanyl on cerebral vasospasm after subarachnoid hemorrhage.

LIU Yu-ming,MA Jian-rong. Department of Neurosurgery,Xiangya Hospital of Central South University,Changsha 410007,Hunan,CHINA

ObjectiveTo study the effect of Fentanyl on cerebral vasospasm after subarachnoid hemorrhage and its mechanism.MethodsSeventy-two healthy adult rabbits were randomly divided into four groups:the control group(group A),SAH group(group B),SAH with fentanyl intravenous(group C)and SAH with fentanyl intramuscular(group D).The rabbits underwent neurobiology score every day.The basar artery was stained by HE,and hippocampus undrewent HE staining and Bcl-2Bax immunohistochemical staining,then the neuron density as well as the expression of Bax and Bcl-2 were detected.ResultsAfter SAH,the expression of Bcl-2 and Bax increased.After intervention with fentanyl,the expression Bcl-2 was increased,while the expression of Bax decreased.,The neurological function score,neuron density and Bax and Bcl-2 expression in group B showed statistically significant differences with those in group C and group D(P＜0.05).ConclusionFentanyl can inhibit neuron apoptosis possibly through enhancing Bcl-2 expression and inhibiting Bax expression.

Cerebral vasospasm;Fentanyl;Rabbit;Brain protection;Bax;Bcl-2

R743

A

1003—6350(2012)09—027—05

10.3969/j.issn.1003-6350.2012.09.010

2012-01-05)

劉玉明(1977—)，男，湖南省長沙市人，主治醫(yī)師，在讀研究生。