飼喂高濃度創(chuàng)傷弧菌對小鼠消化道的損傷研究

鄭晶，翁陽，王明華

(海南醫(yī)學院病理教研室海南醫(yī)學院附屬醫(yī)院，海南?？?71101)

飼喂高濃度創(chuàng)傷弧菌對小鼠消化道的損傷研究

鄭晶，翁陽，王明華

(海南醫(yī)學院病理教研室海南醫(yī)學院附屬醫(yī)院，海南?？?71101)

目的探討高濃度創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus，Vv)經(jīng)食道感染小鼠的致病特點。方法22只昆明小鼠，實驗組16只，均強制性喂食Vv菌液(4.2×1012cfu/ml)0.6 ml/只；對照組6只，喂食滅菌液體培養(yǎng)基(Marine broth 2216)0.6 ml/只。觀察小鼠一般情況，分別于實驗后12 h及48 h采血并處死8只實驗組小鼠和3只對照組小鼠，進行血液的Vv分離培養(yǎng)并取其消化道及重要臟器組織進行病理學觀察。結(jié)果48 h組8只小鼠，有4只血培養(yǎng)結(jié)果為陽性；Vv經(jīng)食道感染小鼠后導致其出現(xiàn)腹瀉等消化道癥狀，病理學結(jié)果顯示實驗組小鼠食道及胃黏膜上皮部分缺損，小腸絨毛明顯水腫，結(jié)腸腸壁平滑肌溶解斷裂，消化道黏膜、黏膜下、肌層均可見不同程度的中性粒細胞浸潤；小鼠主要臟器也出現(xiàn)不同程度的損傷，以肺和腎臟的廣泛出血性損傷為主。結(jié)論(1)高濃度Vv經(jīng)食道進入小鼠胃組織后能部分存活，并進入腸道繁殖，從而引起小鼠腹瀉癥狀，損傷小鼠消化道組織，并可入血引發(fā)敗血癥，導致小鼠肺、腎等多臟器的和損傷，造成小鼠死亡。（2）Vv可經(jīng)消化道感染，所致炎癥性病變特點為蜂窩織性炎。

創(chuàng)傷弧菌；胃腸道；感染；蜂窩織炎

創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus，Vv)作為一種機會性致病弧菌，雖然自然存在于墨西哥灣、大西洋、太平洋海岸海水和海生物中，但其被人們所認識的時間并不長，曾被稱為嗜鹽弧菌、嗜鹽性非霍亂弧菌、乳糖陽性弧菌、海水弧菌等[1-2]。直到1979年，F(xiàn)armer[3]根據(jù)本菌的基本生化及形態(tài)特征認為本菌應屬嗜鹽弧菌群，并正式將其命名為Vv。很多臨床病例已經(jīng)證明，進食受Vv污染的食物造成Vv感染后可引起嚴重的食物中毒癥狀，主要表現(xiàn)為原發(fā)性敗血癥進而出現(xiàn)多臟器功能衰竭，這也是導致患者死亡的主要原因[4-6]。而由Vv單獨引起急性胃腸炎的病例卻少有有報道[7-8]。那么，經(jīng)消化道感染的細菌如何引起敗血癥呢？要闡明這一問題，首先要揭示Vv對胃腸道本身的損傷作用如何。為此，我們在建立Vv食源性感染的動物模型基礎上進行了相關實驗性研究。

1 材料與方法

1.1 菌株來源購于中國科學院微生物研究所菌種保藏管理中心，菌株編號ATCC 27562。購回后進行冷凍干燥菌種的恢復培養(yǎng)，培養(yǎng)基為Marine broth 2216，30℃恒溫培養(yǎng)24 h后應用于實驗。并用標準平板計數(shù)法測得菌液濃度為4.2×1012cfu/ml。

1.2 動物及分組SPF級6～8周齡昆明小鼠22只(雌雄各半)，由海南醫(yī)學院實驗動物中心提供。實驗組16只，對照組6只。實驗組及對照組又各隨機分成兩組，分別為12 h組和48 h組，實驗小鼠每組8只，對照小鼠每組3只。實驗組及對照組小鼠實驗前均禁食12 h。

1.3 實驗方法1 ml注射器裝好已滅菌的小鼠灌胃針頭，強制飼喂小鼠。每只實驗組小鼠被喂食1 ml的Vv懸液。同樣的方法給每只對照組小鼠飼喂1 ml滅菌的Marine broth 2216液體培養(yǎng)基。飼喂后密切觀察小鼠一般情況，包括毛發(fā)、精神狀態(tài)、進食量和排便量及大便性狀。喂食后12 h，分別無菌剪斷實驗12 h組8只小鼠及對照12 h組3只小鼠鼠尾，擠血一滴于滅菌的Marine broth 2216液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)24 h，陽性者轉(zhuǎn)種Marine agar 2216固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)后挑取單個菌落進行生化特性鑒定。采血后用斷椎法處死小鼠并解剖，取出消化道及主要臟器組織固定于10%中性福爾馬林固定液中，常規(guī)方法制成HE切片進行病理學觀察。喂食后48 h，實驗及對照48 h組小鼠處理方法同12 h組。

2 結(jié)果

2.1 一般情況實驗組小鼠在喂食Vv懸液后均先后不同程度的出現(xiàn)了豎毛、少動及進食量減少的情況。在喂食10 h后，實驗組小鼠開始出現(xiàn)排便次數(shù)增加及排稀便癥狀。12 h實驗組小鼠無死亡，48 h實驗組小鼠有3只死亡。對照組小鼠無明顯異常。

2.2 病理學觀察實驗組16小鼠均出現(xiàn)了消化道不同程度的損傷，表現(xiàn)為：食道及胃黏膜上皮部分缺損，小腸絨毛水腫，消化道黏膜、黏膜下、肌層均可見不同程度的中性粒細胞浸潤及血管擴張充血(圖1～圖4)；48 h組實驗小鼠小腸絨毛水腫更為明顯，并出現(xiàn)結(jié)腸腸壁平滑肌溶解斷裂。實驗組小鼠主要臟器也出現(xiàn)不同程度的損傷，死亡小鼠臟器損傷更為明顯，尤其以肺和腎臟的廣泛出血性損傷為主。

圖1 食道黏膜下層中性粒細胞浸潤

圖2 胃肌層中性粒細胞浸潤

圖3 小腸黏膜中性粒細胞浸潤

圖4 結(jié)腸黏膜中性粒細胞浸潤

2.3 分離培養(yǎng)果實驗12 h組8只小鼠血培養(yǎng)結(jié)果均為陰性。實驗組48 h組小鼠死亡3只，未進行血培養(yǎng)。5只死亡小鼠中有3只血培養(yǎng)結(jié)果為陽性。

3 討論

創(chuàng)傷弧菌的感染途徑有兩種：一是經(jīng)消化道感染。生的或未熟透的貝甲類海產(chǎn)品(尤其是牡蠣)是導致創(chuàng)傷弧菌食源性感染的主要傳播媒介，表現(xiàn)為原發(fā)性創(chuàng)傷弧菌性敗血癥；二是通過皮膚傷口侵入，皮膚破損處接觸了含有Vv的海水后在原皮膚傷口處形成紅斑并劇烈疼痛，發(fā)展迅速，繼發(fā)敗血癥。Chang等[9]總結(jié)了18例Vv感染的臨床資料，其中14例為食源性的原發(fā)性敗血癥，4例為創(chuàng)傷感染。Klontz等[10]對62例創(chuàng)傷弧菌感染患者的流行病學資料進行了研究，發(fā)現(xiàn)92%的原發(fā)性敗血癥患者和71%的感染創(chuàng)傷弧菌的患者均在1周內(nèi)有生吃過海鮮。1993年4月至1996年5月間，美國洛杉磯縣共報告了16例Vv食源性感染病例，其中12例(75%)患有肝病，所有患者都發(fā)展成敗血癥，并且在發(fā)病前1～2 d都吃過生牡蠣[11]。因此，經(jīng)消化道感染是臨床Vv感染性疾病的常見原因。并且食源性創(chuàng)傷弧菌感染引發(fā)的嚴重后果并不在于其引起的非特異性胃腸炎，而在于其引起的原發(fā)性創(chuàng)傷弧菌性敗血癥，一旦出現(xiàn)敗血癥，其危害極大，往往會導致患者死亡。那么，經(jīng)消化道感染的細菌如何入血并引起敗血癥呢？要闡明這一問題，首先要揭示Vv對胃腸道本身的損傷作用如何。筆者前期實驗結(jié)果表明一定數(shù)量的Vv經(jīng)食道感染小鼠后未引起相應的消化道癥狀，對胃黏膜造成的損傷也表現(xiàn)為一過性和局限性[12]。Vv為嗜鹽性海生弧菌，最適合其生長的鹽度為3%～6%，并適合在堿性環(huán)境中生長。因此，進入小鼠胃環(huán)境的Vv實際上大部分已喪失其正常的生物學活性。在本實驗中，我們將一次性飼喂小鼠的Vv懸液濃度大大提高，由4.7×107cfu/ml提高至4.2×1012cfu/ml，結(jié)果導致實驗組小鼠出現(xiàn)了消化道癥狀及相應的消化道損傷。這一結(jié)果表明，較多數(shù)量的Vv進入胃組織后，部分細菌能夠在胃酸環(huán)境下存活并進入腸道繁殖引起相應病變。本實驗中Vv感染引起的消化道損傷包括：食道及胃黏膜上皮部分缺損，小腸絨毛水腫，平滑肌斷裂溶解。已有研究表明，Vv產(chǎn)生的一系列胞外酶及毒素是其重要的毒力因素，例如金屬蛋白酶、細胞毒素及卵磷脂酶，它們分別與溶解膠原蛋白、細胞溶解及細胞線粒體膜的溶解密切相關[13-16]。Vv在局部繁殖釋放上述毒素及酶可能導致了小鼠消化道的相應損傷。有關Vv感染所引起胃腸炎癥反應特點的研究國內(nèi)外目前還鮮有報道。本實驗結(jié)果中值得注意的是Vv感染所引起的炎癥反應特點：蜂窩織性炎，表現(xiàn)為消化道黏膜、黏膜下、肌層均可見不同程度的中性粒細胞浸潤，即中性粒細胞的彌漫浸潤。胃腸道組織結(jié)構(gòu)較為疏松，而蜂窩織性炎就好發(fā)于結(jié)構(gòu)疏松的臟器和組織中。另外本研究中實驗組小鼠主要臟器也出現(xiàn)不同程度的損傷，死亡小鼠臟器損傷更為明顯，且部分實驗小鼠Vv血培養(yǎng)結(jié)果為陽性。這說明菌體能迅速通過受損的腸黏膜侵入血液，導致原發(fā)性Vv性敗血癥，并引起部分實驗小鼠的死亡，這一結(jié)果亦與筆者前期的相關研究結(jié)果相同[17]。

[1]Roland FP.Leg gangrene and endotoxin shock due to Vibrio parahaemolyticus-an infection acquired in New England coastal waters[J]. N Engl J Med 1970,282:1306.

[2]Hollis DG,Weaver RE,Baker CN,et al.Halophilic Vibrio species isolated from blood cultures[J].J Clin Microbiol,1976,3:425.

[3]Farmer JJ III.Vibrio vulnificus.The bacterium associated with sepsis,Septicaemia,and the sea[J].Lancet,1979,2:902.

[4]馬驄,郭建巍,郝秀紅,等.中國海域分離的Vv的致病性及其對抗生素的敏感性研究[J].第四軍醫(yī)大學學報(J Fourth Mil Med Univ),2009,30(6):493-496.

[5]Bisharat N,Agmon V,Finkelstein R,et al.Clinical,epide miological,and microbiological features of Vibrio vulnificus biogroups 3 causing outbreaks of wound infection and bacteraemia in Israel.Israel Vibrio Study Group[J].Lancet,1999,354(9188):1421-1424.

[6]Michael A,Horseman,Salim Surani.A comprehensive review of Vibrio vulnificus:an important cause of severe sepsis and skin and soft-tissue infection[J].International Journal of Infectious Diseases,2011,15(3):157-166.

[7]施云程,葉啟明,董慶元.上海地區(qū)兒童弧菌性腸炎50例[J].世界華人消化雜志,1998,6:334-335.

[8]鄭靜.霍亂樣Vv感染一例[J].中華傳染病雜志,1995,13(2):97.

[9]Chang JJ,Sheen IS,Peng SM,et al.Vibrio vulnificus infection-report of 8 cases and review of cases[J].Changgeng Yi Xue Za Zhi,1994, 17(4):339-346.

[10]Klontz KC,Lieb B,Schreiber M,et al.Syndromes of Vibrio vulnificus infection-clinical and epide miologic features in Florida cases, 1981～1987[J].Ann Intern Med,1988,109:318-323.

[11]Moscola L.Vibrio vulnificus infections associated with eating raw oysters_Los angeles[J].MMWR,1996,45(29):621-622.

[12]鄭晶,申洪,陳清.Vv經(jīng)食管感染小鼠的致病性研究.世界華人消化雜志[J].2005,13(7):860-863.

[13]Miyoshi SI,Narukawa H,Tomochika K,et al.Action of Vibrio vulinificus metalloprotease on human plasma proteinase-proteinase inhibitor sysyems:a comparative study of native protease with its derivative modified by polyethylene glycol[J].Microbiol Immuol, 1995,9:959-966.

[14]Young Ran Kim,Bang Ul Kim,Soo Young Kim,et al.Outer membrane vesicles of Vibrio vulnifi cus deliver hemolysinin-hemolysin VvhA into epithelial cells to induce cytotoxicity[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,2010,399(4):607-612.

[15]Takashige Kashimoto,Shunji Ueno,Takeshi Koga,et al.The aromatic ring of phenylalanine 334 Is essential for oligomerization of Vibrio vulnificus Hemolysin[J].J Bacteriol,2010,192(2):568-574.

[16]Kashimoto T,Ueno S,Ehara H,et al.Oligomerization is essential for apoptotic activity of Vibrio vulnificus hemolysin[J].J Vet Med Sci,2009,71(10):1403-1406.

[17]鄭晶,申洪,陳清.海水環(huán)境Vv感染的病理學研究[J].中華創(chuàng)傷雜志,2007,23(11):74-78.

Pathogenicity of infections with Vibrio vulnificus in mice through the enteron.

ZHENG Jing,WENG Yang,WANG Ming-hua.Department of Pathology,Hainan Medical College,Haikou 571101,Hainan,CHINA

ObjectiveTo study the characteristics of infections through the alimentary canal with Vibrio vulnificus(Vv)in mice.Methods Twenty-two KM mice(SPF)were randomly divided into two groups,the study group (n=16)and the control group(n=6).The animal model of Vibrio vulnificus infections through the alimentary canal was established by feeding Vv inoculum(4.2×1012cfu/ml,strain 1.175 8)of 0.6 ml to each mouse in the study group.And the mouse in the control group was fed with sterile culture medium(Marine broth 2216).Eight mice in the study group and three mice in the control group were killed 12 h and 48 h after treatment.The Vv from the blood were cultured,and the pathological changes of the alimentary canal and other organs were observed under microscope.ResultsOf the eight mice killed 48 h after treatment,four showed positive blood cultures.In the study group,The gastric and esophagus mucosa was damnified with degeneration and necrosis of the epidermic cells.The edema of small intestinal villous was also observed.The neutrophil infiltration was observed in each layer of digestive tract.And different degrees of injury were also observed in the main viscera of the mice in study group,which is the most severe in lung and kidney. The pathological changes of lung and kidney were characterized by hemorrhagia,degeneration and necrosis of the cells.ConclusionThe injury of digestive tract could be induced by Vv in high concentration.Vv reproduction in digestive tract leads to primary septicemia,resulting in the death of the mice finally.Vv infection in digestive tract was characterized by Phlegmonous inflammation.

Vibrio vulnificus;Gastrointestinal tract;Infection;Phlegmonous inflammation

R-332

A

1003—6350(2012)09—024—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2012.09.009

2012-02-28)

海南省自然科學基金(編號：309036)

鄭晶(1979—)，女，湖北省黃岡市人，講師，博士。