晚期肺癌患者胸水及外周血中T細(xì)胞受體(TCR)Vβ亞家族表達的對比研究

郭寧寧，陳敬生，區(qū)裕升，肖蘭鳳*

(1.惠州市第三人民醫(yī)院腫瘤科，廣東惠州516001；2.廣東藥學(xué)院，廣東廣州510006)

晚期肺癌患者胸水及外周血中T細(xì)胞受體(TCR)Vβ亞家族表達的對比研究

郭寧寧1，陳敬生2，區(qū)裕升2，肖蘭鳳2*

(1.惠州市第三人民醫(yī)院腫瘤科，廣東惠州516001；2.廣東藥學(xué)院，廣東廣州510006)

目的探討晚期肺癌患者(Ⅲ～Ⅳ期)胸水及外周血中T細(xì)胞受體Vβ亞家族的表達，比較二者的異同。方法收集2010年7月至2012年5月共89例臨床診斷為肺癌晚期的患者胸水及外周血標(biāo)本，采用流式細(xì)胞儀方法測定其T細(xì)胞受體Vβ亞家族的表達情況，統(tǒng)計分析胸水及外周血中Vβ亞家族表達的異同。結(jié)果89例晚期肺癌外周血和胸水均主要高表達Vβ3和Vβ9，分別為Vβ3(16/89)、Vβ9(18/89)和Vβ3(20/89)、Vβ9(15/89)；患者胸水與外周血Vβ亞家族存在差異，部分差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，部分差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，其中胸水中Vβ3的高表達相對于患者外周血和健康人差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論晚期肺癌患者胸水及外周血中Vβ亞家族的表達不全相同；晚期肺癌胸水中的高表達Vβ亞家族少于外周血，其中Vβ3在胸水中可能有特異性。此研究為晚期肺癌的生物治療及T細(xì)胞過繼免疫療法在臨床中的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

晚期肺癌；TCR Vβ基因；外周血；胸水；T細(xì)胞

近年來，肺癌在全世界的發(fā)病率仍是居高不下。目前，對于晚期肺癌的研究已進入了分子及基因水平，其中T細(xì)胞在晚期腫瘤免疫中的研究備受關(guān)注?；谝酝鶎細(xì)胞整體功能研究的基礎(chǔ)上，本研究進一步對T細(xì)胞表面蛋白分子即T細(xì)胞受體(TCR)的Vβ區(qū)基因表達進行探討，研究其T細(xì)胞TCR 24個Vβ亞家族在肺癌患者中發(fā)生的變化，為臨床肺癌的基因治療及T細(xì)胞免疫療法在臨床中的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本89例肺癌胸水及外周血標(biāo)本由惠州市第三人民醫(yī)院及廣東藥學(xué)院附屬第一醫(yī)院呼吸科及腫瘤科提供。其所有標(biāo)本均取自臨床確診為肺癌(Ⅲ～Ⅳ期)并伴有不同程度腹水的晚期肺癌患者，年齡30～70歲，基礎(chǔ)狀態(tài)評估差異無統(tǒng)計學(xué)意義。健康供者血由廣州市血液中心提供。

1.2 試劑IOTest?Beta Mark TCR Vβ Repertoire Kit(德國Beckman公司)；CD3-PC5熒光標(biāo)記抗體(聯(lián)科公司)；胰蛋白酶(美國Sigma公司產(chǎn)品)；RRMI-1640培養(yǎng)基粉末(美國Gibco公司)。

1.3 儀器EPICS-XL型流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter產(chǎn)品)；Hera cell 150型CO2培養(yǎng)箱(德國Teraeus公司)；Primo R多用途臺式高速離心機(德國Thermo公司)。

1.4 方法

1.4.1 晚期肺癌患者T細(xì)胞分離及培養(yǎng)采用Ficoll密度梯度離心法[1]，24 h后收集T細(xì)胞進行流式細(xì)胞儀檢測。

1.4.2 流式檢測T細(xì)胞的Vβ亞家族表達設(shè)健康人外周血T細(xì)胞為對照組，不加任何抗體標(biāo)記；設(shè)腫瘤患者血液和胸水T細(xì)胞為實驗組。參考IOTest?Beta Mark TCR Vβ Repertoire Kit說明書的方法，健康人對照組及患者標(biāo)本實驗組加鼠抗人CD3-PC5熒光標(biāo)記抗體，且患者標(biāo)本組依次加入試劑盒中的A～H抗體；選擇CD3-PC5陽性細(xì)胞分群設(shè)門，應(yīng)用流式細(xì)胞儀(FCM)FACS Aria進行熒光檢測分析。用Cell Quest軟件參照健康值分析流式結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件和Prism統(tǒng)計軟件采用ANOVA方法對各組數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料的組間比較采用t檢驗，計算各組中的頻率并采用Hardy-Weinberg平衡檢驗。

2 結(jié)果

2.1 健康人及晚期肺癌患者胸水及外周血中T細(xì)胞TCR Vβ亞家族的表達健康人24個亞家族均有表達，而晚期肺癌患者外周血和胸水分別平均表達為11.7(11.7±4.6，Range：5～18)和6.6(6.6±2.9，Range：1～11)個Vβ亞家族；而全部患者標(biāo)本均未檢測到Vβ2、Vβ4、Vβ11、Vβ13.6、Vβ17、Vβ20和Vβ22，見表1。

2.2 晚期肺癌患者外周血及胸水T細(xì)胞的TCR Vβ亞家族的高表達肺癌患者Vβ 24個亞家族中，外周血和胸水均主要高表達Vβ3和Vβ9，分別為Vβ3 (16/89)、Vβ9(18/89)和Vβ3(20/89)、Vβ9(15/89)；Vβ 13.2(9/89)在外周血中高表達，胸水中未表達；Vβ7.2、Vβ21.3在胸水和外周血中表達相近，分別為4.49%、5.61%和8.98%、7.87%；Vβ5.3、Vβ23分散在個別患者中高表達，見表2。

表1 健康人及晚期肺癌患者T細(xì)胞TCR Vβ亞家族的表達情況

表2 89例晚期肺癌患者高表達Vβ亞家族統(tǒng)計[例(%)]

在整體水平上，晚期肺癌患者Vβ亞家族表達存在增高、減少或缺失的現(xiàn)象；患者選擇性的表達某些Vβ亞家族，有明顯的傾向性；患者外周血和胸水的Vβ 24個亞家族表達分布格局不盡相同；患者外周血和胸水中有共同高表達的亞家族，且胸水比外周血表達的Vβ亞家族少。患者胸水與外周血Vβ亞家族存在差異，部分有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，部分無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，其中胸水中Vβ3的高表達相對于患者外周血和健康人差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

3 討論

TCR在識別癌細(xì)胞的過程中發(fā)揮重要作用。張建波等[2]研究表明在疾病中，T細(xì)胞受到不同抗原刺激后，其TCR V區(qū)β鏈基因可發(fā)生重排，出現(xiàn)部分Vβ亞家族對該抗原特異性識別，并使帶有這類Vβ基因的T細(xì)胞得到優(yōu)勢擴增。在腫瘤疾病中，Vβ區(qū)基因在接受不同腫瘤抗原刺激的同時，發(fā)揮各自不同的功能，表達出不同的Vβ亞家族優(yōu)勢表達。目前國內(nèi)外研究最多的是白血病，如張玉平等[3]及Li等[4]發(fā)現(xiàn)急性早幼粒細(xì)胞白血病(APL)及急性白血病(AML-M5b)患者外周血表達部分Vβ亞家族，慢性淋巴白血病(CML)中Vβ3、Vβ13、Vβ21等優(yōu)勢表達；林晨等人發(fā)現(xiàn)經(jīng)PML-RARe多肽(是一種融合蛋白，急性早幼粒細(xì)胞白血病特異的分子標(biāo)志)誘導(dǎo)后，T細(xì)胞限制性表達8個Vβ亞家族[5]。而健康人機體內(nèi)T細(xì)胞的TCR Vβ 24個亞家族均有表達。

本課題研究了89例晚期肺癌患者外周血及胸水T細(xì)胞的TCR Vβ 24個亞家族，均發(fā)現(xiàn)了Vβ亞家族高表達的現(xiàn)象，以Vβ3、Vβ9為著。周昕熙等[6]及吳一龍等[7]對小細(xì)胞肺癌做了少量的研究發(fā)現(xiàn)在非小細(xì)胞肺癌中患者僅存在1～5個Vβ亞家族，主要為Vβ3，Vβ7?；颊叩倪@種Vβ亞家族優(yōu)勢表達可能與肺癌細(xì)胞相關(guān)抗原的刺激有關(guān)。T細(xì)胞受到來自腫瘤抗原的刺激后，選擇性的使用一個或幾個Vβ亞家族，最終導(dǎo)致Vβ亞家族部分高表達。如楊力建等[8]及Li等[9]發(fā)現(xiàn)在急性早幼粒細(xì)胞白血病(AML-M5)患者中僅存在1～10個Vβ亞家族T細(xì)胞，且Vβ2對白血病細(xì)胞(M5)相關(guān)抗原有特異性免疫反應(yīng)[8-9]。本研究晚期肺癌患者外周血及胸水Vβ亞家族不完全表達，其中Vβ3、Vβ9可能在晚期肺癌患者免疫調(diào)節(jié)和殺傷腫瘤方面發(fā)揮重要作用，尤其Vβ3可能在胸水中有一定的特異性。Vβ5.3及Vβ23等在個別患者突出高表達，這可能與接受肺癌細(xì)胞抗原刺激的程度、肺癌的分型、分期及轉(zhuǎn)移等因素有關(guān)。如張月琴等人認(rèn)為TCR Vβ24個亞家族取用格局差異與鼻咽癌(NPC)的TNM分期及腫瘤臨床分期存在相關(guān)性[10]。

結(jié)合國內(nèi)外對Vβ亞家族的研究結(jié)果，我們同時也發(fā)現(xiàn)了不同腫瘤之間有相同的Vβ亞家族高表達，例如肺癌和白血病同時高表達Vβ3和Vβ5等[6，11]。提示不同的腫瘤之間可能存在相同的腫瘤抗原刺激基因，從而使不同腫瘤患者表現(xiàn)出相同的Vβ基因高表達。

研究晚期肺癌的Vβ亞家族特異性的變化，為肺癌基因治療的臨床研究奠定一定的基礎(chǔ)。目前，對于Vβ亞家族的特異性及其與腫瘤的類別、分型、分期、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)等因素的關(guān)系還沒有明確的報道，有待于進一步探討。

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[9]Li YQ,Yang LJ,Chen SH,et.al.Clonal expansion T cellsidentified in acute monoblastic leukemia by CDR3 size analysis of TCR Vβ repertoire using RT-PCR and genescan[J].Chinese Medical Journal,2002,115(1)：69-71.

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Comparative study on the expression of T cells receptor(TCR)Vβ subfamilies in pleural effusion and peripheral blood in patients with advanced lung cancer.

GUO Ning-ning1,CHEN Jing-sheng2,OU Yu-sheng2,XIAOLan-feng2*.1.Department of Oncology,the Third People's Hospital of Huizhou City,Huizhou 516001,Guangdong,CHINA; 2.Guangdong Pharmaceutical College,Guangzhou 510006,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo investigate and compare the expression of T cells receptor(TCR)Vβ subfamilies in peripheral blood and pleural effusion in patients with advanced lung cancer(Ⅲ～Ⅳstage).MethodsSpecimens from peripheral blood and pleural effusion of 89 patients diagnosed as advanced lung cancer from July 2010 to May 2012 were collected.The expression of TCR Vβ subfamilies were detected in the specimens using the flow cytometry (FCM).Statistical analysis was performed.ResultsThe peripheral blood and pleural effusion showed high expression of Vβ3 and Vβ9,specifically Vβ3(16/89)and Vβ9(18/89),Vβ3(20/89)and Vβ9(15/89),respectively.Difference was found in the expression of TCR Vβ subfamilies between peripheral blood and pleural effusion,of which some were statistically significant(P＜0.05)and some were not(P＞0.05).The high expression of Vβ3 in pleural effusion showed statistically significant difference with that in peripheral blood and healthy individuals(P＜0.05).ConclusionThe expression of TCR Vβ subfamilies are not identical in peripheral blood and pleural effusion in patients with advanced lung cancer,The TCR Vβ subfamilies highly expressed in pleural effusion are less than those in peripheral blood,and Vβ3 might be specific in pleural effusion.This study provides theoretical foundation for the application of Biotherapy and T cellsAdoptive Immunotherapy in the treatment of advanced lung cancer.

Advanced lung cancer;TCR Vβ gene;Peripheral blood;Pleural effusion;T cells

R734.2

A

1003—6350（2012）22—007—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2012.22.003

2012-06-07)

廣東省科技重大專項項目(編號：2009ZX09103-708)

郭寧寧(1982—)，女，廣東省惠州市人，醫(yī)師，碩士。

*通訊作者：肖蘭鳳(1953—)，女，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事腫瘤疾病基因治療的究。E-mail：guoning0305@126.com