淀粉酶產(chǎn)生菌的分離篩選

盧福芝，錢豐，楊琴，勞斌

(河池學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系，廣西宜州546300)

淀粉酶產(chǎn)生菌的分離篩選

盧福芝，錢豐，楊琴，勞斌

(河池學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系，廣西宜州546300)

從大米廠、淀粉廠周邊環(huán)境土壤中篩選到三株產(chǎn)淀粉酶能力較強(qiáng)的菌株Jz1、Jz2、Jz3。經(jīng)形態(tài)特征及染色等初步鑒定，菌株Jz1和Jz3為芽孢桿菌屬(Bacillus)，菌株Jz2為短小桿菌屬(Curtobacterium)。采用YoungJ.Y00改良法測定此三株菌株的淀粉酶活力分別為47.29 U/mL、48.48 U/mL、49.74 U/mL，具有較好的應(yīng)用潛力。

淀粉酶;篩選;鑒定

淀粉酶(E3.2.1.1)是水解淀粉和糖原酶類的總稱，廣泛存在于動(dòng)植物和微生物中，是最早實(shí)現(xiàn)工業(yè)生產(chǎn)，并且是迄今為止用途最廣、產(chǎn)量最大的酶制劑品種［1］。淀粉酶種類繁多，特點(diǎn)各異，廣泛應(yīng)用于食品加工、醫(yī)藥、造紙、印染、釀造、洗滌劑、工業(yè)副產(chǎn)品及廢料的處理、飼料工業(yè)及微生態(tài)制劑等多種領(lǐng)域［2－3］。我國淀粉資源豐富，淀粉酶應(yīng)用范圍非常廣泛，使用量巨大，但我國酶制劑產(chǎn)品的品種少，劑型少，產(chǎn)品結(jié)構(gòu)極不合理，應(yīng)用范圍非常狹窄，應(yīng)用領(lǐng)域僅局限于淀粉加工和洗滌劑工業(yè)。而國際上其應(yīng)用范圍卻遍及淀粉加工、洗滌劑、紡織、紙漿、造紙、酒精發(fā)酵、烘焙食品、動(dòng)物飼料、果汁生產(chǎn)等眾多領(lǐng)域［4］。目前，工業(yè)上主要采用微生物發(fā)酵法大量生產(chǎn)淀粉酶制劑［5］。本文從土壤中篩選出產(chǎn)淀粉酶的菌株，并對菌株的形態(tài)特征進(jìn)行鑒定及產(chǎn)酶能力的檢測，期望能將其應(yīng)用于工業(yè)領(lǐng)域。

1 材料與方法

1.1 土壤來源

采自廣西宜州市慶遠(yuǎn)鎮(zhèn)(原宜州市大米廠內(nèi))小型米粉加工作坊及廣西羅城科潮基業(yè)科技發(fā)展有限公司(羅城銀漢淀粉總廠)周邊的土壤。

1.2 培養(yǎng)基［6］

蛋白胨10 g/L，NaC l10 g/L，牛肉膏5 g/L，可溶性淀粉2 g/L。固體培養(yǎng)基加入瓊脂20 g/L，pH值7.0～7.2，0.1 MPa，滅菌20 min。

1.3 初篩方法

稱取土壤樣品1.0 g裝入小三角瓶中，加入9ml無菌水，充分振蕩后靜置，取上清液作濃度梯度稀釋［5］。吸取10－4、10－5、10－6稀釋液100μL均勻涂布于篩選平板上，于28℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)120 h。待菌落長出后向培養(yǎng)平板均勻噴灑盧戈氏碘液，挑取有明顯透明圈的菌落轉(zhuǎn)接到液體培養(yǎng)基中，于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h后，經(jīng)劃線分離培養(yǎng)48 h獲得純種，再轉(zhuǎn)接到液體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后于4℃保存［5］。

1.4 復(fù)篩方法

將所有初篩得到的菌種經(jīng)活化培養(yǎng)后，取0.2μL菌液點(diǎn)樣到篩選平板上。28℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h，待菌落長出后向培養(yǎng)平板均勻噴灑盧戈氏碘液，測定水解透明圈及菌落的直徑，挑取d0/d1(d0為水解圈直徑，d1為菌落直徑)較大的菌株作為實(shí)驗(yàn)菌株，進(jìn)行菌種鑒定及酶活檢測。

1.5 細(xì)菌鑒定

根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》(第8版)［7］，對所篩選到的菌株進(jìn)行菌落特征、形態(tài)觀察及革蘭氏染色。

1.6 淀粉酶活力測定

采用YoungJ.Y00改良法［8－10］進(jìn)行酶活力測定。其原理是根據(jù)淀粉酶將淀粉水解為長短不一的短鏈糊精和少量的還原糖而使淀粉對碘呈藍(lán)紫色特異反應(yīng)逐漸消失的特性，通過顯色消失的速度來衡量酶活力大小。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的分離篩選

通過加入可溶性淀粉的固體培養(yǎng)基進(jìn)行菌株的初步篩選，能在篩選平板上生長，噴灑盧戈氏碘液后產(chǎn)生透明圈的為篩選的目的菌株［5］。通過平板的初步篩選，在平板中共篩選出18株淀粉酶產(chǎn)生菌。將初篩得到的18株菌株進(jìn)行復(fù)篩，培養(yǎng)后測定各菌株的水解透明圈直徑(d0)及菌落的直徑(d1)，并取d0與d1的比值作為衡量該菌株產(chǎn)淀粉酶的能力。據(jù)此從初篩的18株菌株中選出3株水解透明圈較大的菌株為實(shí)驗(yàn)菌株，將其命名為Jz1、Jz2、Jz3，其d0/d1平均值分別為3.40、3.75、4.67。菌株Jz1、Jz2、Jz3的水解透明圈分別如圖1、圖2、圖3所示。

圖1 菌株Jz1的水解透明圈

圖2 菌株Jz2的水解透明圈

圖3 菌株Jz3的水解透明圈

2.2 菌株的鑒定［7］

對Jz1、Jz2、Jz3進(jìn)行菌落形態(tài)、芽孢及鞭毛觀察及革蘭氏染色。其鑒定結(jié)果如表1所示。

表1 菌株鑒定結(jié)果

2.3 淀粉酶活力的檢測

將Jz1、Jz2、Jz3三株菌株接入液體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵后，取發(fā)酵液于4℃，5 000 r/min，離心10 min，取上清液測酶活力。采用YoungJ.Y00改良法［8－10］進(jìn)行酶活力測定，分別測定對照樣品及3株菌株在OD620nm的光密度值。按酶活力計(jì)算公式:

酶活力(U/mL)=(R0－R)/R0×50×D(式中R0、R分別為對照液、反應(yīng)液的光密度;D為酶的稀釋倍數(shù))。

根據(jù)公式計(jì)算得出3株菌株的酶活力分別為47.29 U/mL、48.48 U/mL、49.74 U/mL。其中酶活最高的為Jz3，其次是Jz2，最低是Jz1，這與d0/d1的測定結(jié)果相一致。

3 結(jié)論

(1)從原宜州市大米廠及羅城銀漢淀粉總廠周邊環(huán)境的土壤中，經(jīng)多次分離篩選，獲得Jz1、Jz2、Jz3三株產(chǎn)淀粉酶能力較強(qiáng)的菌株，經(jīng)測定其淀粉酶活力分別為47.29 U/mL、48.48 U/mL、49.74 U/mL。

(2)經(jīng)形態(tài)特征及染色等初步鑒定，菌株Jz1和Jz3為芽孢桿菌屬(Bacillus)，菌株Jz2為短小桿菌屬(Curtobacterium)。

(3)實(shí)驗(yàn)中篩選到的三株菌株具有較高的初始酶活力，可以通過優(yōu)化菌株的培養(yǎng)基及產(chǎn)酶條件提高菌株的產(chǎn)酶能力，并對菌株的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行深入的研究。由于此三株菌株都是從自然界獲得的野生菌株，后續(xù)實(shí)驗(yàn)還可以通過誘變及分子改造等技術(shù)方法改良菌種，進(jìn)一步提高其產(chǎn)酶能力。

［1］谷軍.淀粉酶的生產(chǎn)與應(yīng)用［J］.生物技術(shù)，1994，4(3):1－5.

［2］張麗蘋，徐巖，金建中.酸性α－淀粉酶的研究與應(yīng)用［J］.釀酒科技，2002，29(3):4－15.

［3］張樹政.酶制劑工業(yè)［M］.北京:科學(xué)出版社，1998.

［4］居乃琥.酶工程研究和酶工程產(chǎn)業(yè)的新進(jìn)展(Ⅱ)——國內(nèi)外酶制劑工業(yè)的現(xiàn)狀、發(fā)展趨勢和對策建議［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2000，26 (4):38－43.

［5］張雙民.土壤中淀粉酶高產(chǎn)菌株的分離及產(chǎn)酶條件的優(yōu)化［J］.土壤肥料，2006，(2):59－61.

［6］張強(qiáng)，劉成君，蔣芳，等.耐高溫α－淀粉酶產(chǎn)生菌的分離鑒定及發(fā)酵條件與酶性質(zhì)研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2005，31(2):34－37.

［7］BUCHANAN RE，GIBBONSNE.伯杰細(xì)菌鑒定手冊(第8版)［M］.北京:科學(xué)出版社，1984.

［8］朱何東，陳遠(yuǎn)釗，常峰，等.高溫淀粉酶產(chǎn)生菌的篩選及酶學(xué)性質(zhì)研究［J］.釀酒科技，2006，(5):30－32.

［9］天津輕工業(yè)學(xué)院，大連輕工業(yè)學(xué)院，無錫輕工業(yè)學(xué)院，等.工業(yè)發(fā)酵分析［M］.北京:輕工業(yè)出版社，1980.

［10］徐穎.高產(chǎn)α－淀粉酶產(chǎn)生菌的篩選鑒定及其酶學(xué)性質(zhì)研究［D］.四川:四川大學(xué)，2007.

［責(zé)任編輯劉景平］

The isolation of am ylase－producing bacterial strains

LU Fu－zhi，QIAN Feng，YANG Qin，LAO Bin
(Departerment of Chem istry and Life Science，Hechi University，Yizhou，Guangxi546300，China)

Three bacterial strains Jz1、Jz2、Jz3 show high amylase activity，which were achieved from the soil near the rice and starch factories．The bacteria strains Jz1 and Jz3 are Bacillus after preliminary identification，while the bacterial strain Jz2 is Curtobacterium．The amylase activities of the three bacterial strains are 47.29 U/mL，48．48 U/mL and 49．74 U/mL respectively，determined by YoungJ．Y00modifiedmethod．They will be well applied in the future．

amylase;screening;identification

book=0,ebook=75

Q939.97

A

1672－9021(2012)02－0026－03

盧福芝(1984－)，女，廣西北流人，河池學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系助教，主要研究方向:微生物及分子生物學(xué)。

河池學(xué)院青年科研基金資助課題(2011A－N004)。

2012－03－01