• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    結(jié)核分枝桿菌Rv3803c、Rv3846基因的克隆、表達(dá)、純化與鑒定

    2012-09-02 07:28:14孫毅凡李海成周杰錢明陳濤江勇賴賽麟江振友鐘球周琳
    中國(guó)防癆雜志 2012年8期
    關(guān)鍵詞:電泳結(jié)核結(jié)核病

    孫毅凡 李海成 周杰 錢明 陳濤 江勇 賴賽麟 江振友 鐘球 周琳

    結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌感染引起的。據(jù)報(bào)道,2010年全球結(jié)核病新增患者約有880萬(wàn)[1]。我國(guó)結(jié)核病年發(fā)病人數(shù)約為130萬(wàn),占全球發(fā)病的14%,位居全球第2位[2]。我國(guó)結(jié)核病疫情仍很嚴(yán)重,因此圍繞研發(fā)保護(hù)性疫苗、改進(jìn)診斷技術(shù)一直是結(jié)核病基礎(chǔ)研究的熱點(diǎn)。

    結(jié)核分枝桿菌能分泌大量的免疫原性蛋白,其中由Rv3803c基因編碼的MPT51蛋白,與Ag85復(fù)合體有很大程度的同源性[3],其可能作為有效的保護(hù)性抗原在結(jié)核分枝桿菌感染免疫中發(fā)揮重要作用。SodA由結(jié)核分枝桿菌Rv3846基因編碼,是一種由致病性分枝桿菌大量分泌的毒力因子,可將宿主巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的氧自由基轉(zhuǎn)換為過(guò)氧化氫[4],從而對(duì)抗巨噬細(xì)胞的氧化攻擊。筆者克隆表達(dá)了Rv3803c、Rv3846基因,對(duì)其編碼的蛋白 MPT51、SodA進(jìn)行純化鑒定,為進(jìn)一步探討相關(guān)分泌抗原的輔助診斷價(jià)值,構(gòu)建保護(hù)性疫苗及篩選藥物靶點(diǎn)等奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

    材料和方法

    一、菌種和載體

    Mtb H37Rv標(biāo)準(zhǔn)菌株為本中心保存,大腸埃希菌(E.coli)TOP10菌株、E.coli Rosetta菌株購(gòu)自中國(guó)Transgen公司,pGEX-6P-1載體(氨芐青霉素抗性,多克隆位點(diǎn)BamHⅠ,EcoRⅠ,SmaⅠ,SalⅠ,XhoⅠ,NotⅠ)購(gòu)自美國(guó)GE公司。

    二、酶和試劑

    限制性內(nèi)切酶、T4連接酶、Pyrobest DNA聚合酶均購(gòu)自日本TaKaRa公司,谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(anti-GST)鼠單抗購(gòu)自美國(guó)Santa Cruse公司,辣根過(guò)氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的兔抗鼠二抗購(gòu)自美國(guó)promega公 司,異 丙 基-β-D-硫 代 吡 喃 半 乳 糖 苷(IPTG)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、氨芐青霉素、還原性谷胱甘肽購(gòu)自鼎國(guó)生物公司,Glutathione Sepharose 4B購(gòu)自美國(guó)GE公司,電化學(xué)發(fā)光液(electrochemiluminescence,ECL)購(gòu)自美國(guó)Pierce公司。

    三、Rv3803c、Rv3846基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建、表達(dá)和純化方法

    (一)基因克隆和鑒定

    以H37Rv基因組DNA為模板分別擴(kuò)增Rv3803c、Rv3846。

    Rv3803c上 游 引 物:5′-GTACATGGATCCATGAAGGGTCGGTCGGCGCTGCTGC-3′; 下游引物:5′-GTACATCTCGAGTTAGCGGATCGCACCGACGATATCG-3′。

    Rv3846上 游 引 物:5′-GTACATGGATCCATGGCCGAATACACCTTGCCAGACC-3′; 下游 引 物:5′-GTACATCTCGAGTCAGCCGAATATCAACCCCTTGGTC-3′。

    Rv3803c的PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件:94℃3min,94℃ 30s,65℃ 1min,72℃ 70s,30個(gè)循環(huán);Rv3846的PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件:94℃3min,94℃30s,62℃1min,72℃1min,30個(gè)循環(huán)。

    PCR產(chǎn)物經(jīng)BamHⅠ、XhoⅠ內(nèi)切酶酶切之后,1%瓊脂糖凝膠電泳后回收目的條帶,T4連接酶連接到表達(dá)載體 pGEX-6P-1,轉(zhuǎn)化到E.coliTOP10中,送美國(guó)Invitrogen公司中國(guó)分部測(cè)序。

    (二)重組質(zhì)粒的構(gòu)建和誘導(dǎo)表達(dá)

    把測(cè)序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coli Rosetta中,準(zhǔn)備表達(dá)重組蛋白。挑單克隆于5ml含50μg/ml氨芐青霉素的LB(lysogeny broth,溶菌肉湯)培養(yǎng)基中過(guò)夜活化培養(yǎng),第二天以1∶100的體積接種到200ml含50μg/ml氨芐青霉素的新鮮LB培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)至A600=0.5~0.6時(shí),加入終濃度為0.4mmol/L的IPTG,16℃誘導(dǎo)培養(yǎng)8h。

    (三)重組蛋白免疫印跡(Western blot)鑒定

    1.免疫印跡鑒定:取大約1個(gè)A600量(1×109)的菌,超聲破菌(100W 功率,超聲發(fā)射5s,靜止10s,連續(xù)進(jìn)行5min),4℃,20 000g離心15min,分開(kāi)上清液和沉淀;為了檢測(cè)目的蛋白在上清(可溶)還是沉淀(包涵體)中,上清和沉淀分別加入等量的電泳上樣緩沖液,沸水浴煮6min。取5μl進(jìn)行SDS-PAGE(十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠)電泳。電泳后半干轉(zhuǎn)膜(15V,45min)。轉(zhuǎn)印后的PVDF(聚偏氟乙烯)膜用含5%脫脂奶粉的PBS(磷酸鹽緩沖液)室溫封閉1h,anti-GST單抗1∶2000室溫標(biāo)記1h,HRP偶聯(lián)的兔抗鼠二抗1∶5000標(biāo)記1h,加入ECL液顯影。

    2.考馬斯亮藍(lán)染色鑒定:純化蛋白和BSA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳后的SDS-PAGE膠用考馬斯亮藍(lán)染液過(guò)夜染色,然后用脫色液脫色至條帶清晰出現(xiàn)。

    3.表達(dá)產(chǎn)物的純化:3000g離心10min,收集誘導(dǎo)后的菌體,10ml含2mmol PMSF的PBS重懸,超聲破菌(100W功率,超聲發(fā)射5s,靜止10s,連續(xù)進(jìn)行5min);4℃,20 000g離心15min,上清液加入100μl Glutathione Sepharose 4B微珠,4℃孵育12h。4℃,500g離心5min收集微珠,用含1%tritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚-100)的PBS液洗3次,最后用含10mmol/L還原性谷胱甘肽的50mmol/L pH8.0的Tris-HCl(三羥甲基氨基甲烷)洗脫蛋白。

    結(jié) 果

    1.Rv3803c、Rv3846基因擴(kuò)增結(jié)果:以 H37Rv為模板,分別擴(kuò)增得到大約900bp、600bp的基因片段(圖1),與Rv3803c、Rv3846基因的理論值相符。限制性內(nèi)切酶消化后,連接到pGEX-6p-1載體上,構(gòu)建pGEX-Rv3803c、pGEX-Rv3846重組質(zhì)粒。測(cè)序后與H37Rv比對(duì)顯示:重組質(zhì)粒Rv3803c、Rv3846編碼基因與H37Rv上基因核苷酸序列完全一致。

    圖1 A:Rv3803c基因PCR擴(kuò)增結(jié)果(900bp);B:Rv3846基因PCR擴(kuò)增結(jié)果(620bp)

    2.GST-Rv3803c和 GST-Rv3846重組蛋白在E.coli中表達(dá)的可溶性分析:含有重組質(zhì)粒的E.coli Rosetta用1mmol IPTG 誘導(dǎo)后,超聲破碎菌,20 000g離心15min,分開(kāi)上清液(可溶性部分)和沉淀(包涵體),等體積加入上樣緩沖液,Western blot鑒定。GST-Rv3803c和 GST-Rv3846兩個(gè)重組蛋白在上清液(可溶性部分)和沉淀(包涵體)中的含量大致相等(圖2),故其在E.coli Rosetta中的存在形式均為可溶部分約50%,包涵體形式約50%,相對(duì)分子質(zhì)量分別約為56 000和45 000。

    圖2 GST-Rv3803c和GST-Rv3846融合蛋白在E.coli中表達(dá)的可溶性分析

    3.重組蛋白純化結(jié)果鑒定:含有重組質(zhì)粒的E.coli Rosetta誘導(dǎo)并超聲破碎的上清液與Glutathione Sepharose 4B微珠孵育,親和純化目的重組蛋白。純化后的目的重組蛋白進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色(圖3A)和 Western blot(圖3B)鑒定。有完整的融合蛋白被純化出來(lái),純化的GST-Rv3803c、GST-Rv3846樣品純度90%以上,但由于GST-Rv3803c純化后降解較嚴(yán)重,最終只能得到10%未降解的完整蛋白。完整的GST-Rv3803c的濃度大約為0.1mg/ml,完整的GST-Rv3846的濃度大約為0.5mg/ml。相當(dāng)于每升E.coli Rosetta培養(yǎng)物中,GST-Rv3803c產(chǎn)量為:0.25mg/L、GST-Rv3846產(chǎn)量為1.25mg/L。

    圖3 A:GST-Rv3803c和GST-Rv3846融合蛋白親和純化及考馬斯亮藍(lán)染色鑒定;B:GST-Rv3803c和GST-Rv3846融合蛋白親和純化及 Western blot鑒定

    討 論

    近年來(lái),結(jié)核分枝桿菌分泌性蛋白的相關(guān)研究一直備受關(guān)注。目前對(duì)多種分泌性蛋白的研究發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)期分泌的蛋白,如MPT51、SodA等在結(jié)核感染免疫中發(fā)揮了重要作用,為構(gòu)建保護(hù)性疫苗提供了新的思路。

    MPT51蛋白的編碼基因是Rv3803c,又稱fbpC1。其相對(duì)分子質(zhì)量約為27 000,是一種非催化性的α/β水解酶,且與Ag85復(fù)合體有較高同源性。MiKi等[5]報(bào)道,MPT51可在小鼠的脾細(xì)胞中介導(dǎo)Ⅰ型細(xì)胞免疫。Bethunaickan等[6]以重組Rv3803c為抗原對(duì)結(jié)核患者IgG、IgA、IgM水平進(jìn)行檢測(cè),IgG特異度為98%,IgG+I(xiàn)gA敏感度為71%,均顯著高于健康對(duì)照組,具有一定的診斷價(jià)值。Siev等[7]發(fā)現(xiàn),HIV感染和未感染的結(jié)核和非結(jié)核患者中,抗MPT51的抗體檢測(cè)在血清和血漿樣品中顯著相關(guān)。此外,MPT51作為候選蛋白在構(gòu)建疫苗中的免疫學(xué)作用也受到關(guān)注。Silva等[8]發(fā)現(xiàn)重組MPT51/CpG的DNA疫苗接種能夠?yàn)榻Y(jié)核感染小鼠模型提供一定的保護(hù)作用。Wang等[9]的研究也表明,其在結(jié)核感染中發(fā)揮關(guān)鍵的保護(hù)作用。因此,純化出MPT51,可為進(jìn)一步探討其輔助診斷價(jià)值、構(gòu)建保護(hù)性疫苗等做出必要準(zhǔn)備。

    超氧化物歧化酶(SOD)是需氧微生物普遍存在的一種催化超氧自由基轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化氫的金屬酶。結(jié)核分枝桿菌中有2種SOD,其中SodA由Rv3846基因編碼,對(duì)病原體有明顯的保護(hù)作用。研究發(fā)現(xiàn)SodA的分泌依賴一種輔助分泌因子Sec2,此種Sec2依賴性的蛋白輸出方式參與某種特異性分泌系統(tǒng),是結(jié)核分枝桿菌逃避宿主Mφ氧化攻擊的毒力機(jī)制之一[10]。結(jié)核感染動(dòng)物模型中,降低結(jié)核分枝桿菌SOD的產(chǎn)生,可加快單核細(xì)胞向肺部浸潤(rùn)及細(xì)胞凋亡,提示SOD在結(jié)核致病過(guò)程中發(fā)揮重要作用[11]。Khera等[12]發(fā)現(xiàn)表達(dá) SOD 的 DNA 疫苗能產(chǎn)生較高水平的IFN-γ,且保護(hù)作用最強(qiáng)。新近文獻(xiàn)報(bào)道,SodA在BCG中的過(guò)量表達(dá)可導(dǎo)致BCG的免疫效力喪失[13]。以上各項(xiàng)結(jié)果說(shuō)明純化鑒定分泌抗原SodA,對(duì)深入研究SodA的分子致病機(jī)制,探討其作為疫苗候選蛋白的可能性建立了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

    本研究以pGEX-6P-1為載體,在E.coli Rosetta菌中誘導(dǎo)表達(dá),其補(bǔ)充了E.coli缺乏的6種稀有密碼子(AUA,AGG,AGA,CUA,CCC,GGA)對(duì)應(yīng)的tRNA,可明顯提高外源基因在原核系統(tǒng)中的表達(dá)水平。采用GST標(biāo)簽親和層析法成功純化出了GST-Rv3803c和GST-Rv3846蛋白,以期進(jìn)一步探討結(jié)核分枝桿菌分泌性蛋白MPT51、SodA在與宿主巨噬細(xì)胞相互作用時(shí),Toll樣受體、細(xì)胞凋亡等相關(guān)信號(hào)通路變化,以及細(xì)胞因子相關(guān)免疫平衡等分子免疫機(jī)制及其在結(jié)核防治轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用。

    [1]World Health Organisation. Global tuberculosis control:WHO report 2011[R/OL].World Health Organization,2011[2012-04-20].http://www.who.int/tb/publications/global_report/2011/gtbr11_full.pdf.

    [2]吳雪瓊.新型結(jié)核病疫苗的研究現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢(shì).中國(guó)防癆雜志,2012,34(3):133-137.

    [3]Ramalingam B,Baulard AR,Locht C,et al.Cloning,expression,and purification of the 27kDa(MPT51,Rv3803c)protein ofMycobacterium tuberculosis.Protein Expr Purif,2004,36(1):53-60.

    [4]Harth G,Horwitz MA.Export of recombinantMycobacterium tuberculosissuperoxide dismutase is dependent upon both information in the protein and mycobacterial export machinery.A model for studying export of leaderless proteins by pathogenic mycobacteria.J Biol Chem,1999,274(7):4281-4292.

    [5]Miki K,Nagata T,Tanaka T,et al.Induction of protective cellular immunity againstMycobacterium tuberculosisby recombinant attenuated self-destructing listeria monocytogenes strains harboring eukaryotic expression plasmids for antigen 85 complex and MPB/MPT51.Infect Immun,2004,72(4):2014-2021.

    [6]Bethunaickan R,Baulard AR,Locht C,et al.Antibody response in pulmonary tuberculosis against recombinant27kDa(MPT51,Rv3803c)protein ofMycobacterium tuberculosis.Scand J Infect Dis,2007,39(10):867-874.

    [7]Siev M,Yu X,Prados-Rosales R,et al.Correlation between serum and plasma antibody titers to Mycobacterial antigens.Clin Vaccine Immunol,2011,18(1):173-175.

    [8]Silva BD,da Silva EB,do Nascimento IP,et al.MPT-51/CpG DNA vaccine protects mice againstMycobacterium tuberculosis.Vaccine,2009,27(33):4402-4407.

    [9] Wang LX,Nagata T,Tsujimura K,et al.Identification of HLA-DR4-restricted T-cell epitope on MPT51protein,a major secreted protein derived fromMycobacterium tuberculosisusing MPT51overlapping peptides screening and DNA vaccination.Vaccine,2010,28(8):2026-2031.

    [10]Braunstein M,Espinosa BJ,Chan J,et al.SecA2functions in the secretion of superoxide dismutase A and in the virulence ofMycobacterium tuberculosis. Mol Microbiol,2003,48(2):453-464.

    [11]Edwards KM,Cynamon MH,Voladri RK,et al.Iron-cofactored superoxide dismutase inhibits host responses toMycobacterium tuberculosis.Am J Respir Crit Care Med,2001,164(12):2213-2219.

    [12]Khera A,Singh R,Shakila H,et al.Elicitation of efficient,protective immune responses by using DNA vaccines against tuberculosis.Vaccine,2005,23(48/49):5655-5665.

    [13]Jain R,Dey B,Khera A,et al.Over-expression of superoxide dismutase obliterates the protective effect of BCG against tuberculosis by modulating innate and adaptive immune responses.Vaccine,2011,29(45):8118-8125.

    猜你喜歡
    電泳結(jié)核結(jié)核病
    世界防治結(jié)核病日
    警惕卷土重來(lái)的結(jié)核病
    輔助陽(yáng)極在輕微型廂式車身電泳涂裝中的應(yīng)用
    一度浪漫的結(jié)核
    特別健康(2018年4期)2018-07-03 00:38:26
    PPG第四屆電泳涂料研討會(huì)在長(zhǎng)沙成功舉辦
    上海建材(2017年4期)2017-04-06 07:32:03
    層次分析模型在結(jié)核疾病預(yù)防控制系統(tǒng)中的應(yīng)用
    改良的Tricine-SDS-PAGE電泳檢測(cè)胸腺肽分子量
    算好結(jié)核病防治經(jīng)濟(jì)賬
    中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)核感染的中醫(yī)辨治思路
    IL-17在結(jié)核病免疫應(yīng)答中的作用
    亚洲综合色惰| 最近的中文字幕免费完整| tube8黄色片| 日韩成人av中文字幕在线观看| 美女国产视频在线观看| 欧美日韩在线观看h| 久久99一区二区三区| .国产精品久久| 男人和女人高潮做爰伦理| 免费看av在线观看网站| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 观看av在线不卡| 国产精品久久久久久精品电影小说| 久久久国产一区二区| 亚洲av男天堂| 午夜日本视频在线| 久久久久久久久久人人人人人人| 国产色婷婷99| av线在线观看网站| 精品一区二区三区视频在线| 国产精品久久久久久av不卡| 9色porny在线观看| www.色视频.com| av播播在线观看一区| 国产有黄有色有爽视频| 18+在线观看网站| 国产淫语在线视频| 国产爽快片一区二区三区| 久久精品国产亚洲网站| 国模一区二区三区四区视频| 丰满迷人的少妇在线观看| 日本wwww免费看| 欧美日韩视频精品一区| 久久久国产精品麻豆| 国产精品人妻久久久久久| 国产一区有黄有色的免费视频| 纯流量卡能插随身wifi吗| 亚洲国产色片| 精品国产国语对白av| av在线播放精品| 国产成人精品婷婷| 一级毛片 在线播放| av免费观看日本| 久久人妻熟女aⅴ| 性高湖久久久久久久久免费观看| 欧美+日韩+精品| 赤兔流量卡办理| 免费少妇av软件| 丁香六月天网| 一个人免费看片子| 99热这里只有是精品在线观看| 下体分泌物呈黄色| 国产在视频线精品| 日日摸夜夜添夜夜爱| 我要看日韩黄色一级片| 最近最新中文字幕免费大全7| 日韩伦理黄色片| 日本色播在线视频| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 中文天堂在线官网| 亚洲经典国产精华液单| 久久人妻熟女aⅴ| 国产av精品麻豆| 欧美xxⅹ黑人| 三级国产精品欧美在线观看| 色5月婷婷丁香| 性色av一级| 一区二区三区乱码不卡18| 午夜91福利影院| 国产成人精品婷婷| 国产欧美日韩综合在线一区二区 | 特大巨黑吊av在线直播| 国产成人aa在线观看| 亚洲伊人久久精品综合| 伊人亚洲综合成人网| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 寂寞人妻少妇视频99o| 国产高清不卡午夜福利| 老司机影院毛片| 在线精品无人区一区二区三| 亚洲欧美成人精品一区二区| 精品亚洲成国产av| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 亚洲av不卡在线观看| 一级黄片播放器| 曰老女人黄片| 简卡轻食公司| 免费黄色在线免费观看| 亚洲美女搞黄在线观看| 亚洲美女搞黄在线观看| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 亚洲国产色片| 午夜激情福利司机影院| 国产精品一二三区在线看| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 性色av一级| 久久精品久久久久久久性| av女优亚洲男人天堂| 韩国高清视频一区二区三区| 免费在线观看成人毛片| 麻豆成人午夜福利视频| 人妻少妇偷人精品九色| 少妇 在线观看| 国产精品一区www在线观看| 国产淫片久久久久久久久| 曰老女人黄片| 国产日韩欧美视频二区| 国产日韩欧美视频二区| 日本黄色片子视频| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 丝瓜视频免费看黄片| 亚洲精品一区蜜桃| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 国产成人精品一,二区| 国产免费又黄又爽又色| 中国美白少妇内射xxxbb| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 精品人妻偷拍中文字幕| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 99久久中文字幕三级久久日本| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 亚洲精品一区蜜桃| 国产av一区二区精品久久| 内射极品少妇av片p| 黄色一级大片看看| 国产在线视频一区二区| 麻豆成人av视频| 免费观看av网站的网址| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 亚洲美女黄色视频免费看| 婷婷色麻豆天堂久久| 婷婷色麻豆天堂久久| 91aial.com中文字幕在线观看| 最新的欧美精品一区二区| 日韩av不卡免费在线播放| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 91aial.com中文字幕在线观看| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 国产精品无大码| 日韩精品有码人妻一区| 最近最新中文字幕免费大全7| 亚州av有码| 精品久久国产蜜桃| 啦啦啦在线观看免费高清www| 9色porny在线观看| 久久韩国三级中文字幕| 最近手机中文字幕大全| 一本一本综合久久| 一区二区三区乱码不卡18| 国产 精品1| 另类精品久久| 观看免费一级毛片| 免费人成在线观看视频色| 久久av网站| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 亚洲成人av在线免费| 日韩av不卡免费在线播放| 人妻夜夜爽99麻豆av| 成人毛片a级毛片在线播放| a级毛片在线看网站| av网站免费在线观看视频| 国产精品国产三级专区第一集| 亚洲精品,欧美精品| 亚洲精品日韩av片在线观看| 亚洲av男天堂| av一本久久久久| 中文字幕av电影在线播放| 春色校园在线视频观看| 久久精品夜色国产| 91精品国产九色| 国产成人精品一,二区| 色5月婷婷丁香| 人人妻人人看人人澡| 亚洲图色成人| 日韩欧美一区视频在线观看 | www.色视频.com| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 国国产精品蜜臀av免费| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 高清欧美精品videossex| 妹子高潮喷水视频| 国产高清三级在线| 久久亚洲国产成人精品v| 亚洲成色77777| 边亲边吃奶的免费视频| 亚洲天堂av无毛| 亚洲av.av天堂| 有码 亚洲区| 精品少妇久久久久久888优播| 日本欧美国产在线视频| 国产亚洲一区二区精品| 国产深夜福利视频在线观看| 在线观看一区二区三区激情| 午夜视频国产福利| 在线免费观看不下载黄p国产| 国产av国产精品国产| 黑人猛操日本美女一级片| 精品少妇内射三级| 婷婷色综合www| 一级av片app| 日日啪夜夜爽| 99国产精品免费福利视频| 伦理电影大哥的女人| 午夜激情福利司机影院| 成人漫画全彩无遮挡| 亚洲高清免费不卡视频| 国产精品熟女久久久久浪| 免费看av在线观看网站| 老女人水多毛片| 亚洲精品一二三| 国产熟女欧美一区二区| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 久久久久精品久久久久真实原创| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 超碰97精品在线观看| 丝袜喷水一区| 伦精品一区二区三区| 亚洲av中文av极速乱| 99热国产这里只有精品6| 男女国产视频网站| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 欧美3d第一页| 久久婷婷青草| 国产精品久久久久久久电影| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 国产成人91sexporn| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 高清不卡的av网站| 精品人妻熟女av久视频| av在线app专区| 久久国产精品大桥未久av | 国产精品女同一区二区软件| 国产黄片视频在线免费观看| 国产美女午夜福利| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 中文精品一卡2卡3卡4更新| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 男男h啪啪无遮挡| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 国产色爽女视频免费观看| 午夜福利,免费看| 亚洲精品aⅴ在线观看| av免费在线看不卡| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 嘟嘟电影网在线观看| 日韩视频在线欧美| 精品国产露脸久久av麻豆| 亚洲美女黄色视频免费看| a级毛片免费高清观看在线播放| 2021少妇久久久久久久久久久| 99热这里只有精品一区| 欧美高清成人免费视频www| 日韩欧美 国产精品| 最近最新中文字幕免费大全7| 十八禁网站网址无遮挡 | 色视频www国产| 欧美一级a爱片免费观看看| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 少妇被粗大猛烈的视频| 免费av中文字幕在线| 大香蕉97超碰在线| 国产深夜福利视频在线观看| 国产精品99久久久久久久久| 男的添女的下面高潮视频| 97超视频在线观看视频| 国产高清有码在线观看视频| 免费黄色在线免费观看| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 亚洲中文av在线| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 亚洲av福利一区| 美女内射精品一级片tv| 婷婷色av中文字幕| 少妇的逼水好多| 日本免费在线观看一区| 搡女人真爽免费视频火全软件| 午夜福利视频精品| 国产91av在线免费观看| 久久久久久久久久成人| 日韩av在线免费看完整版不卡| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 亚洲va在线va天堂va国产| 亚洲国产成人一精品久久久| 国产精品99久久久久久久久| 亚洲精品视频女| 精品久久国产蜜桃| 国产精品一区www在线观看| 中文字幕久久专区| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 国产伦精品一区二区三区视频9| 久久久久久久精品精品| 狂野欧美激情性bbbbbb| 精品一品国产午夜福利视频| av视频免费观看在线观看| 成人亚洲欧美一区二区av| 日韩精品有码人妻一区| 9色porny在线观看| 欧美3d第一页| 伦精品一区二区三区| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 在线看a的网站| 看免费成人av毛片| 国产精品人妻久久久久久| 十八禁高潮呻吟视频 | 亚洲国产精品国产精品| 欧美日韩视频精品一区| 亚洲精品国产色婷婷电影| 亚洲四区av| av线在线观看网站| 插逼视频在线观看| 各种免费的搞黄视频| 国内精品宾馆在线| 日韩视频在线欧美| 22中文网久久字幕| 丰满乱子伦码专区| 久久精品夜色国产| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 丰满乱子伦码专区| 99热6这里只有精品| 日韩成人伦理影院| 少妇人妻一区二区三区视频| 91在线精品国自产拍蜜月| 香蕉精品网在线| 欧美+日韩+精品| 欧美精品一区二区免费开放| 亚洲精品久久午夜乱码| 中文字幕亚洲精品专区| 成人亚洲精品一区在线观看| 26uuu在线亚洲综合色| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 成年av动漫网址| 黄色日韩在线| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 久久久久久久亚洲中文字幕| 永久网站在线| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 免费在线观看成人毛片| 欧美激情国产日韩精品一区| 26uuu在线亚洲综合色| 嫩草影院入口| 精品人妻一区二区三区麻豆| 日本黄大片高清| 搡老乐熟女国产| 亚洲av综合色区一区| 99视频精品全部免费 在线| 欧美精品国产亚洲| 国产成人aa在线观看| 99re6热这里在线精品视频| 搡女人真爽免费视频火全软件| 亚洲精品国产av成人精品| 国产成人精品一,二区| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 欧美性感艳星| 国产91av在线免费观看| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 亚洲自偷自拍三级| 久久精品久久久久久久性| 岛国毛片在线播放| 日韩制服骚丝袜av| 亚洲综合精品二区| 在线观看免费视频网站a站| 亚洲真实伦在线观看| 色视频在线一区二区三区| 成年av动漫网址| 精品国产露脸久久av麻豆| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 国产美女午夜福利| 午夜视频国产福利| 欧美精品一区二区免费开放| 校园人妻丝袜中文字幕| 欧美成人精品欧美一级黄| 18+在线观看网站| 人人妻人人澡人人看| 亚洲精品国产av成人精品| 国产午夜精品一二区理论片| 日韩人妻高清精品专区| 综合色丁香网| 99热这里只有是精品在线观看| 麻豆成人av视频| 亚洲av成人精品一二三区| 91精品国产国语对白视频| 久久久久久久久久久丰满| 亚洲欧美精品自产自拍| 欧美少妇被猛烈插入视频| 韩国高清视频一区二区三区| 亚洲欧美日韩东京热| 女人精品久久久久毛片| 麻豆成人午夜福利视频| 在线播放无遮挡| 搡女人真爽免费视频火全软件| 一本一本综合久久| 国产成人一区二区在线| 搡女人真爽免费视频火全软件| 简卡轻食公司| 高清视频免费观看一区二区| 日本wwww免费看| a 毛片基地| 成人免费观看视频高清| av免费在线看不卡| 国产片特级美女逼逼视频| 人妻一区二区av| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 免费在线观看成人毛片| 看十八女毛片水多多多| av免费在线看不卡| 一级黄片播放器| 女人久久www免费人成看片| 午夜激情久久久久久久| 性色av一级| 久久久久久久久久久免费av| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 人妻少妇偷人精品九色| 亚洲国产日韩一区二区| av免费在线看不卡| 亚洲人与动物交配视频| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 国产中年淑女户外野战色| 免费av不卡在线播放| 黑人猛操日本美女一级片| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 亚洲精品视频女| 日日摸夜夜添夜夜爱| av黄色大香蕉| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 搡老乐熟女国产| 99热这里只有是精品在线观看| 免费黄频网站在线观看国产| 日本与韩国留学比较| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| a 毛片基地| 少妇高潮的动态图| 精品久久久久久久久av| 亚洲国产成人一精品久久久| 久久久亚洲精品成人影院| av在线播放精品| 久久这里有精品视频免费| 少妇丰满av| 国产精品熟女久久久久浪| 国产毛片在线视频| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 日韩亚洲欧美综合| 赤兔流量卡办理| 丝袜在线中文字幕| 日本免费在线观看一区| 一级二级三级毛片免费看| 成人综合一区亚洲| 国产一区二区在线观看av| 色婷婷久久久亚洲欧美| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 一级毛片 在线播放| 51国产日韩欧美| av.在线天堂| 一二三四中文在线观看免费高清| 99久久精品一区二区三区| 国产成人91sexporn| 另类精品久久| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 热re99久久国产66热| 成人午夜精彩视频在线观看| 日本vs欧美在线观看视频 | 国产伦理片在线播放av一区| 久久久久国产网址| 黑人猛操日本美女一级片| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 婷婷色麻豆天堂久久| 最近手机中文字幕大全| 国产在线视频一区二区| 成人影院久久| 国产免费又黄又爽又色| 99久久中文字幕三级久久日本| 免费看av在线观看网站| 成人毛片60女人毛片免费| 能在线免费看毛片的网站| 精品酒店卫生间| 天美传媒精品一区二区| 国产成人午夜福利电影在线观看| 亚洲自偷自拍三级| 欧美成人午夜免费资源| 婷婷色综合大香蕉| 国产精品一二三区在线看| 日韩一本色道免费dvd| 国产亚洲精品久久久com| 国产成人精品福利久久| 国产日韩一区二区三区精品不卡 | 在线免费观看不下载黄p国产| 制服丝袜香蕉在线| 午夜老司机福利剧场| av有码第一页| 国产综合精华液| 日韩一区二区视频免费看| 久久久久久伊人网av| 中文字幕亚洲精品专区| 中文欧美无线码| 三级国产精品片| 亚洲av中文av极速乱| 久久精品夜色国产| 国产成人精品无人区| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 插逼视频在线观看| 六月丁香七月| 亚洲经典国产精华液单| 久久97久久精品| 性高湖久久久久久久久免费观看| av在线播放精品| 精品酒店卫生间| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 国产一区二区三区综合在线观看 | 色婷婷av一区二区三区视频| 热re99久久精品国产66热6| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 久久久久国产精品人妻一区二区| 婷婷色麻豆天堂久久| 免费在线观看成人毛片| 日日啪夜夜撸| 国产精品久久久久久精品电影小说| 亚洲欧美精品自产自拍| 一本大道久久a久久精品| 人体艺术视频欧美日本| 丰满少妇做爰视频| 99精国产麻豆久久婷婷| 春色校园在线视频观看| 天堂中文最新版在线下载| 午夜福利影视在线免费观看| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 国产免费一区二区三区四区乱码| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 午夜免费鲁丝| 免费看光身美女| 高清不卡的av网站| 亚洲成色77777| 春色校园在线视频观看| 九九在线视频观看精品| 午夜91福利影院| 在线天堂最新版资源| 高清欧美精品videossex| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| videossex国产| 插逼视频在线观看| 国产在视频线精品| 99精国产麻豆久久婷婷| av国产精品久久久久影院| 伊人久久精品亚洲午夜| 久久久久久久精品精品| 久久久欧美国产精品| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 亚洲av男天堂| 内地一区二区视频在线| 人妻夜夜爽99麻豆av| 亚洲精品乱久久久久久| 一级爰片在线观看| 亚洲国产欧美在线一区| 妹子高潮喷水视频| 欧美精品一区二区免费开放| 免费黄网站久久成人精品| 亚洲国产精品国产精品| 国产黄片美女视频| 国内精品宾馆在线| 五月开心婷婷网| 国产成人a∨麻豆精品| 国产熟女欧美一区二区| 久久人人爽人人爽人人片va| 国内揄拍国产精品人妻在线| 香蕉精品网在线| 我的女老师完整版在线观看| 一级毛片aaaaaa免费看小| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 精品久久久精品久久久| 人妻一区二区av| 美女内射精品一级片tv| 久久国产精品大桥未久av | 国产伦精品一区二区三区四那| 国产一区亚洲一区在线观看| 久久毛片免费看一区二区三区| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 18+在线观看网站| 丰满迷人的少妇在线观看| 免费少妇av软件| 亚洲av福利一区| 国产在线一区二区三区精| 草草在线视频免费看| 亚洲精品第二区| 久久久午夜欧美精品| 99热6这里只有精品| 亚洲电影在线观看av| 能在线免费看毛片的网站| 免费看光身美女| 一区二区三区四区激情视频| 国产色婷婷99| 亚洲情色 制服丝袜| 十八禁网站网址无遮挡 | 国产淫语在线视频| 国产男人的电影天堂91| 免费看不卡的av| √禁漫天堂资源中文www| 久久av网站| 精品国产国语对白av| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 曰老女人黄片| 黄片无遮挡物在线观看| 免费黄色在线免费观看| av免费观看日本| 亚洲人与动物交配视频| 中文欧美无线码| 亚洲图色成人| 久久国产乱子免费精品| 久久久久久久大尺度免费视频| 久久99一区二区三区| 水蜜桃什么品种好| 亚洲真实伦在线观看| 亚洲精品成人av观看孕妇|