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    結(jié)核分枝桿菌Rv3803c、Rv3846基因的克隆、表達(dá)、純化與鑒定

    2012-09-02 07:28:14孫毅凡李海成周杰錢明陳濤江勇賴賽麟江振友鐘球周琳
    中國(guó)防癆雜志 2012年8期
    關(guān)鍵詞:電泳結(jié)核結(jié)核病

    孫毅凡 李海成 周杰 錢明 陳濤 江勇 賴賽麟 江振友 鐘球 周琳

    結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌感染引起的。據(jù)報(bào)道,2010年全球結(jié)核病新增患者約有880萬(wàn)[1]。我國(guó)結(jié)核病年發(fā)病人數(shù)約為130萬(wàn),占全球發(fā)病的14%,位居全球第2位[2]。我國(guó)結(jié)核病疫情仍很嚴(yán)重,因此圍繞研發(fā)保護(hù)性疫苗、改進(jìn)診斷技術(shù)一直是結(jié)核病基礎(chǔ)研究的熱點(diǎn)。

    結(jié)核分枝桿菌能分泌大量的免疫原性蛋白,其中由Rv3803c基因編碼的MPT51蛋白,與Ag85復(fù)合體有很大程度的同源性[3],其可能作為有效的保護(hù)性抗原在結(jié)核分枝桿菌感染免疫中發(fā)揮重要作用。SodA由結(jié)核分枝桿菌Rv3846基因編碼,是一種由致病性分枝桿菌大量分泌的毒力因子,可將宿主巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的氧自由基轉(zhuǎn)換為過(guò)氧化氫[4],從而對(duì)抗巨噬細(xì)胞的氧化攻擊。筆者克隆表達(dá)了Rv3803c、Rv3846基因,對(duì)其編碼的蛋白 MPT51、SodA進(jìn)行純化鑒定,為進(jìn)一步探討相關(guān)分泌抗原的輔助診斷價(jià)值,構(gòu)建保護(hù)性疫苗及篩選藥物靶點(diǎn)等奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

    材料和方法

    一、菌種和載體

    Mtb H37Rv標(biāo)準(zhǔn)菌株為本中心保存,大腸埃希菌(E.coli)TOP10菌株、E.coli Rosetta菌株購(gòu)自中國(guó)Transgen公司,pGEX-6P-1載體(氨芐青霉素抗性,多克隆位點(diǎn)BamHⅠ,EcoRⅠ,SmaⅠ,SalⅠ,XhoⅠ,NotⅠ)購(gòu)自美國(guó)GE公司。

    二、酶和試劑

    限制性內(nèi)切酶、T4連接酶、Pyrobest DNA聚合酶均購(gòu)自日本TaKaRa公司,谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(anti-GST)鼠單抗購(gòu)自美國(guó)Santa Cruse公司,辣根過(guò)氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的兔抗鼠二抗購(gòu)自美國(guó)promega公 司,異 丙 基-β-D-硫 代 吡 喃 半 乳 糖 苷(IPTG)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、氨芐青霉素、還原性谷胱甘肽購(gòu)自鼎國(guó)生物公司,Glutathione Sepharose 4B購(gòu)自美國(guó)GE公司,電化學(xué)發(fā)光液(electrochemiluminescence,ECL)購(gòu)自美國(guó)Pierce公司。

    三、Rv3803c、Rv3846基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建、表達(dá)和純化方法

    (一)基因克隆和鑒定

    以H37Rv基因組DNA為模板分別擴(kuò)增Rv3803c、Rv3846。

    Rv3803c上 游 引 物:5′-GTACATGGATCCATGAAGGGTCGGTCGGCGCTGCTGC-3′; 下游引物:5′-GTACATCTCGAGTTAGCGGATCGCACCGACGATATCG-3′。

    Rv3846上 游 引 物:5′-GTACATGGATCCATGGCCGAATACACCTTGCCAGACC-3′; 下游 引 物:5′-GTACATCTCGAGTCAGCCGAATATCAACCCCTTGGTC-3′。

    Rv3803c的PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件:94℃3min,94℃ 30s,65℃ 1min,72℃ 70s,30個(gè)循環(huán);Rv3846的PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件:94℃3min,94℃30s,62℃1min,72℃1min,30個(gè)循環(huán)。

    PCR產(chǎn)物經(jīng)BamHⅠ、XhoⅠ內(nèi)切酶酶切之后,1%瓊脂糖凝膠電泳后回收目的條帶,T4連接酶連接到表達(dá)載體 pGEX-6P-1,轉(zhuǎn)化到E.coliTOP10中,送美國(guó)Invitrogen公司中國(guó)分部測(cè)序。

    (二)重組質(zhì)粒的構(gòu)建和誘導(dǎo)表達(dá)

    把測(cè)序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coli Rosetta中,準(zhǔn)備表達(dá)重組蛋白。挑單克隆于5ml含50μg/ml氨芐青霉素的LB(lysogeny broth,溶菌肉湯)培養(yǎng)基中過(guò)夜活化培養(yǎng),第二天以1∶100的體積接種到200ml含50μg/ml氨芐青霉素的新鮮LB培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)至A600=0.5~0.6時(shí),加入終濃度為0.4mmol/L的IPTG,16℃誘導(dǎo)培養(yǎng)8h。

    (三)重組蛋白免疫印跡(Western blot)鑒定

    1.免疫印跡鑒定:取大約1個(gè)A600量(1×109)的菌,超聲破菌(100W 功率,超聲發(fā)射5s,靜止10s,連續(xù)進(jìn)行5min),4℃,20 000g離心15min,分開(kāi)上清液和沉淀;為了檢測(cè)目的蛋白在上清(可溶)還是沉淀(包涵體)中,上清和沉淀分別加入等量的電泳上樣緩沖液,沸水浴煮6min。取5μl進(jìn)行SDS-PAGE(十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠)電泳。電泳后半干轉(zhuǎn)膜(15V,45min)。轉(zhuǎn)印后的PVDF(聚偏氟乙烯)膜用含5%脫脂奶粉的PBS(磷酸鹽緩沖液)室溫封閉1h,anti-GST單抗1∶2000室溫標(biāo)記1h,HRP偶聯(lián)的兔抗鼠二抗1∶5000標(biāo)記1h,加入ECL液顯影。

    2.考馬斯亮藍(lán)染色鑒定:純化蛋白和BSA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳后的SDS-PAGE膠用考馬斯亮藍(lán)染液過(guò)夜染色,然后用脫色液脫色至條帶清晰出現(xiàn)。

    3.表達(dá)產(chǎn)物的純化:3000g離心10min,收集誘導(dǎo)后的菌體,10ml含2mmol PMSF的PBS重懸,超聲破菌(100W功率,超聲發(fā)射5s,靜止10s,連續(xù)進(jìn)行5min);4℃,20 000g離心15min,上清液加入100μl Glutathione Sepharose 4B微珠,4℃孵育12h。4℃,500g離心5min收集微珠,用含1%tritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚-100)的PBS液洗3次,最后用含10mmol/L還原性谷胱甘肽的50mmol/L pH8.0的Tris-HCl(三羥甲基氨基甲烷)洗脫蛋白。

    結(jié) 果

    1.Rv3803c、Rv3846基因擴(kuò)增結(jié)果:以 H37Rv為模板,分別擴(kuò)增得到大約900bp、600bp的基因片段(圖1),與Rv3803c、Rv3846基因的理論值相符。限制性內(nèi)切酶消化后,連接到pGEX-6p-1載體上,構(gòu)建pGEX-Rv3803c、pGEX-Rv3846重組質(zhì)粒。測(cè)序后與H37Rv比對(duì)顯示:重組質(zhì)粒Rv3803c、Rv3846編碼基因與H37Rv上基因核苷酸序列完全一致。

    圖1 A:Rv3803c基因PCR擴(kuò)增結(jié)果(900bp);B:Rv3846基因PCR擴(kuò)增結(jié)果(620bp)

    2.GST-Rv3803c和 GST-Rv3846重組蛋白在E.coli中表達(dá)的可溶性分析:含有重組質(zhì)粒的E.coli Rosetta用1mmol IPTG 誘導(dǎo)后,超聲破碎菌,20 000g離心15min,分開(kāi)上清液(可溶性部分)和沉淀(包涵體),等體積加入上樣緩沖液,Western blot鑒定。GST-Rv3803c和 GST-Rv3846兩個(gè)重組蛋白在上清液(可溶性部分)和沉淀(包涵體)中的含量大致相等(圖2),故其在E.coli Rosetta中的存在形式均為可溶部分約50%,包涵體形式約50%,相對(duì)分子質(zhì)量分別約為56 000和45 000。

    圖2 GST-Rv3803c和GST-Rv3846融合蛋白在E.coli中表達(dá)的可溶性分析

    3.重組蛋白純化結(jié)果鑒定:含有重組質(zhì)粒的E.coli Rosetta誘導(dǎo)并超聲破碎的上清液與Glutathione Sepharose 4B微珠孵育,親和純化目的重組蛋白。純化后的目的重組蛋白進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色(圖3A)和 Western blot(圖3B)鑒定。有完整的融合蛋白被純化出來(lái),純化的GST-Rv3803c、GST-Rv3846樣品純度90%以上,但由于GST-Rv3803c純化后降解較嚴(yán)重,最終只能得到10%未降解的完整蛋白。完整的GST-Rv3803c的濃度大約為0.1mg/ml,完整的GST-Rv3846的濃度大約為0.5mg/ml。相當(dāng)于每升E.coli Rosetta培養(yǎng)物中,GST-Rv3803c產(chǎn)量為:0.25mg/L、GST-Rv3846產(chǎn)量為1.25mg/L。

    圖3 A:GST-Rv3803c和GST-Rv3846融合蛋白親和純化及考馬斯亮藍(lán)染色鑒定;B:GST-Rv3803c和GST-Rv3846融合蛋白親和純化及 Western blot鑒定

    討 論

    近年來(lái),結(jié)核分枝桿菌分泌性蛋白的相關(guān)研究一直備受關(guān)注。目前對(duì)多種分泌性蛋白的研究發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)期分泌的蛋白,如MPT51、SodA等在結(jié)核感染免疫中發(fā)揮了重要作用,為構(gòu)建保護(hù)性疫苗提供了新的思路。

    MPT51蛋白的編碼基因是Rv3803c,又稱fbpC1。其相對(duì)分子質(zhì)量約為27 000,是一種非催化性的α/β水解酶,且與Ag85復(fù)合體有較高同源性。MiKi等[5]報(bào)道,MPT51可在小鼠的脾細(xì)胞中介導(dǎo)Ⅰ型細(xì)胞免疫。Bethunaickan等[6]以重組Rv3803c為抗原對(duì)結(jié)核患者IgG、IgA、IgM水平進(jìn)行檢測(cè),IgG特異度為98%,IgG+I(xiàn)gA敏感度為71%,均顯著高于健康對(duì)照組,具有一定的診斷價(jià)值。Siev等[7]發(fā)現(xiàn),HIV感染和未感染的結(jié)核和非結(jié)核患者中,抗MPT51的抗體檢測(cè)在血清和血漿樣品中顯著相關(guān)。此外,MPT51作為候選蛋白在構(gòu)建疫苗中的免疫學(xué)作用也受到關(guān)注。Silva等[8]發(fā)現(xiàn)重組MPT51/CpG的DNA疫苗接種能夠?yàn)榻Y(jié)核感染小鼠模型提供一定的保護(hù)作用。Wang等[9]的研究也表明,其在結(jié)核感染中發(fā)揮關(guān)鍵的保護(hù)作用。因此,純化出MPT51,可為進(jìn)一步探討其輔助診斷價(jià)值、構(gòu)建保護(hù)性疫苗等做出必要準(zhǔn)備。

    超氧化物歧化酶(SOD)是需氧微生物普遍存在的一種催化超氧自由基轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化氫的金屬酶。結(jié)核分枝桿菌中有2種SOD,其中SodA由Rv3846基因編碼,對(duì)病原體有明顯的保護(hù)作用。研究發(fā)現(xiàn)SodA的分泌依賴一種輔助分泌因子Sec2,此種Sec2依賴性的蛋白輸出方式參與某種特異性分泌系統(tǒng),是結(jié)核分枝桿菌逃避宿主Mφ氧化攻擊的毒力機(jī)制之一[10]。結(jié)核感染動(dòng)物模型中,降低結(jié)核分枝桿菌SOD的產(chǎn)生,可加快單核細(xì)胞向肺部浸潤(rùn)及細(xì)胞凋亡,提示SOD在結(jié)核致病過(guò)程中發(fā)揮重要作用[11]。Khera等[12]發(fā)現(xiàn)表達(dá) SOD 的 DNA 疫苗能產(chǎn)生較高水平的IFN-γ,且保護(hù)作用最強(qiáng)。新近文獻(xiàn)報(bào)道,SodA在BCG中的過(guò)量表達(dá)可導(dǎo)致BCG的免疫效力喪失[13]。以上各項(xiàng)結(jié)果說(shuō)明純化鑒定分泌抗原SodA,對(duì)深入研究SodA的分子致病機(jī)制,探討其作為疫苗候選蛋白的可能性建立了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

    本研究以pGEX-6P-1為載體,在E.coli Rosetta菌中誘導(dǎo)表達(dá),其補(bǔ)充了E.coli缺乏的6種稀有密碼子(AUA,AGG,AGA,CUA,CCC,GGA)對(duì)應(yīng)的tRNA,可明顯提高外源基因在原核系統(tǒng)中的表達(dá)水平。采用GST標(biāo)簽親和層析法成功純化出了GST-Rv3803c和GST-Rv3846蛋白,以期進(jìn)一步探討結(jié)核分枝桿菌分泌性蛋白MPT51、SodA在與宿主巨噬細(xì)胞相互作用時(shí),Toll樣受體、細(xì)胞凋亡等相關(guān)信號(hào)通路變化,以及細(xì)胞因子相關(guān)免疫平衡等分子免疫機(jī)制及其在結(jié)核防治轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用。

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