秸稈纖維素降解真菌QSH3－3的篩選及其特性研究

劉爽，范丙全

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所，北京100081)

農(nóng)作物秸稈是我國農(nóng)業(yè)上最豐富的有機(jī)質(zhì)資源，同時(shí)也是我國年產(chǎn)量最多的農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，我國每年農(nóng)作物秸稈產(chǎn)出量達(dá)到7～8億噸。農(nóng)作物秸稈結(jié)構(gòu)復(fù)雜，短期內(nèi)不易自然腐解，利用效率低，尤其在種植業(yè)為主的地區(qū)，作物秸稈已經(jīng)成為生產(chǎn)中的障礙。加快秸稈的腐熟，解決農(nóng)業(yè)主產(chǎn)區(qū)的秸稈問題成為國內(nèi)外科學(xué)家的研究熱點(diǎn)，而秸稈纖維素降解菌在加快秸稈腐解方面發(fā)揮著重要作用［1］。

自然界中能分解纖維素的有細(xì)菌、放線菌和真菌。文獻(xiàn)報(bào)道的細(xì)菌主要有纖維粘菌(Cytophaga)和纖維桿菌(Cellulomonas)等［2］，細(xì)菌所產(chǎn)纖維素酶酶系單一，主要是內(nèi)切酶，多為胞內(nèi)酶，產(chǎn)量也不高，且多數(shù)結(jié)合在細(xì)胞膜上，菌體細(xì)胞需吸附在纖維素上才能起作用，使用很不方便，酶的分離提取也較困難［3］。具有降解纖維素能力的放線菌主要有纖維放線菌(Acidothermus cellulolyticus)、諾卡氏菌屬(Ncardia)和鏈霉菌屬(Streptomyces)，但放線菌產(chǎn)量極低，所以研究很少［4－6］。真菌由于具有較高的胞外酶活性且其酶種類比較全面使其有很強(qiáng)的纖維素降解能力，因此對(duì)其的研究報(bào)道比較多。其中主要以 木 霉 屬 (Trichoderma)［7－9］、曲 霉 屬 (Aspergillus)［10－11］、青霉(Penicillium)［12－13］為主，木霉屬所產(chǎn)纖維素酶的組分比較齊全，但存在β－葡萄糖苷酶活性較低，產(chǎn)酶速度慢，作用pH范圍窄，耐低溫性差等問題［14］;黑曲霉是優(yōu)良的產(chǎn)β－葡萄糖苷酶菌株，但酶系組分較為單一［15］;青霉屬(Penicillium)中的一些種類不僅能分泌組成齊全、酶活較高的纖維素降解酶系，而且具有易培養(yǎng)、生長快的優(yōu)勢［16］，但由于之前研究較少，對(duì)其所產(chǎn)纖維素酶系需要更全面、深入的認(rèn)識(shí)。因而，目前研究的纖維素降解真菌菌株存在產(chǎn)酶組分系不全、活性不穩(wěn)定、產(chǎn)酶速度較慢、作用pH范圍窄、特別是產(chǎn)酶溫度要求高等問題，限制了其在田間，特別是北方低溫地區(qū)對(duì)秸稈的促熟作用，獲取高效降解秸稈纖維素的微生物菌株是解決秸稈還田的關(guān)鍵因素。本文擬從低溫高腐殖質(zhì)環(huán)境中篩選在常溫、低溫下具有產(chǎn)纖維素酶能力的青霉屬真菌菌株，并對(duì)其產(chǎn)酶特性和酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，以期為常溫、低溫條件下農(nóng)作物秸稈的還田利用提供菌種資源和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1．1 土壤樣品的采集 土壤、腐殖質(zhì)落葉層樣品取自小興安嶺原始林區(qū)及黑龍江農(nóng)墾集團(tuán)多年秸稈還田的土壤。

1.1．2 培養(yǎng)基［17］(1)赫奇遜氏(Huchinson)無機(jī)鹽培養(yǎng)基：KH2PO41.0 g，NaCl 0.1 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，NaNO32.5 g，F(xiàn)eCl30.01 g，CaCl20.1 g，水1000 mL，pH 7.2左右。(2)濾紙培養(yǎng)基：赫奇遜氏無機(jī)鹽培養(yǎng)基中添加圓形濾紙片。(3)羧甲基纖維素鈉(CMc-Na)平板培養(yǎng)基：CMc-Na 10.0 g，200 g去皮馬鈴薯汁1000 mL，瓊脂18 g，加蒸餾水至pH 7.2左右。(4)種子培養(yǎng)基：采用馬鈴薯–蔗糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基。(5)液體發(fā)酵培養(yǎng)基：KH2PO41.0 g，NaCl 0.1 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，NaNO32.5 g，F(xiàn)eCl30.01 g，CaCl20.1 g，秸稈木質(zhì)纖維素50 g或0.5% 的其他碳源，水1000 mL，pH為7.2～7.4。

上述培養(yǎng)基均在121℃，1.01 ×105Pa條件下滅菌30 min備用。

1.1．3 秸稈纖維素的制備 將玉米秸稈剪成2～3 cm小段，烘干后粉碎至0.25 mm，加入2 mol/L的氫氧化鈉溶液，在室溫浸泡12 h，水洗至pH為中性，烘干備用。

1.1．4 主要試劑及儀器 試劑：DNS試劑，檸檬酸緩沖液，燕麥木聚糖(Sigma公司)，羧甲基纖維素鈉(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);新華定性濾紙。儀器：分光光度計(jì)、分析天平、恒溫?fù)u床、恒溫水浴箱、離心機(jī)。

1.2 測定項(xiàng)目與方法

1.2.1 秸稈降解菌的篩選 直接接種腐殖土粒及腐殖落葉于赫奇遜氏培養(yǎng)基上(培養(yǎng)基凝固后在瓊脂表面放一張滅菌無淀粉濾紙)［8］富集培養(yǎng)，15℃培養(yǎng)20 d后，挑取生長旺盛且使得濾紙變薄或透明的真菌菌落進(jìn)行純化和保種。再將純化過的菌株分別點(diǎn)接到CMc-Na初篩培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d，采用剛果紅染色法染色，挑取有透明圈的菌株接入到液體濾紙培養(yǎng)基中進(jìn)行復(fù)篩，選取24 h內(nèi)可以將濾紙消解的菌株進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶試驗(yàn)，選取產(chǎn)酶量高的菌株。

1.2.2 秸稈降解菌的鑒定形態(tài)鑒定：將菌株接種到PDA固體培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)7 d后，觀察菌落形態(tài)并鏡檢其產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)和菌絲形態(tài)，根據(jù)《真菌鑒定手冊》［18］和《中國真菌志》［19］進(jìn)行鑒定。分子生物學(xué)鑒定：采用rDNA ITS基因序列分析［20］。取培養(yǎng)24 h 菌絲體，提取 DNA［21－22］后，擴(kuò)增引物 ITS1(5’－GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG －3’)和 ITS4(5’－TCCTCCGCTTATTGATATGC －3’)，進(jìn)行 18S rDNA的擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)上海生工生物技術(shù)有限公司測序后，將獲得的序列與GenBank中已知真菌的18S rDNA序列進(jìn)行比對(duì)。并利用MEGA4.1進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。PCR反應(yīng)體系為50 μL，反應(yīng)條件為 94℃ 5 min，94℃ 30 s，57℃ 50 s，72℃50 s，循環(huán)30 次;72℃ 10 min。

1.2.3 秸稈降解菌產(chǎn)酶特性分析 將篩選到的菌種在PDA上進(jìn)行純培養(yǎng)7 d，用無菌水將孢子洗下，制成孢子懸液(1×107/mL)。然后按1%的接種量將孢子懸液加入到100 mL(300 mL的三角瓶)pH為7的赫奇遜氏液體培養(yǎng)基中，碳源為0.5%堿處理的玉米秸稈粉，25℃、170 r/min培養(yǎng)，分別在第1、2、3、4、5、6、7 和 8 d 取樣測定粗酶液中的內(nèi)切酶活力(CMCase)、濾紙酶活力(FPase)、和木聚糖酶活力(Xylanase)。根據(jù)菌株產(chǎn)酶時(shí)間變化趨勢，接種1%的孢子懸液到100 mL(300 mL的三角瓶)pH為7的赫奇遜氏液體培養(yǎng)基中，研究不同碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響時(shí)，其中碳源為不同結(jié)構(gòu)的纖維素［0.5%羧甲基纖維素(CMC)、微晶纖維素(MCC)、玉米秸稈粉(CS)以及堿處理的玉米秸稈粉(APCS)］;研究不同氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響時(shí)，以堿處理的玉米秸稈粉為碳源，以0.2% 蛋白胨，(NH4)2SO4，(NH2)2CO和NH4NO3替換NaNO3作為單一氮源;在最佳碳源、氮源條件下，研究不同起始 pH(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 和10.0)、接種量(1%、3%、5%、7%和9%)和溫度(10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃)對(duì)產(chǎn)酶的影響，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，25℃、170 r/min培養(yǎng)4 d，離心，取上清液測定內(nèi)切酶、濾紙酶和木聚糖酶。

1.2.4 酶學(xué)穩(wěn)定性分析 接種1%的孢子懸液到100 mL(300 mL的三角瓶)pH為7的赫奇遜氏液體培養(yǎng)基中，以堿處理的玉米秸稈粉為碳源，25℃、170 r/min培養(yǎng)4 d，離心，取上清獲得粗酶液。將0.5 mL 粗酶液加入到 pH 值為 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0的1.5 mL緩沖液中，45℃保溫1 h，測定濾紙酶、內(nèi)切酶和木聚糖酶。將0.5 mL粗酶液加入到pH值5.0的1.5 mL緩沖液中，在40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃ 各溫度下保溫 1 h后，測定內(nèi)切酶、濾紙酶和木聚糖酶。

1.2.5 纖維素酶、木聚糖酶活力的測定 發(fā)酵液離心10 min(4000 r/min)，取上清液作為粗酶液。用DNS法測定粗酶液中內(nèi)切酶、濾紙酶和木聚糖酶活力［23－26］。內(nèi)切酶和濾紙酶單位定義為每mL每min產(chǎn)生1 μg的葡萄糖所需要的酶量定義為一個(gè)酶活單位(U)［27］，木聚糖酶單位定義為每mL每min產(chǎn)生1 μg的木糖所需要的酶量定義為一個(gè)酶活單位(U)［28］。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel(2003)和SPSS V17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，LSD法檢驗(yàn)差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素降解低溫菌的篩選

從東北地區(qū)的低溫土壤樣品中，經(jīng)富集、初篩得到12株真菌，能夠在15℃條件下以濾紙為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長良好，而且將濾紙完全降解。再將菌株接種到以CMC為唯一碳源加入剛果紅的無機(jī)鹽培養(yǎng)基上，以透明圈直徑大小為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行復(fù)篩，獲得效果最好菌株QSH3－3。

2.2 產(chǎn)纖維素酶菌株的鑒定

2．2．1 形態(tài)特征顯示 QSH3－3菌株所形成菌落在PDA平板上先以白色絮狀輪生，待長出青綠色孢子后，孢子會(huì)向四面散射，在平板上形成許多菌落。隨培養(yǎng)時(shí)間延長，孢子變成暗綠色。菌落平坦，質(zhì)地絨狀。菌落背面呈黃綠色。挑取孢子與菌絲體在顯微鏡下觀察，分生孢子梗帚狀分支，最末級(jí)的瓶狀小枝上生出成串的分生孢子。孢子透明，呈卵圓形，光滑，約4 μm ×5 μm。

2．2．2 ITS序列分析 提取菌株QSH3－3 DNA后，利用ITS通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增并驗(yàn)證得到的片段測序，然后經(jīng)過DNASTAR軟件校正拼接，獲得572 bp的核苷酸序列。將獲得的序列在Gen-Bank上進(jìn)行同源性比較，發(fā)現(xiàn)該序列與青霉菌的序列同源性＞98%，利用MEGA4.1的Neighbor-Joining進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，結(jié)果如圖1，遺傳距離顯示菌株QSH3－3與青霉遺傳距離最近。結(jié)合形態(tài)觀察，初步確定菌株QSH3－3屬于青霉屬中的草酸青霉(Penicillium oxalicum)。

2.3 不同條件對(duì)菌株QSH3－3產(chǎn)酶效果的影響

2.3.1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響 將菌株QSH3－3按1%接種量接入到液體培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)(170 r/min，25℃)，每隔1 d取樣測定濾紙酶、內(nèi)切酶、木聚糖酶。結(jié)果顯示，濾紙酶、內(nèi)切酶、木聚糖酶在培養(yǎng)2 d時(shí)酶活力分別達(dá)到9 U，24 U，487 U，到4 d時(shí)均達(dá)到最高，分別為11 U，27 U，550 U，之后酶活緩慢下降。菌株在培養(yǎng)2～6 d，殘余酶活力達(dá)80%以上(圖2)。在之后考察各種因子對(duì)產(chǎn)酶影響效果時(shí)，均測定發(fā)酵培養(yǎng)4 d后粗酶液的酶活力。

2.3.2 不同碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響 以不同結(jié)構(gòu)的纖維素［0.5% 羧甲基纖維素(CMC)、微晶纖維素(MCC)、玉米秸稈粉(CS)以及堿處理的玉米秸稈粉(APCS)］為底物，研究碳源對(duì)菌株QSH3－3產(chǎn)酶的影響(表1)。堿處理玉米秸稈粉處理的產(chǎn)酶效果最佳，濾紙酶、內(nèi)切酶、木聚糖酶分別達(dá)到11 U、27 U、550 U，其次為天然的玉米秸稈粉，羧甲基纖維素和微晶纖維素產(chǎn)酶效果較差。以堿處理的玉米秸稈粉比玉米秸稈粉為底物的濾紙酶、內(nèi)切酶和木聚糖酶分別提高57.1%、28.6%和62.7%;比以MCC為底物的分別提高36.3%、46.1%和136.1%;比以CMC為底物的分別提高了22.2%、92.9%和957.7%。

2.3.3 不同氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響 發(fā)酵液體培養(yǎng)基中分別添加0.2%的蛋白胨，硫酸銨，脲，硝酸銨作為單一氮源，碳源均為堿處理的玉米秸稈粉，接種量為1%，發(fā)酵培養(yǎng)(170 r/min，25℃)，4 d后測定濾紙酶、內(nèi)切酶、木聚糖酶。結(jié)果顯示，蛋白胨為氮源時(shí)，濾紙酶、內(nèi)切酶、木聚糖酶酶活力最大，分別達(dá)到11.2 U、26.6 U和582.8 U(表2);硫酸銨作為氮源時(shí)，濾紙酶、內(nèi)切酶、木聚糖酶三種酶活性與蛋白胨作為氮源的處理沒有明顯差異，但與脲作氮源相比，濾紙酶、內(nèi)切酶、木聚糖酶分別高了 28.6%、62.3%、178.7%，差異顯著;與硝酸鈉作氮源相比分別高了約3.8%、1.2%和4.1%?？紤]成本因素，本研究選擇硫酸銨為草酸青霉QSH3－3產(chǎn)酶培養(yǎng)的氮源。

表1 同碳源對(duì)產(chǎn)濾紙酶、內(nèi)切酶和木聚糖酶活力的影響(U)Table 1 The effect of carbon sources on FPase，CMCase and xylanase production

表2 不同氮源對(duì)產(chǎn)濾紙酶、內(nèi)切酶和木聚糖酶活力的影響(U)Table 2 The effect of nitrogen sources on FPase，CMCase and xylanase production

2.3.4 不同起始pH對(duì)產(chǎn)酶的影響 將菌株QSH3－3按1% 接種量接入到4～9的不同起始pH的液體培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)(170 r/min，25℃)，結(jié)果表明，初始pH值在4～9的液態(tài)發(fā)酵條件下，菌株都能很好的生長，而且濾紙酶、內(nèi)切酶和木聚糖酶三種酶活力表現(xiàn)相同規(guī)律，隨著起始pH值升高酶活力升高，到pH值為7.0時(shí)，達(dá)到最大，其后逐漸下降(圖3)。在初始pH值為7的條件下，濾紙酶、內(nèi)切酶、木聚糖酶分別約為11 U、28 U、576 U，比初始pH值為4時(shí)分別高約30.2%、24.0%、22.8%;比初始pH值為9時(shí)分別高約19.0%、18.1%、18.2%。初始pH值在4～9范圍內(nèi)，三種酶活力均可達(dá)到最適起始pH值為7時(shí)酶活力的70%以上。

圖3 起始pH對(duì)產(chǎn)濾紙酶、內(nèi)切酶和木聚糖酶活力的影響Fig．3 The effect of initial pH on FPase，CMCase and xylanase production

2.3.5 不同接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響 將菌株按1%、3%、5%、7%和9% 的接種量(107/mL菌懸液)分別接入到液體培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)(pH 7，170 r/min，25℃)。結(jié)果顯示，濾紙酶、內(nèi)切酶、木聚糖酶在接種量分別為5%、5% ～7%和5%時(shí)，酶活達(dá)到最大(表 3)，分別達(dá)到11.8U、28.2U、593.0 U，與接種量為1%時(shí)相比，濾紙酶、內(nèi)切酶、木聚糖酶分別高出9.3%、8.0%和4.3%，比接種量為9%時(shí)分別高出37.2%、16.1%和4.9%。接種量小于5%或者大于5%，菌株所產(chǎn)三種酶的酶活均不能達(dá)到最高值。只有接種量在一定范圍內(nèi)才能保證菌株的最大產(chǎn)酶量。本試驗(yàn)以5%接種量最佳，在此條件下，濾紙酶、內(nèi)切酶、木聚糖酶酶活力達(dá)到最大。

2.3.6 不同培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響 溫度是影響產(chǎn)纖維素酶菌株活力的重要因素之一，培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)酶有較大的影響。將菌株QSH3－3按5%接種量接入到液體培養(yǎng)基中，于 10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，4 d后測定濾紙酶、內(nèi)切酶、木聚糖酶。結(jié)果表明，產(chǎn)酶溫度在10℃～30℃范圍內(nèi)，酶活力隨溫度升高酶活逐漸增大，產(chǎn)酶溫度在30℃ ～45℃范圍內(nèi)，酶活力隨溫度升高迅速下降，當(dāng)產(chǎn)酶溫度為30℃時(shí)對(duì)菌株產(chǎn)酶最為有利，濾紙酶、內(nèi)切酶、木聚糖酶分別達(dá)到12 U、30 U、605 U，且該菌株最大優(yōu)勢是在15℃條件下濾紙酶、內(nèi)切酶、木聚糖酶即可達(dá)到最大酶活力的73.9%、78.9%和80.6%(圖4)。該研究結(jié)果顯示了該菌株在低溫條件下對(duì)秸稈纖維素類物質(zhì)的降解潛力。

表3 接種量對(duì)濾紙酶、內(nèi)切酶和木聚糖酶產(chǎn)酶活力的影響(U)Table 3 The effect of inoculation volume on FPase，CMCase and xylanase production

2.4 酶學(xué)穩(wěn)定性

2.4.1 酶的pH穩(wěn)定性 將菌株QSH3－3在最佳產(chǎn)酶條件下的粗酶液分別置于pH值在3～10范圍內(nèi)的緩沖液中，室溫保持1 h后，測定內(nèi)切酶、濾紙酶和木聚糖酶。結(jié)果顯示，在pH 4～9范圍內(nèi)，酶活力保持穩(wěn)定，內(nèi)切酶殘余酶活力達(dá)到70%以上;濾紙酶和木聚糖酶殘余酶活力達(dá)到85%以上(圖5)。該菌株所產(chǎn)的內(nèi)切酶、濾紙酶和木聚糖酶具有較強(qiáng)的pH穩(wěn)定性。

2.4.2 酶的熱穩(wěn)定性將菌株QSH3－3在最佳產(chǎn)酶條件下的粗酶液分別在 40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃的不同溫度下保溫1 h后，測定內(nèi)切酶、濾紙酶和木聚糖酶。由圖6可以看出，三種酶的酶活力規(guī)律一致，隨著溫度的升高其活性逐漸降低。內(nèi)切酶、濾紙酶和木聚糖酶在65℃時(shí)，分別只有45℃條件下的40%、53%和13%(圖6)。內(nèi)切酶和濾紙酶在40～50℃之間酶活保持穩(wěn)定，在50℃以上，酶活力迅速下降，木聚糖酶在40～45℃之間酶活保持穩(wěn)定，45℃以上，酶活力迅速下降。該菌株所產(chǎn)內(nèi)切酶、濾紙酶和木聚糖酶的耐熱性較差。

圖6 不同溫度條件下濾紙酶、內(nèi)切酶和木聚糖酶活力的穩(wěn)定性Fig．6 Thermal stability of FPase，CMCase and xylanase activities

3 討論

秸稈成分復(fù)雜，在高溫堆腐條件下，較易腐解，而秸稈的應(yīng)用難題在于農(nóng)田大規(guī)模秸稈的降解，其腐解溫度低，需要篩選常溫或低溫條件下能夠產(chǎn)生高活性的纖維素、半纖維素酶菌株加快秸稈腐熟，已報(bào)道的產(chǎn)纖維素酶菌株對(duì)其產(chǎn)酶適宜溫度的研究大多都在25℃以上，且具有較高產(chǎn)酶能力的溫度范圍一般都在 25 ～35℃范圍內(nèi)［29－30］，低溫條件下產(chǎn)酶能力相當(dāng)較弱，不利于在田間溫度較低條件下發(fā)揮作用。王希國等［29］研究了不同培養(yǎng)溫度對(duì)梅林青霉下的產(chǎn)纖維素酶的影響，在24℃時(shí)，殘余纖維素酶活力約為40% ～60%，而本實(shí)驗(yàn)篩得的菌株QSH3－3在15℃時(shí)即可產(chǎn)生的酶活力較高，殘余酶活力可以達(dá)到70%以上，這對(duì)在地溫較低的田間秸稈原位還田具有重要意義。另外，田間環(huán)境中酸堿差異較大，南方土壤一般呈偏酸性，北方土壤一般呈偏堿性，菌株不能保持在中性環(huán)境下進(jìn)行生長，而目前篩得的菌株產(chǎn)酶的最適pH條件一般均為偏酸性，王儀明等［30］研究表明綠色木霉產(chǎn)纖維素酶的適宜pH在5～6.5范圍內(nèi)，培養(yǎng)基起始pH 7.5時(shí)纖維素酶的產(chǎn)量大大下降。史玉英等［31］分離的纖維素分解菌群，對(duì)濾紙、膨化稻草等自然纖維素表現(xiàn)出較強(qiáng)的分解能力，但培養(yǎng)4 d后由于pH失調(diào)而反應(yīng)終止。菌株產(chǎn)酶的pH范圍窄限制了其在田間的推廣應(yīng)用。所篩菌株QSH3－3在pH 4～9范圍內(nèi)，均可保持較強(qiáng)的產(chǎn)纖維素酶的能力，且該菌株所產(chǎn)纖維素酶、木聚糖酶均具有較強(qiáng)的pH耐受力。因而菌株QSH3－3該菌株在田間溫差大、土壤偏堿性等復(fù)雜條件下對(duì)秸稈纖維素類物質(zhì)的降解具有較高的應(yīng)用潛力。

4 結(jié)論

本研究在15℃下篩選到1株產(chǎn)纖維素酶真菌QSH3－3，經(jīng)鑒定為草酸青霉Penicillium oxalicum。該菌株以堿處理過的玉米秸稈粉為碳源，硫酸銨為氮源，起始pH為7，接種量5%，30℃下培養(yǎng)4 d，濾紙酶、內(nèi)切酶、木聚糖酶分別達(dá)到約12 U、30 U、605 U，其中木聚糖酶是已報(bào)道的最大酶活為216 U的長梗木霉E3菌株［32］的2.8倍，最大酶活387 U赭綠青霉Sp1［33］的1.56倍，最大酶活136.9 U的粗糙脈孢菌［34］的4.4倍，濾紙酶、內(nèi)切酶與目前報(bào)道的酶活力一致。

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