鋁對茶樹生長與生理特性影響的研究

于翠平，潘志強(qiáng)，陳杰，范冬梅，王校常

(浙江大學(xué)茶葉研究所，浙江杭州310058)

鋁是地殼中分布最廣，含量最高的金屬元素，約占地殼質(zhì)量的7%［1］。鋁在土壤中的存在形式一般為硅酸鹽或者氧化物，對植物無毒害，但當(dāng)土壤酸化，pH低于5.0時(shí)鋁就會(huì)大量釋放出來以離子形式存在，從而對植物的生長發(fā)育產(chǎn)生毒害作用［2］。鋁毒已經(jīng)成為酸性土壤上植物生長最重要的限制因素之一［2－3］。與許多大田作物相反，鋁對茶樹來說是一種比較特殊的元素，茶樹體內(nèi)富集了大量的鋁，老葉中的鋁含量高達(dá)1% ～2%［4］。一定濃度下的鋁對茶樹不僅沒有毒害，反而對其生長發(fā)育具有一定的促進(jìn)作用。早在1955年，Chenery就通過田間試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了鋁對茶樹生長發(fā)育的促進(jìn)效應(yīng)［5］，隨后很多相關(guān)研究陸續(xù)展開并進(jìn)一步證實(shí)了這一作用［6－10］。

茶樹作為一種典型的聚鋁植物，其聚鋁耐鋁機(jī)制受到廣泛關(guān)注。目前茶樹耐鋁機(jī)制研究大部分集中在生理學(xué)領(lǐng)域［11－12］，尚缺乏分子水平的研究。要從根本上闡明茶樹耐鋁機(jī)制，了解茶樹耐鋁的遺傳機(jī)制非常關(guān)鍵。茶樹對鋁的積累因品種不同而有所差異已有所報(bào)道［6］，也就是說不同品種茶樹耐鋁毒能力存在一定差異，但極少有相關(guān)品種耐鋁或者缺鋁基因型差異方面的研究。鑒于茶葉品種繁多，生長周期長等原因，在前期的預(yù)培養(yǎng)試驗(yàn)中，平陽特早和烏牛早生長對鋁的反應(yīng)表現(xiàn)出明顯的差異。因此，本試驗(yàn)以這兩個(gè)品種為試驗(yàn)材料，通過研究鋁對兩個(gè)品種生長及生理反應(yīng)特性的影響，初步了解不同茶樹品種對鋁的生理反應(yīng)的差異，為進(jìn)一步了解茶樹鋁反應(yīng)的基因型差異提供一定的研究基礎(chǔ)，進(jìn)而為今后了解茶樹耐鋁機(jī)制提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試茶苗為烏牛早(WNZ)和平陽特早(PYTZ)2009年秋季扦插苗。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2010年7月至2010年10月在浙江大學(xué)華家池校區(qū)實(shí)驗(yàn)農(nóng)場溫室內(nèi)進(jìn)行。選擇長勢一致的茶苗，用蒸餾水洗根后，培養(yǎng)在黑色有蓋的塑料盆中。每盆種植5株，重復(fù)3次。先用1/2營養(yǎng)液預(yù)培養(yǎng)兩周后采用完全營養(yǎng)液，營養(yǎng)液配方參照文獻(xiàn)［13］，組成分別為(mmol/L)：(NH4)2SO40.713、NH4NO30.73、KH2PO40.1、K2SO40.46、CaCl20.5、MgSO40.41、Fe-EDTA 0.032、H3BO30.046、CuSO40.002、MnSO40.09、Na2MoO40.0026、ZnSO40.0091。6周后，對茶苗進(jìn)行鋁處理，鋁以AlCl3·6H2O形式加入。以往的研究認(rèn)為0.4 mmol/L對于茶樹來說是一個(gè)比較適宜的濃度，因此本研究采用的鋁濃度為0.4 mmol/L［8］，以不加鋁處理為對照。每天調(diào)節(jié)pH至5.0。采用通氣泵通氣，7 d換一次營養(yǎng)液，處理7周后取樣進(jìn)行分析。茶樹整個(gè)植株用蒸餾水將外部鋁沖洗干凈后，分成根、莖、老葉、嫩葉四部分，于80℃烘箱內(nèi)烘干磨碎后用于各器官鋁含量的測定。取已發(fā)育成熟且無損傷的第三、四葉，洗凈擦干后立即進(jìn)行葉綠素含量、保護(hù)酶活性和丙二醛含量的測定。

1.3 分析項(xiàng)目和方法

1.3.1 茶樹各器官鋁含量的測定 稱取試樣0.50 g，置于微波消解內(nèi)管中，加硝酸6.0 mL，過氧化氫2.0 mL，轉(zhuǎn)入微波消解儀消解。消解完畢后趕酸至約1 mL，移入250 mL容量瓶，定容。移取上述試液1.00 mL于25 mL容量瓶中，依次加入6.00 mL鉻天青S(3.3×10－4mol/L)、3.00 mL乙二胺–鹽酸緩沖溶液(pH 6.8)、1.00 mL氯化十六烷基吡啶(0.01 mol/L)和0.25 mL乳化劑OP(3%)，用水稀釋至刻度，搖勻。以試劑空白作對照，在λ=630 nm波長下測定吸光值。以硫酸鋁鉀［KAl(SO4)2·12H2O］配制不同濃度鋁標(biāo)準(zhǔn)液，按照上述方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算鋁含量。

1.3.2 保護(hù)酶測定 稱取剪碎混勻的鮮葉1 g，置于預(yù)冷的研缽中，加適量預(yù)冷磷酸緩沖液(50 mmol/L，pH 7.8)和0.6 g PVP和少量石英砂，在冰浴上研磨成漿，轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，用磷酸緩沖液沖洗研缽2～3次，緩沖液定量至20 mL，4℃，4000 r/min離心15 min，取上清液保存于4℃?zhèn)溆谩３趸镝?SOD)活性的測定采用氮藍(lán)四唑(NBT)光還原法;過氧化氫酶(CAT)活性的測定采用碘量滴定法;過氧化物酶(POD)活性測定采用愈創(chuàng)木酚比色法［14］。

丙二醛含量的測定采用雙組分光光度法［14］。葉綠素含量的測定采用乙醚浸提液比色法［15］。

數(shù)據(jù)用Excel 2003和SAS 9.1進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鋁對茶樹生長發(fā)育的影響

經(jīng)過7周水培，鋁處理對兩個(gè)品種茶樹的影響明顯。缺鋁明顯導(dǎo)致茶樹長勢不良，具體表現(xiàn)為植株矮小，葉色淺綠，同時(shí)新梢伸長和發(fā)育緩慢，且較早形成駐芽;加鋁處理的茶樹則相反，新梢多為正常成熟新梢，植株生長茂盛(圖1)。鋁對茶樹根系生長的影響比地上部更為明顯。供鋁茶樹有大量新根產(chǎn)生，根色較白。缺鋁時(shí)平陽特早根系生長嚴(yán)重受阻，新根少而短;而烏牛早品種則表現(xiàn)為新根比較稀疏(圖2)。兩個(gè)品種相比較，缺鋁條件下平陽特早根系長勢明顯不良。

2.2 茶樹不同器官鋁含量差異

由表1可以看出，兩個(gè)品種不同器官間鋁含量存在差異，鋁含量由低到高依次為嫩葉＜莖＜老葉＜根。進(jìn)一步分析，各處理以烏牛早加鋁處理各器官鋁含量最高，平陽特早加鋁處理次之，平陽特早不加鋁處理最低。每個(gè)品種兩個(gè)處理之間各器官鋁含量差異均達(dá)到顯著水平。

表1 不同鋁濃度處理對茶各器官鋁含量的影響Table 1 Effects of aluminum on the contents of aluminum in different organs of tea plant

2.3 鋁對茶樹葉片葉綠素含量的影響

圖3顯示，加鋁后平陽特早和烏牛早兩個(gè)品種的葉片葉綠素含量均有不同程度的增加。平陽特早加鋁處理較不加鋁處理葉綠素a、葉綠素b和葉綠素a+b分別增加了37.36%、49.68%和41.21%;烏牛早加鋁處理較不加鋁處理分別提高了16.75%、17.42%和16.76%。加鋁和不加鋁處理平陽特早的葉綠素總量均分別高于烏牛早，但是相對于烏牛早，加鋁與不加鋁處理比較，平陽特早葉綠素總量的增加幅度要高于烏牛早。由圖3還可以看出，烏牛早和平陽特早葉綠素a含量兩個(gè)處理之間的差異均達(dá)到顯著水平;平陽特早葉綠素b含量加鋁與不加鋁處理之間差異顯著。烏牛早的葉綠素b含量加鋁后雖然有一定程度的升高，但是兩個(gè)處理之間沒有顯著差異。另外，葉綠素a含量在不加鋁條件下烏牛早顯著高于平陽特早，而加鋁后平陽特早顯著高于烏牛早。

圖3 鋁對茶樹葉綠素含量的影響Fig．3 Effects of aluminum on the chlorophyll content of leaves

2.4 鋁對茶樹葉片保護(hù)酶活性和丙二醛含量的影響

加鋁后兩個(gè)品種葉片超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)活性都有所增強(qiáng)(圖4)。平陽特早超氧化物歧化酶活性加鋁處理是不加鋁處理的1.37倍，烏牛早加鋁處理是不加鋁處理的1.25倍，二者的差異達(dá)顯著水平。兩個(gè)品種相比較，鋁對平陽特早的超氧化物岐化酶活性的促進(jìn)作用更為明顯。平陽特早加鋁處理的過氧化氫酶活性比不加鋁處理高34.04%，差異達(dá)顯著水平;加鋁處理下烏牛早過氧化氫酶活性也有一定程度提高(+14.71%)，但差異不顯著。加鋁處理后平陽特早過氧化氫酶活性的升高幅度要大于烏牛早。兩個(gè)品種的過氧化物酶活性加鋁處理分別是不加鋁處理的1.59倍和1.03倍，說明平陽特早的過氧化物酶活性對鋁的反應(yīng)更為敏感，加鋁能顯著提高該品種的過氧化物酶的活性。因此，從酶活性差異來看，平陽特早與烏牛早在對鋁的反應(yīng)上存在明顯的差異。加鋁條件下烏牛早葉片丙二醛含量略有下降;而平陽特早丙二醛含量則急劇下降，與不加鋁處理的差異達(dá)顯著水平。丙二醛含量的高低可以反應(yīng)逆境條件下植物細(xì)胞受破壞程度的大小［16］。缺鋁條件下平陽特早丙二醛含量遠(yuǎn)高于加鋁處理，說明該品種對鋁的需求更為迫切。

圖4 鋁對茶樹葉片保護(hù)酶和丙二醛含量的影響Fig．4 Effects of aluminum on protective enzymes activities and malondialdehyde content in tea leaves

3 討論

研究結(jié)果表明，鋁對茶樹的生長發(fā)育具有一定的促進(jìn)作用。施鋁后根系生長較好、新梢數(shù)量增多，植株強(qiáng)壯。另外，因根系長勢較好，提高了根系吸收養(yǎng)分以及往莖、葉運(yùn)輸養(yǎng)分的能力，滿足了茶樹生長發(fā)育對養(yǎng)分的需求。加鋁后兩個(gè)品種的葉綠素含量均有不同程度的升高，顯然鋁可以促進(jìn)葉綠素的合成。這與Chenery的研究結(jié)果是一致的［5］。葉綠素含量的多少直接影響著光合作用的強(qiáng)弱。葉綠素含量高，光合作用則會(huì)增強(qiáng)，同化物的積累也因此而提高。SOD、CAT和POD活性組成了植物體內(nèi)的保護(hù)酶系統(tǒng)，擔(dān)任著清除體內(nèi)活性氧的任務(wù)，其活性的高低可以反映植物生長環(huán)境的好壞［16］。加鋁處理后，茶樹葉片保護(hù)酶活性均有不同程度的提高，除CAT活性升高幅度較小外，SOD、POD活性與缺鋁處理差異均已達(dá)到顯著水平，保護(hù)酶活性的增強(qiáng)，可以及時(shí)的清除過氧化產(chǎn)生的自由基，防止或降低膜脂過氧化作用對細(xì)胞膜的傷害，使膜結(jié)構(gòu)和功能得以穩(wěn)定，保證了茶樹新陳代謝的進(jìn)行，增強(qiáng)了茶樹的抗逆性。作為膜脂過氧化的產(chǎn)物，丙二醛的含量高低可用來表示細(xì)胞膜脂過氧化程度和植物抗逆境能力的強(qiáng)弱，缺鋁條件下其含量增加表明植物體內(nèi)細(xì)胞受到較為嚴(yán)重的破壞［17］，茶樹此時(shí)處于脅迫狀態(tài)，由此也可以看出鋁對于茶樹來說是一種比較特殊的營養(yǎng)元素，缺鋁會(huì)使茶樹的生長發(fā)育受到一定程度的影響。鋁對茶樹的促進(jìn)作用機(jī)理的研究目前已取得了一定成果，但是還沒有最后定論，目前的研究認(rèn)為鋁可以促進(jìn)磷和鉀的吸收，可以緩解過量鎂造成的毒害［7，10］;鋁通過提高葉綠素含量［6］，增強(qiáng)了光合作用能力;鋁還可以通過提高保護(hù)酶活性或者降低脂質(zhì)過氧化程度來促進(jìn)茶樹的生長發(fā)育［13，18］。因此，可以認(rèn)為鋁促進(jìn)茶樹生長發(fā)育的機(jī)制為：鋁通過調(diào)節(jié)茶樹養(yǎng)分的吸收和提高其光合效率，以及通過提高保護(hù)酶活性以清除代謝過程中產(chǎn)生的活性氧自由基等毒害物質(zhì)，使茶樹機(jī)體新陳代謝處于比較旺盛的階段，為體內(nèi)有機(jī)物合成提供充足的碳源和氮源，從而促進(jìn)了茶樹生長發(fā)育。

從植株長勢上可以看出，加鋁處理對平陽特早的促進(jìn)作用更為明顯，新根數(shù)、新梢數(shù)明顯增多，換言之，缺鋁對平陽特早的脅迫程度要高于烏牛早。加鋁后平陽特早葉片的葉綠素a+b含量提高了41.21%，明顯高于烏牛早的16.76%。另外，試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，在不加鋁時(shí)烏牛早的葉綠素a含量顯著高于平陽特早，而施鋁后則相反。小西茂毅［19］認(rèn)為，從某種意義上來說，鋁對茶樹是一種比較特殊的營養(yǎng)元素。結(jié)合各器官中鋁含量的差異，可以大膽猜測，兩個(gè)茶樹品種有著不同的鋁營養(yǎng)遺傳機(jī)制，在相同的生長條件下烏牛早聚鋁的特性要高于平陽特早。因此在缺鋁條件下，烏牛早體內(nèi)較多的鋁仍然可以部分滿足其生長發(fā)育的需要，而平陽特早缺鋁條件下體內(nèi)各器官鋁含量均低于烏牛早，生長發(fā)育受到限制，所以其根系長勢遠(yuǎn)不如烏牛早，對養(yǎng)分的吸收也受到一定限制，進(jìn)而影響到葉綠素a的合成。葉綠素a又是葉綠素的主要成分，故平陽特早的葉綠素a和葉綠素總量均低于烏牛早。由表1同樣可以看出，供鋁條件下烏牛早各器官鋁含量要遠(yuǎn)大于平陽特早，但是長勢卻不如平陽特早，原因可能為0.4 mmol/L的鋁超過了烏牛早最適宜的鋁濃度范圍，使得其生長發(fā)育受到限制，因此影響了葉綠素a的合成。葉綠素b的變化趨勢與葉綠素a存在差異，其原因是否是因?yàn)閮蓚€(gè)品種各自特殊的遺傳機(jī)制造成，這些都還需要在以后的試驗(yàn)中進(jìn)一步驗(yàn)證。加鋁后平陽特早無論是SOD、POD，還是CAT活性，升高幅度均明顯高于烏牛早。烏牛早缺鋁處理葉片中的丙二醛含量略高于加鋁處理，而平陽特早缺鋁處理丙二醛含量顯著升高，兩個(gè)處理之間的差異已達(dá)顯著水平，也能從另外一個(gè)角度反映出了平陽特早對鋁的需求程度要高于烏牛早。另外，平陽特早超氧化物岐化酶活性均高于烏牛早，丙二醛含量低于烏牛早，而陸建良和梁月榮［20］的研究也表明，原初超氧化物岐化酶活性比較高，丙二醛含量較低的作物具有較強(qiáng)的耐酸鋁能力。由此我們推斷平陽特早和烏牛早兩個(gè)品種的耐酸鋁能力不同，很可能存在基因型的差異，同時(shí)啟發(fā)我們在今后的研究中利用耐鋁性存在差異的茶樹品種作為研究材料，然后從基因水平上研究茶樹耐鋁機(jī)理，從而為揭示茶樹耐鋁機(jī)理提供一定的實(shí)驗(yàn)材料和一定的研究基礎(chǔ)，同時(shí)為耐鋁作物選育提供依據(jù)，為最終在根本上解決酸性土壤上鋁毒害問題提供一種選擇。

［1］楊建立，何云峰，鄭紹建．植物耐鋁機(jī)理研究進(jìn)展［J］．植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào)，2005，11(6)：836－845.

Yang J L，He Y F，Zheng S J．Research progresses in aluminum tolerance mechanisms in plants ［J］．Plant Nutr．Fert．Sci．，2005，11(6)：836－845.

［2］Ma J F，Ryan P R，Delhaize E．Aluminium tolerance in plants and the complexing role of organic acids［J］．Trends Plant Sci．，2001，6(6)：273－278.

［3］Foy C D，Chaney R L，White M C．Physiology of metal toxicity in plants［J］．Ann．Rev．Plant．Physiol．，1978，29：511 －566.

［4］Shu W S，Zhang Z Q，Lan C Y，Wong M H．Fluoride and aluminium concentrations of tea plants and tea products from Sichuan Province，PR China ［J］．Chemosphere，2003，52(9)：1475－1482.

［5］Chenery E M．A preliminary study of aluminum and the tea bush［J］．Plant Soil，1955，6(2)：174 －200.

［6］Ruan J Y，Ma L F，ShiY Z．Aluminium in tea plantations：mobility in soils and plants，and the influence of nitrogen fertilization［J］．Environ．Geochem．Health．，2006，(6)：519－528.

［7］Konishi S，Miyamoto S，Taki T．Stimulatory effects of aluminum on tea plants growth under low and high phosphorus supply ［J］．Soil Sci．Plant Nutr．，1985，31：361 －368.

［8］Konishi S．Promotive effects of aluminum on tea plant-growth［J］．Jpn．Agric．Res．Quart．，1992，26(1)：26 －33.

［9］Tsuji M，Kuboi T，Konishi S．Stimulatory effects of aluminum on the growth of cultured roots of tea ［J］．Soil Sci．Plant Nutr．，1994，40(3)：471－476.

［10］Ruan J Y，Zhang F S，Wong M H．Effect of nitrogen form and phosphorus source on the growth，nutrient uptake and rhizosphere soil property ofCamellia sinensisL［J］．Plant Soil，2000，223(1－2)：63 －71.

［11］Morita A，Horie H，F(xiàn)ujii Yet al．Chemical forms of aluminum in xylem sap of tea plants(Camellia sinensisL．) ［J］．Phytochemistry，2004，65(20)：2775 －2780.

［12］Morita A，Yanagisawa O，Takatsu Set al．Mechanism for the detoxification of aluminum in roots of tea plant［Camellia sinensis(L．)Kuntze］［J］．Phytochemistry，2008.69(1)：147 －153.

［13］Ghanati F，Morita A，Yokota H．Effects of aluminum on the growth of tea plant and activation of antioxidant system ［J］．Plant Soil，2005，276(1 －2)：133 －141.

［14］高俊鳳．植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)［M］．北京：高等教育出版社，2006.

Gao J F．Experimental technique of plant physiology［M］．Bei-Jing：Higher Education Press，2006.

［15］黃意歡．茶學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)［M］．北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1997.

Huang Y H．Experimental technique of tea science［M］．Beijing：China Agriculture Press，1997.

［16］楊方云，魏朝富，劉英．干旱脅迫下甜橙葉片保護(hù)酶體系的變化研究［J］．植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào)，2006，12(1)：119－124.

Yang F Y，Wei C F，Liu Y．Protective enzyme systems in orange leaves under drought stress［J］．Plant Nutr．Fert．Sci．，2006，12(1)：119－124.

［17］譚永安，柏立新，肖留斌，等．綠盲蝽危害對棉花防御性酶活性及丙二醛含量的誘導(dǎo)［J］．棉花學(xué)報(bào)，2010，22(5)：479－485.

Tan Y A，Bo L X，Xiao L Bet al．Herbivore stress by lygus lucorum inducing protective enzyme activity and MDA content on different cotton varieties［J］．Cott．Sci．，2010，22(5)：479－485.

［18］林鄭和，陳榮冰．鋁對茶樹葉片抗氧化系統(tǒng)的影響［J］．熱帶作物學(xué)報(bào)，2009，30(5)：598－601.

Lin Z H，Chen R B．Effect of aluminium on antioxidative system of tea leaves［J］．Chin．J．Trop．Crops，2009，30(5)：598－601.

［19］小西茂毅．鋁對茶樹生長的促進(jìn)作用［J］．茶葉，1995，21(3)：18－22.

Shigeki K．Promotion effect of aluminum on the growth of tea［J］．Tea，1995，21(3)：18 －22.

［20］陸建良，梁月榮．鋁對茶樹等植物超氧化物歧化酶的影響［J］．茶葉科學(xué)，1997，17(2)：197－200.

Lu J L，Liang Y R．Effect of aluminium stress on superoxide dismutase in tea and other plants［J］．J．Tea．Sci．，1997，17(2)：197－200.