施氮量對(duì)小麥氮代謝相關(guān)酶活性和子粒蛋白質(zhì)品質(zhì)的影響

孟維偉，王 東，于振文

(1山東農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，農(nóng)業(yè)部作物生理生態(tài)與栽培重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，山東泰安271018;2山東省無(wú)棣縣農(nóng)業(yè)局，山東無(wú)棣251900)

氮素對(duì)小麥子粒產(chǎn)量和品質(zhì)有重要影響。施氮或氮磷鉀配施均可顯著提高子粒蛋白質(zhì)含量［1－2］。也有研究表明，在較低施氮量條件下，子粒蛋白質(zhì)含量隨施氮量增加而提高，但施氮量超出一定閾值，再增施氮肥子粒蛋白質(zhì)含量不再增加甚至降低［3］。Saint Pierre等［4］認(rèn)為，氮素不僅影響子粒蛋白質(zhì)的數(shù)量，亦可調(diào)節(jié)子粒蛋白質(zhì)品質(zhì)，即子粒蛋白質(zhì)的各組分含量及其比例。隨施氮量的增加，醇溶蛋白和谷蛋白含量均逐漸提高［5］。Labuschagne 等［6］則認(rèn)為，增施氮肥提高了十二烷基硫酸鈉可溶性大分子單體蛋白(SDS－soluble larger monomeric proteins)含量，對(duì)十二烷基硫酸鈉可溶性大分子和小分子聚合體蛋白含量均無(wú)顯著影響。另有研究認(rèn)為，子粒蛋白質(zhì)各組分對(duì)氮素反應(yīng)的差異與小麥品質(zhì)類型有關(guān)［7］。增加施氮量，強(qiáng)筋小麥子粒清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和麥谷蛋白含量提高的幅度較中筋和弱筋小麥大［8］。在不同土壤肥力條件下，蛋白質(zhì)各組分對(duì)施氮的響應(yīng)亦不同，高肥力條件下，施氮能顯著地提高粗蛋白和清蛋白的含量，對(duì)其他蛋白組分的作用不大;而低肥力條件下施氮能極顯著地提高粗蛋白、清蛋白、醇溶蛋白和麥谷蛋白的含量，對(duì)球蛋白影響較?。?］。前人研究表明，谷氨酰胺合成酶(GS)是旗葉中氨同化的關(guān)鍵酶，內(nèi)肽酶(EP)則是旗葉蛋白質(zhì)降解的關(guān)鍵酶，二者對(duì)子粒蛋白質(zhì)合成所需氮素的供應(yīng)有重要影響［10］。已有研究表明，子粒蛋白質(zhì)含量與旗葉谷氨酰胺合成酶活性呈正相關(guān)［11－12］。而有關(guān)谷氨酰胺合成酶和內(nèi)肽酶活性與子粒蛋白質(zhì)各組分含量的關(guān)系鮮見報(bào)道。本試驗(yàn)以強(qiáng)筋小麥品種濟(jì)麥20為材料，采用 Wieser［13］的反相–高效液相色譜法分離子粒蛋白質(zhì)組分，研究了施氮量對(duì)小麥氮代謝相關(guān)酶活性和子粒蛋白質(zhì)品質(zhì)的影響，以期為優(yōu)質(zhì)小麥高產(chǎn)栽培的氮肥運(yùn)籌提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

于2003～2004年和2004～2005年小麥生長(zhǎng)季進(jìn)行兩年度試驗(yàn)，供試品種為高產(chǎn)強(qiáng)筋小麥濟(jì)麥20。本文主要以2004～2005年生長(zhǎng)季的結(jié)果進(jìn)行分析。

2003～2004 年生長(zhǎng)季試驗(yàn)在山東龍口市北馬鎮(zhèn)中村進(jìn)行。試驗(yàn)地0—20 cm土層土壤養(yǎng)分含量為：堿解氮84 mg/kg、速效磷11.84 mg/kg、速效鉀83 mg/kg。試驗(yàn)在磷、鉀肥用量一致的條件下，設(shè)置5個(gè)施氮量(以純氮計(jì))，分別為(N kg/hm2)0(CK)、96(N1)、168(N2)、240(N3)、276(N4)，氮肥分兩次施入，基施1/2，拔節(jié)期追施1/2，P2O5105 kg/hm2、K2O 135 kg/hm2作為基肥一次性施入，氮肥為尿素，磷肥為過(guò)磷酸鈣，鉀肥為氯化鉀。小區(qū)面積為3 m×8 m=24 m2，3次重復(fù)，隨機(jī)區(qū)組排列。2003年10月4日播種，基本苗為150株/m2。田間管理同一般高產(chǎn)田。

2004～2005 年生長(zhǎng)季試驗(yàn)在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)進(jìn)行。試驗(yàn)地0—20 cm土層土壤堿解氮含量為49.7 mg/kg、速效磷9.7 mg/kg、速效鉀46.6 mg/kg。試驗(yàn)在磷、鉀肥用量一致的條件下，設(shè)置4個(gè)施氮量(以純氮計(jì))，分別為 N 0、96、168、240 kg/hm2，以 CK、N1、N2、N3 表示，氮肥分兩次施入，基施 1/2，拔節(jié)期追施 1/2，P2O5105 kg/hm2、K2O 105 kg/hm2作為基肥一次性施入，氮肥為尿素，磷肥為過(guò)磷酸鈣，鉀肥為氯化鉀。小區(qū)面積為3 m×4 m=12 m2，3次重復(fù)，隨機(jī)區(qū)組排列。2004年10月6日播種，于4葉期定苗，基本苗為150株/m2，其他管理措施同一般高產(chǎn)田，2005年6月10日收獲。

于開花期在各小區(qū)選擇同一日開花、發(fā)育正常、大小均勻的穗子掛牌標(biāo)記，自花后7 d開始，每7 d取標(biāo)記單莖的旗葉30片，經(jīng)液氮速凍后置－40℃冰柜中，用于旗葉游離氨基酸、谷氨酰胺合成酶和內(nèi)肽酶活性的測(cè)定，每處理重復(fù)3次。小麥成熟期取子粒置70℃烘箱烘至恒重以測(cè)蛋白質(zhì)組分含量。

1.2 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.2.1 子粒蛋白質(zhì)含量和組分的測(cè)定 采用GB 2905－1982半微量凱氏法測(cè)定子粒氮素含量，含氮量乘以系數(shù)5.7為蛋白質(zhì)含量。子粒蛋白質(zhì)組分含量的測(cè)定參照Wieser的方法［13］。色譜系統(tǒng)為美國(guó)Waters公司產(chǎn)474色譜儀+996檢測(cè)器，樣品環(huán)體積為1.2mL，工作站軟件Millium32。色譜柱為Nucleosil 300－5 C8柱(4.6mm ×240mm)。

試劑配制：A液為0.4 mol/L NaCl+0.067 mol/L HKNaPO4(pH=7.6);B液為60%乙醇;C液為50%1－PrOH+2 mol/L尿素+0.05 mol/L Tris-HCl(pH=7.5)+1%DTE(在氮?dú)鈼l件下)。

蛋白質(zhì)組分提取過(guò)程：稱取全麥粉100mg于2mL離心管中，加入1.0mL A液，漩渦振蕩2min，在20℃條件下用智能型恒溫混合器(德國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)TMC5355型)振蕩10 min后，7000 r/min離心15min，連續(xù)提取2次，收集上清液，并用提取液定容至2mL(清蛋白 +球蛋白)。殘余物中加入0.5mL B液，漩渦振蕩2min，在20℃條件下用智能型恒溫混合器振蕩10min后，7000 r/min離心20 min，連續(xù)提取3次，收集上清液，并用提取液定容至1.5mL(醇溶蛋白)。殘余物在氮?dú)鈼l件下加入1.0mL C液，漩渦振蕩2min后，在60℃條件下用智能型恒溫混合器振蕩20min，懸浮液在20℃恒溫下7000 r/min離心20min，連續(xù)提取2次，收集上清液，并用提取液定容至2mL(麥谷蛋白)。樣品測(cè)定前過(guò)0.45μm濾膜，在進(jìn)樣前后分別注入500μL 0.1%(V/V)三氟乙酸，清蛋白+球蛋白、醇溶蛋白、麥谷蛋白進(jìn)樣體積分別為200、80、100μL。

1.2.2 子粒品質(zhì)測(cè)定 用Brabender 880101小型實(shí)驗(yàn)?zāi)?德國(guó))制粉，出粉率為60%。面團(tuán)形成時(shí)間和面團(tuán)穩(wěn)定時(shí)間及吸水率用Brabender 810106002型粉質(zhì)儀(德國(guó))測(cè)定;濕面筋含量用瑞典Perten公司產(chǎn)2200型洗面筋儀，參照GB/T 14608－93測(cè)定。

1.2.3 旗葉游離氨基酸含量的測(cè)定 采用茚三酮法測(cè)定。

1.2.4 旗葉谷氨酰胺合成酶活性測(cè)定 酶液提取：取4～5片旗葉，去中脈及首尾部分，剪碎后稱取0.5 g，加入6 mL(pH8.0 50 mmol/L)的咪唑 －HCl緩沖提取液(含2 mmol/L的 MgSO4，0.5 mmol/L EDTA，10 mmol/L β － 巰基乙醇)，冰浴研磨，4℃下15 000×g離心20 min，上清液即為酶液。

顯色反應(yīng)：取酶液700 μL兩份，分別加入1.6 mL反應(yīng)混合液A(pH7.8，50 mmol/L的咪唑－HCl緩沖液，含 20 mmol/L的 MgSO4，0.5 mmol/L EDTA，60 mmol/L谷氨酸和10 mmol/L ATP)和1.6 mL反應(yīng)混合液B(反應(yīng)混合液A中加入10 mmol/L鹽酸羥胺)，混合均勻后，于30℃水浴反應(yīng)30 min，然后加入1 mL顯色劑(0.2 mol/L TCA，0.37 mol/L FeCl3和0.6 mol/L HCl混合液)，搖勻后放置片刻，于5 000×g下離心10 min，取上清液在540 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。用γ－谷氨?；惲u肟酸做標(biāo)準(zhǔn)曲線，以加入反應(yīng)液B和反應(yīng)液A的吸光值之差，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線查得反應(yīng)生成的γ－谷氨酰基異羥肟酸量，以每克鮮樣酶粗液在單位反應(yīng)時(shí)間內(nèi)催化生成的γ－谷氨酰基異羥肟酸的 μmoL數(shù)表示酶活性。

1.2.5 旗葉內(nèi)肽酶活性的測(cè)定 酶液提?。? g葉片加5 mL pH7.5 50 mmol/L的Tris-HCl緩沖液(包含4 mmol/L DTT，1 mmol/L EDTA，1%PVP)和少量的石英砂冰浴研磨，然后在15 000×g離心30 min)，上清液用于酶活性的測(cè)定。

內(nèi)肽酶活性測(cè)定：酶反應(yīng)體系由以下組分組成，100 mol/L醋酸緩沖液(pH 4.8)0.4 mL，用pH 4.8醋酸緩沖液溶解的0.05 mol/L牛血紅蛋白0.2 mL，酶液0.4 mL?；旌戏磻?yīng)液于38℃保溫1 h，然后加1 mL 10%三氯乙酸終止反應(yīng)(對(duì)照在反應(yīng)前加入三氯乙酸)，4℃靜止30 min，4 000×g離心10 min，上清液用于茚三酮反應(yīng)，以每克鮮樣酶粗液在單位反應(yīng)時(shí)間內(nèi)生成的氨基酸量表示酶活性。

1.2.6 子粒產(chǎn)量的測(cè)定 成熟期調(diào)查公頃穗數(shù)、穗粒數(shù)、千粒重，小麥實(shí)收風(fēng)干后計(jì)產(chǎn)，子粒含水率12.5%。

氮肥農(nóng)學(xué)利用率計(jì)算：氮肥農(nóng)學(xué)利用率=(施氮區(qū)子粒產(chǎn)量－對(duì)照區(qū)子粒產(chǎn)量)/施氮量［14］。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)及圖表處理用Excel 2003及Originpro7.0進(jìn)行，統(tǒng)計(jì)分析和差異顯著性檢驗(yàn)用DPSv7.05數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 施氮量對(duì)旗葉氮代謝及其關(guān)鍵酶活性的影響

2.1.1 對(duì)旗葉游離氨基酸含量的影響 氨基酸是植株中氮化物的主要存在方式和運(yùn)輸形式，為蛋白質(zhì)的合成和積累提供氮源。由圖1可以看出，小麥旗葉游離氨基酸含量花后呈先升后降的趨勢(shì)，花后7d最高，之后逐漸下降。在開花后0、7、14 d均為N3＞N2＞N1＞CK處理;花后21d，N3、N2＞N1＞CK處理，說(shuō)明增施氮肥提高了旗葉游離氨基酸的含量，為子粒蛋白質(zhì)的合成奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。

圖1 不同處理對(duì)旗葉游離氨基酸含量的影響Fig．1 Effects of different treatments on contents of free amino acids in flag leaves

2.1.2 對(duì)旗葉谷氨酰胺合成酶活性的影響 圖2顯示，旗葉谷氨酰胺合成酶活性在小麥開花后呈持續(xù)下降的趨勢(shì)，不同施氮量之間比較，旗葉谷氨酰胺合成酶活性表現(xiàn)為N3、N2＞N1＞CK，差異顯著，而N2和N3處理之間無(wú)顯著差異。表明適當(dāng)?shù)脑鍪┑试黾恿诵←溒烊~谷氨酰胺合成酶活性，有利于提高氨的同化效率。氮肥過(guò)量旗葉谷氨酰胺合成酶活性增加幅度降低。

2.1.3 對(duì)旗葉內(nèi)肽酶活性的影響 由圖3可以看出，旗葉內(nèi)肽酶活性開花后呈先升高后降低的變化趨勢(shì)?；ê?1d達(dá)最高峰，且花后21d前隨施氮量的增加活性顯著降低;而21d后，施氮處理的旗葉內(nèi)肽酶活性逐漸高于對(duì)照。說(shuō)明增加施氮量抑制了小麥灌漿前期和中期旗葉中蛋白質(zhì)的水解，且促進(jìn)了灌漿后期旗葉中蛋白質(zhì)的水解，有利于氮素的再分配。

2.2 施氮量對(duì)小麥子粒蛋白質(zhì)品質(zhì)的影響

2.2.1 對(duì)蛋白質(zhì)及其組分含量的影響 由表1可以看出，CK處理的各蛋白質(zhì)組分含量均最低，隨施氮量增加蛋白質(zhì)各組分含量增加，但達(dá)到最高值的處理不同，醇溶蛋白在N2處理達(dá)到最高值，N3處理與其無(wú)顯著差異，說(shuō)明醇溶蛋白對(duì)增施氮肥反映敏感;麥谷蛋白和清蛋白+球蛋白含量在施氮量較少的N1處理下，與CK無(wú)顯著差異，在N3處理達(dá)到最高值。

2.2.2 對(duì)醇溶蛋白和麥谷蛋白各組分含量的影響由表2可以看出，與不施氮處理比較，增施氮肥顯著提高小麥子粒中ω－醇溶蛋白、α－醇溶蛋白及總醇溶蛋白含量，而γ－醇溶蛋白卻隨施氮量的增加呈先增加后減少的趨勢(shì)，表明過(guò)量施氮不利于γ－醇溶蛋白的積累。

表1 施氮量對(duì)子粒蛋白組分含量的影響(%)Table 1 Effect of nitrogen rate on protein component content in grain of wheat

增施氮肥顯著提高了高分子量麥谷蛋白亞基(HMW－GS)和低分子量麥谷蛋白亞基(LMWGS)含量(表2)，其中高分子量麥谷蛋白亞基含量對(duì)氮素的效應(yīng)敏感，表現(xiàn)為N3＞N2＞N1＞CK，處理之間差異顯著;低分子量麥谷蛋白亞基為N3＞N2＞N1、CK，N1與CK之間無(wú)顯著差異。施氮提高了HMW－GS/LMW－GS比值，表現(xiàn)為N3＞N2、N1＞CK，降低了ωb麥谷蛋白的含量。

2.2.3 對(duì)面粉濕面筋含量和面團(tuán)流變學(xué)特性的影響 由表3可以看出，濕面筋含量、吸水率、面團(tuán)形成時(shí)間和穩(wěn)定時(shí)間均隨施氮量的增加而提高，但是效應(yīng)不一致。濕面筋含量和面團(tuán)穩(wěn)定時(shí)間為N3＞N2＞N1＞CK處量，面團(tuán)形成時(shí)間為N3、N2＞N1＞CK，說(shuō)明濕面筋含量和面團(tuán)穩(wěn)定時(shí)間比面團(tuán)形成時(shí)間對(duì)氮素效應(yīng)敏感;吸水率受施氮量的影響較小。說(shuō)明適量增加施氮量可改善與小麥子粒品質(zhì)相關(guān)的一些指標(biāo)，但是不同指標(biāo)對(duì)增施氮肥量的效應(yīng)是不同的。

2.3 施氮量對(duì)子粒產(chǎn)量及氮肥農(nóng)學(xué)利用率的影響

如表4所示，兩年度試驗(yàn)結(jié)果趨勢(shì)一致。2003～2004年生長(zhǎng)季，在0～240 kg/hm2施氮范圍內(nèi)，隨施氮量增加公頃穗數(shù)、穗粒數(shù)、子粒蛋白質(zhì)含量、子粒產(chǎn)量和蛋白質(zhì)產(chǎn)量均顯著提高，施氮量增至276 kg/hm2時(shí)，公頃穗數(shù)、穗粒數(shù)、子粒產(chǎn)量、蛋白質(zhì)產(chǎn)量和氮肥農(nóng)學(xué)利用率顯著降低。2004～2005年生長(zhǎng)季，在0～168 kg/hm2施氮范圍內(nèi)，隨施氮量的增加公頃穗數(shù)、穗粒數(shù)、子粒蛋白質(zhì)含量、子粒產(chǎn)量和蛋白質(zhì)產(chǎn)量均顯著提高，千粒重顯著降低，施氮量增至240 kg/hm2時(shí)子粒產(chǎn)量和氮肥農(nóng)學(xué)利用率顯著降低，公頃穗數(shù)、穗粒數(shù)、蛋白質(zhì)產(chǎn)量與168 kg/hm2的施氮量處理無(wú)顯著差異。

上述結(jié)果表明，在本試驗(yàn)條件下，在一定施氮量范圍內(nèi)，隨施氮量增加公頃穗數(shù)和穗粒數(shù)的增加幅度大于千粒重的降低幅度，顯著提高了子粒產(chǎn)量;繼續(xù)增加施氮量，公頃穗數(shù)和穗粒數(shù)減少或增加幅度降低，導(dǎo)致產(chǎn)量顯著降低。綜合小麥子粒產(chǎn)量、蛋白質(zhì)含量、蛋白質(zhì)品質(zhì)和氮肥農(nóng)學(xué)利用率可以看出，在本試驗(yàn)條件下，高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)高效的施氮量為168～240 kg/hm2。

表4 不同施氮量對(duì)子粒產(chǎn)量、蛋白質(zhì)含量及氮肥農(nóng)學(xué)利用率的影響Table 4 Effects of nitrogen rates on grain yield，protein content and nitrogen agronomic efficiency

3 討論

谷氨酰胺合成酶(GS)是氮同化過(guò)程中的關(guān)鍵酶之一，為子粒蛋白質(zhì)合成提供氨基酸源［15］。內(nèi)肽酶(EP)是蛋白質(zhì)水解的關(guān)鍵酶，其活性大小與小麥花后葉片衰老過(guò)程中蛋白質(zhì)的降解及氮素向子粒中的運(yùn)轉(zhuǎn)密切相關(guān)，為子粒中谷蛋白大聚合體的積累補(bǔ)充有效氮源［16］。有研究表明，子粒蛋白質(zhì)產(chǎn)量與葉片中GS活性的關(guān)系密切［17］，子粒蛋白質(zhì)含量與旗葉GS活性呈顯著正相關(guān)［11－12］。本試驗(yàn)條件下，在0～168 kg/hm2施氮量范圍內(nèi)，旗葉GS活性與子粒蛋白質(zhì)含量均隨施氮量的增加而顯著升高，但施氮量增至240 kg/hm2，GS活性無(wú)顯著變化，開花后21d的旗葉內(nèi)肽酶(EP)活性和子粒蛋白質(zhì)含量仍顯著提高，說(shuō)明提高灌漿后期旗葉內(nèi)肽酶活性對(duì)增加子粒蛋白質(zhì)含量亦有重要作用。前人研究表明，降低小麥旗葉GS活性，會(huì)影響子粒谷蛋白的合成，導(dǎo)致子粒谷/醇比值降低［18］。本試驗(yàn)表明，提高開花后旗葉GS活性和灌漿后期旗葉EP活性，有利于高分子量谷蛋白亞基(HMW－GS)和低分子量谷蛋白亞基(LMW－GS)的積累及HMW－GS/LMWGS比值的提高，這是適量施氮改善子粒蛋白質(zhì)品質(zhì)的酶學(xué)基礎(chǔ)。

有研究認(rèn)為，氮素代謝和碳素代謝之間存在同化力和碳架的競(jìng)爭(zhēng)［19］。供氮過(guò)多會(huì)使葉片C/N比值過(guò)低、氮代謝旺盛以及光合產(chǎn)物的輸出率降低，造成光合產(chǎn)物對(duì)光合器官的反饋抑制，不利于干物質(zhì)的積累［20］。還有結(jié)果表明，在0～300 kg/hm2施氮量范圍內(nèi)，子粒蛋白質(zhì)含量、形成時(shí)間和穩(wěn)定時(shí)間等品質(zhì)指標(biāo)均與施氮量呈顯著正相關(guān)［21］，而子粒產(chǎn)量與施氮量呈二次曲線關(guān)系［22］，每公頃施用300 kg氮素僅比施225 kg的處理增產(chǎn)3.1%［23］。本試驗(yàn)條件下，2003～2004年生長(zhǎng)季在較高土壤肥力條件下，0～240 kg/hm2施氮范圍內(nèi)，隨施氮量增加公頃穗數(shù)、穗粒數(shù)、子粒蛋白質(zhì)含量、子粒產(chǎn)量和蛋白質(zhì)產(chǎn)量均顯著提高，施氮量增至276 kg/hm2子粒產(chǎn)量和蛋白質(zhì)產(chǎn)量均顯著降低。2004～2005生長(zhǎng)季在較低土壤肥力條件下，0～168 kg/hm2施氮量范圍內(nèi)，隨施氮量增加，子粒蛋白質(zhì)含量、面團(tuán)形成時(shí)間和穩(wěn)定時(shí)間均顯著提高，公頃穗數(shù)和穗粒數(shù)顯著增加，子粒產(chǎn)量和蛋白質(zhì)產(chǎn)量均顯著提高;施氮量增至240 kg/hm2，面團(tuán)穩(wěn)定時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，但子粒產(chǎn)量顯著降低。說(shuō)明無(wú)論土壤肥力高低，只有適量施氮才能實(shí)現(xiàn)子粒品質(zhì)和產(chǎn)量的同步提高。在一定施氮量范圍內(nèi)，小麥庫(kù)容(公頃粒數(shù))的擴(kuò)大及子粒灌漿所需氮源供給能力的提高，增加了單位面積上的氮素和光合產(chǎn)物在子粒中的貯存，是實(shí)現(xiàn)子粒品質(zhì)和產(chǎn)量同步提高的生理原因。

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