高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒蛋白質(zhì)組雙向電泳方法的建立及優(yōu)化

王隆柏，王晨燕，吳學(xué)敏，方勤美，車勇良，陳如敬，魏 宏，莊向生，周倫江*

（1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/福建省畜禽疫病防治工程技術(shù)研究中心，福建福州 350013；2.福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，福建福州 350002）

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是 由 PRRS病 毒（PRRSV）引起的一種豬烈性傳染病[1]。該病至1987年在美國發(fā)現(xiàn)以來，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失[2]。近年來，PRRSV致病力有所增強，尤其是2006年以來由高致病性PRRSV（HP-PRRSV）引起的高致病性PRRS[3-4]，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了沉重的打擊。

自1994年首次提出蛋白質(zhì)組（Proteom ic）概念以來，該技術(shù)得到廣泛應(yīng)用[5]。在病毒蛋白質(zhì)組研究方面，Chelius等用2DE LC-MS/MS分析了腺病毒蛋白質(zhì)組，鑒定了11種病毒蛋白[6]，Chertova等應(yīng)用雙向電泳技術(shù)（2-DE）分析了產(chǎn)生于單核巨嗜細胞（MDM）的HIV-1病毒粒子的蛋白，鑒定了253個宿主細胞相關(guān)蛋白[7]。然而，應(yīng)用2-DE技術(shù)研究HP-PRRSV蛋白質(zhì)組研究尚未見報道。為研究HP-PRRSV蛋白質(zhì)組，本實驗對影響HP-PRRSV蛋白質(zhì)組的2-DE條件進行優(yōu)化，建立了重復(fù)性好、分辨率高的HP-PRRSV 2-DE，為HP-PRRSV的病毒蛋白質(zhì)組學(xué)及免疫蛋白質(zhì)組學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 病毒株和細胞 HP-PRRSV FJ06A株由本科室分離和保存；66代MARC-145細胞購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.2 主要試劑 二硫蘇糖醇（DTT）、尿素（Urea）、3-[3-（膽酰氨丙基）二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽（CHAPS）、碘乙酰胺（Iodoacetam ide）、TEMED、IPG膠條（pH3-pH10）、IPG緩沖液、2-D clean-up Kit試劑盒均購自GEHealthcare Bio-Sciences公司；蛋白預(yù)染Marker購自Fermentas公司。

1.3 儀 器 Ettan IPGphorⅢ等電聚焦系統(tǒng)、Ettan IPGphor Manifold膠條槽、Ettan DALTsix大型垂直電泳系統(tǒng)、ImagescannerⅢ掃描儀、ImageMaster 2D Platinum 6.0分析軟件及MultiTemp恒溫控制儀均為GE Healthcare Bio-Sciences公司產(chǎn)品。

1.4 HP-PRRSV增殖及濃縮 將HP-PRRSV接種于Marc-145單層細胞，接毒量為0.5 ML（病毒毒價為5×106.5TCID50），按常規(guī)方法培養(yǎng)病毒，將細胞病毒液反復(fù)凍融3次后，經(jīng)超聲裂解15 Min，20 000 r/m in離心60m in，棄沉淀，取上清45000 r/min離心240m in，收獲沉淀為濃縮病毒。

1.5 樣品制備 濃縮的HP-PRRSV用0.1 mol/L Tril-HCl洗滌3次，吸干Tril-Hcl，置37℃恒溫箱蒸發(fā)水分20 Min，加入適當裂解液，冰上渦旋溶解后置液氮2 Min取出解凍，反復(fù)凍融4次，將樣品超聲波處理15 Min，其中超聲波裂解8 s，間歇8 s，處理后置冰浴中震蕩1 h，于4℃10 000 r/m in離心1 h，取上清。按2-D clean-up Kit試劑盒方法純化蛋白，用Brandford法檢測蛋白濃度，分裝至Eppendof管中保存于-70℃冰箱。

1.6 雙向電泳的建立

1.6.1 第一向等電聚焦（IEF）采用7 cm IPG膠條pH3～10，樣品用水化液[8 M尿素，2%（w/v）CHAPS，0.5%（v/v）IPG緩沖液，0.002%的1%溴酚藍儲備溶液]溶解，上樣量為130μg，上樣體積為125μL。置IPGphor等電儀器，在20℃環(huán)境溫度下進行等電聚焦。其等電聚焦電壓和時間依次為30 V 14 h、100 V 1 h、500 V 1 h、1 000 V 1 h、3 000 V 1 h、8 000 V 1 h、8 000 V 20 000 Vh、500 v 10 h。

1.6.2 平衡及第二向聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）按參考文獻[8]進行。

1.6.3 染 色按參考文獻[9]的方法進行，染色凝膠用Image Scanner掃描儀透射掃描，分辨率300 dpi保存圖像。

1.6.4 凝膠圖像分析凝膠圖像進行掃描后，用軟件Image Master 2-DE Platinum 6.0進行圖像的處理，設(shè)置參數(shù)Smooth值為2，M inArea值為5，Saliency值為250。

1.7 雙向電泳的優(yōu)化

1.7.1 第一向等電聚焦樣品上樣量為200μg，硝酸銀染色。試驗設(shè)計2種一向等點聚焦程序，分別為程序Ⅰ和程序Ⅱ，程序Ⅰ的聚焦電壓和時間依次為 30 V 14 h、500 V 1 h、1 000 V 1 h、3 000 V 1 h、5 000 V 1 h、5 000 V 20 000 Vh、500 v 10 h，程序Ⅱ的聚焦電壓和時間依次為30 V 14 h、100 V 1 h、500 V 1 h、1 000 V 1 h、3 000 V 1 h、8 000 V 1 h、8 000 V 20 000 Vh、500 v 10 h，其他條件一致。

1.7.2 染色試劑采用一向等電聚焦上樣量為160μg進行電泳，電泳結(jié)束后，比較經(jīng)典考馬斯亮蘭和硝酸銀染色效果。經(jīng)典考馬斯亮蘭的染色步驟依次用20%三氯乙酸固定1 h，0.1%考馬斯亮藍、40%乙醇和10%乙酸染色2 h，40%乙醇和10%乙酸30m in脫色2次，1%乙酸強化過夜，去離子水清洗30m in；硝酸銀染色方法見1.6.3，其他條件一致。

1.7.3 樣品上樣量采用相同樣品，上樣量分別為80μg、120μg、160μg和 200μg 4組進行電泳，采用硝酸銀染色，其他條件一致。

1.7.4 顯色時間樣品上樣量為200μg，硝酸銀染色，加入顯色液后分別進行了顯色4 Min和6 Min，分析顯色效果，其他條件一致。

1.8 HP-PRRSV培養(yǎng)物與MC-145細胞蛋白雙向電泳 分別將HP-PRRSV培養(yǎng)物和MC-145細胞進行反復(fù)凍融3次后，經(jīng)超聲裂解15m in，20 000 r/min離心60min，棄沉淀，取上清45000 r/min離心240min，收獲沉淀，沉淀物采用與HP-PRRSV樣品相同的制備方法，通過建立的雙向電泳方法進行電泳。

2 結(jié)果

2.1 雙向電泳的建立 獲得的電泳圖譜蛋白聚焦效果良好，背景比較清晰，能檢測到223個蛋白點（圖1），但蛋白點數(shù)量較少，條件有待進一步優(yōu)化。

2.2 一向等電聚焦程序優(yōu)化 按程序Ⅰ聚焦獲得的蛋白電泳圖譜中蛋白聚焦效果不完全，不夠清晰，數(shù)量明顯偏少，有豎條紋較多，能檢測到184個蛋白點，按程序Ⅱ聚焦獲得的蛋白聚焦效果好，邊界清晰分明，蛋白點較多，檢測到365個蛋白點（圖2）。

2.3 染色試劑優(yōu)化 經(jīng)典考馬斯亮蘭染色的電泳圖譜中蛋白點少，能檢測到75個蛋白點，而硝酸銀染色的電泳圖譜中蛋白點較多，蛋白點也比較清晰，能檢測到296個蛋白點（圖3）。

2.4 上樣量優(yōu)化 當上樣量為80μg時，電泳圖譜中蛋白點的數(shù)量明顯偏少,蛋白點也不夠清晰，能檢測到88個蛋白點；上樣量為120μg時，電泳圖譜中蛋白點有所增多，邊界比較分明，能檢測到154個蛋白點；上樣量為160μg時，電泳圖譜中蛋白點較多和清晰、邊界分明，能檢測到305個蛋白點；當上樣量為200μg時電泳圖譜中蛋白點明顯點增多，邊界清晰，聚焦效果良好，能檢測到386個蛋白點（圖 4）。

圖4 不同上樣量對2DE電泳圖譜的影響Fig.4 Effects of different loaded protein on the 2-DEmaps of protein

2.5 顯色時間優(yōu)化 顯色4min的蛋白電泳圖譜中蛋白點較少，能檢測到278個蛋白，而顯色時間為6 Min的電泳圖譜中蛋白點較多，蛋白點也比較清晰，能檢測到375個蛋白點（圖5）。

2.6 HP-PRRSV培養(yǎng)物與MC-145細胞蛋白雙向電泳 HP-PRRSV-FJ06A培養(yǎng)物蛋白樣品電泳圖譜能檢測到103個蛋白點（圖6），MC-145細胞蛋白樣品聚焦效果良好，能檢測到89個蛋白點（圖7）。

3 討論

通過對HP-PRRSV大量培養(yǎng)、濃縮、樣品處理、上樣量、一向等電聚焦程序、染色試劑選擇和顯色時間等條件的優(yōu)化，建立了一套適合HP-PRRSV蛋白質(zhì)組分析的雙向電泳技術(shù)方法，即以凍融-超聲-裂解病毒法提取蛋白質(zhì)樣品，采用7 cm pH3-10的IPG膠條，上樣品量為200μg，上樣體積為125μL，等電聚集的電壓為8 000 v，采用硝酸銀，結(jié)合Na2CO3與甲醛顯色6 min，能獲得了高分辨率的電泳圖譜，并將部分蛋白點進行了質(zhì)譜分析，鑒定到有高致病性PRRSV-NSP2蛋白、PRRSV-GP2蛋白、PRRSV-M蛋白和PRRSV-N蛋白等特異性蛋白。同時，采用相同方法對HP-PRRSV的培養(yǎng)物和MC-145細胞蛋白進行雙向電泳，并獲得了蛋白電泳圖譜，但聚焦蛋白點偏少，可能與蛋白樣品的制備有關(guān)，因為采用相同的樣品制備方法，HPPRRSV的培養(yǎng)物被高度濃縮后，其含有的離子和鹽份等雜質(zhì)較多，影響了等電聚焦，而MC-145細胞蛋白樣品因經(jīng)過高速離心去除了較多的可溶性蛋白，致聚焦蛋白點較少。經(jīng)過重復(fù)試驗表明，優(yōu)化的雙向電泳方法適用于HP-PRRSV，能獲得分辨率高、重復(fù)性好的電泳圖譜。

為提高HP-PRRSV的濃度和純度，對培養(yǎng)的HP-PRRSV采用超速離心方法進行了濃縮。雖然大量培養(yǎng)病毒、濃縮病毒、裂解病毒顆粒相對復(fù)雜困難，但采用差速離心濃縮病毒，通過凍融-超聲-裂解樣品蛋白，破壞了病毒的囊膜和去除了核酸，結(jié)合2-D clean-up試劑盒純化蛋白，進一步的去除了部分樣品中糖類、脂質(zhì)和鹽份等雜質(zhì)，提高了雙向電泳的效果。一向等電聚焦是雙向電泳中的關(guān)鍵步驟，聚焦效果的好壞將直接關(guān)系到蛋白分離的成敗[10]，采用長時間逐步升壓方法有利于促進蛋白樣品的溶解和除去鹽離子對聚焦效果的影響，并且高壓聚焦蛋白效果明顯比低壓更理想。樣品上樣量也是一個直接影響電泳比較重要的因素，若蛋白樣品量太低，導(dǎo)致電泳圖譜中有效蛋白點少，上樣量過高，很可能在聚焦的過程中有部分蛋白在膠條槽中沉淀凝固下來，堵塞凝膠孔徑，影響蛋白聚焦效果。染色試劑和顯色時間對蛋白電泳圖影響也較大，試驗表明，硝酸銀染色比經(jīng)典考馬斯亮蘭染色敏感，這與邵錦震等報道的基本一致[11]。

本研究建立了HP-PRRSV蛋白質(zhì)組學(xué)雙向電泳方法，能夠為HP-PRRSV蛋白質(zhì)組學(xué)研究奠定基礎(chǔ)，更為開展HP-PRRSV蛋白質(zhì)組學(xué)和免疫蛋白質(zhì)組學(xué)提供有力的技術(shù)支撐。

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