表達(dá)H5亞型禽流感病毒HA蛋白的重組禽痘病毒的構(gòu)建

焦同路，王靖飛，趙雙成，王世達(dá)，常曉飛，田 石，柳金雄，李雁冰，姜永萍*，陳化蘭*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部動(dòng)物流感重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室/獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱 150001；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所疫病診斷與技術(shù)服務(wù)中心，黑龍江哈爾濱 150001）

禽流感（AI）是由A型禽流感病毒（AIV）引起的主要流行于雞群中的烈性傳染病。根據(jù)AIV表面糖蛋白HA和NA抗原性的差異可以將其分為16個(gè)HA亞型和9個(gè)NA亞型，其中H5N1亞型屬于高致病AIV。1996年在廣東省分離出中國(guó)境內(nèi)第一株高致病性的H5N1 AIV（A/goose/Guangdong/1/96），隨后在中國(guó)的南方地區(qū)又分離出多株H5N1 AIV[1]，其中1997年在香港分離的一株H5N1 AIV能夠感染人并致死[2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)2004~2008年期間中國(guó)共暴發(fā)104次H5N1 AIV引起的禽流感[3]，對(duì)禽類養(yǎng)殖業(yè)和公共衛(wèi)生安全造成了嚴(yán)重的威脅。目前中國(guó)的禽流感防制主要是采取捕殺并結(jié)合疫苗免疫的策略。

AI防制的疫苗主要有滅活疫苗和重組病毒活載體疫苗，但滅活疫苗的應(yīng)用不利于疫情的監(jiān)測(cè)，而重組病毒活載體疫苗則可避免這一不足，因此重組病毒活載體疫苗成為研究的熱點(diǎn)。禽痘病毒（FPV）具有廣泛的宿主嗜性，持續(xù)感染的時(shí)間比較長(zhǎng)，能承載大片段外源DNA等優(yōu)點(diǎn)，已成功用于多種病原基因的表達(dá)[4-6]。一些報(bào)道表明插入流感病毒HA基因的重組FPV對(duì)家禽具有良好的免疫保護(hù)效果[7-9]，但隨著流感病毒的變異，原有的疫苗不能對(duì)一些變異株提供有效的免疫保護(hù)。本實(shí)驗(yàn)利用含有g(shù)fp和gpt的雙篩選標(biāo)記的轉(zhuǎn)移載體pSY681-gfp-gpt[10]，將流行于我國(guó)南方水禽的H5N1 AIV代表株A/Duck/Anhui/1/06（H5N1）（簡(jiǎn)稱AH/06）的HA基因同源重組到FPV中。構(gòu)建了表達(dá)HA蛋白的重組禽痘病毒（rFPV-gpt-gfp-AHHA），為進(jìn)一步的免疫效力研究提供了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 病毒株和細(xì)胞 鵪鶉源FPV（CVCCAV1003）、含有AH/06 HA基因的重組質(zhì)粒pMD-HA和轉(zhuǎn)移載體pSY-681-gfp-gpt均由本研究所農(nóng)業(yè)部動(dòng)物流感重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；CEF由本研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的9日齡SPF雞胚制備。

1.2 主要試劑 FuGENE HD Transfection Reagent購自羅氏公司；Mycophenolicacid、Xanthine、Hypoxantine購自Sigma公司；rTaqDNA聚合酶、NotⅠ、AflⅡ、Phusion DNA Polymerase、T4DNA連接酶購自NEB公司；EasyPure Viral DNA/RNA Kit試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；兔抗雞IgG（IRDyeR800）購自Rockland公司；感受態(tài)細(xì)胞JM 109購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.3 轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建 pSY681-gfp-gpt-AHHA的構(gòu)建根據(jù)AIVAH/06 HA基因的ORF區(qū)設(shè)計(jì)一對(duì)引物，并且在上游引物的5'端加入酶切位點(diǎn)AflⅡ和kozak序列（5'-CGCTTAAGGCCGCCACCATGGAGAAAATA GTGCTT-3'），下游引物的5'端加入酶切位點(diǎn)NotⅠ（5'-CTAGCGGCCGCTTAAATGCAAATTCTGC-3'），以pMD-HA為模板用Phusion DNA Polymerase擴(kuò)增HA基因的ORF片段。將其采用NotⅠ、AflⅡ分步酶切后回收，用T4連接酶連接到經(jīng)同樣酶切的pSY681-gfp-gpt中得到pSY681-gfp-gpt-AHHA。

1.4 rFPV-gfp-gpt-AHHA的構(gòu)建與篩選 參照文獻(xiàn)方法用FPV感染CEF，感作2 h后棄去病毒液。按照FuGENE HD轉(zhuǎn)染試劑的說明書將pSY681-gfpgpt-AHHA轉(zhuǎn)染于FPV預(yù)感染的CEF中，在37℃5%CO2條件下培養(yǎng)至出現(xiàn)細(xì)胞病變（CPE）時(shí)收獲細(xì)胞，反復(fù)凍融3次后用于篩選。首先利用標(biāo)記基因gfp表達(dá)的綠色熒光蛋白在熒光顯微鏡下挑取熒光蝕斑進(jìn)行幾輪篩選，待大部分蝕斑呈現(xiàn)綠色熒光時(shí)，同時(shí)利用雙重篩選標(biāo)記gfp和gpt在含低熔點(diǎn)瓊脂糖的培養(yǎng)液中加入霉酚酸（25μg/mL）、次黃嘌呤（15μg/mL）、黃嘌呤（250μg/mL）以抑制殘留野生病毒的增殖，經(jīng)過幾輪篩選后得到完全純化的含有雙標(biāo)記基因和HA基因的rFPV-gfp-gpt-AHHA。

1.5 rFPV-gfp-gpt-AHHA的鑒定及HA基因表達(dá)產(chǎn)物的western blot鑒定 收集重組病毒感染后病變的 CEF，用EasyPure Viral DNA/RNA Kit試劑盒提取其總DNA，以其為模板用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。同時(shí)收集病變的細(xì)胞反復(fù)凍融后超聲裂解，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，并轉(zhuǎn)移到NC膜上。以AIV AH/06的特異性多克隆血清為一抗（1∶200），以兔抗雞 IgG（IRDyeR800）為二抗，鑒定 rFPV-gfp-gpt-AHHA表達(dá)的HA蛋白的抗原活性。

1.6 rFPV-gfp-gpt-AHHA和FPV的生長(zhǎng)曲線比較將純化的rFPV-gfp-gpt-AH-HA和親本FPV分別以0.1 MOI量感染CEF，在37℃ 5%CO2條件下培養(yǎng)。分別于接毒24 h、48 h、72 h、96 h、120 h后收獲病毒反復(fù)凍融3次后測(cè)定PFU，繪制生長(zhǎng)曲線。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)移載體pSY681-gfp-gpt-AHHA的鑒定 以pMD-HA為模板進(jìn)行HA基因的擴(kuò)增，得到大小約為1 700 bp的ORF片段，將其克隆到到約為8 000 bp的轉(zhuǎn)移載體pSY681-gfp-gpt中。PCR鑒定pSY681-gfp-gpt-AHHA，結(jié)果顯示目的條帶的大小與理論值相符（圖1）；NotⅠ、AflⅡ雙酶切的結(jié)果也顯示得到的兩條目的條帶與HA基因的ORF片段及轉(zhuǎn)移載體pSY681-gfp-gpt的理論值相符（圖1）。

2.2 rFPV-gfp-gpt-AHHA的純化與擴(kuò)增 將pSY681-gfp-gpt-AHHA轉(zhuǎn)染于預(yù)感染FPV的CEF中進(jìn)行同源重組，利用雙篩選標(biāo)記gfp和gpt純化rFPV-gfpgpt-AHHA。首先利用gfp篩選標(biāo)記對(duì)轉(zhuǎn)染后收獲的病毒進(jìn)行幾輪篩選，至大部分病毒蝕斑在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)綠色熒光時(shí)，再用gfp和gpt雙重篩選標(biāo)記進(jìn)行幾輪篩選，最后得到純化的rFPV-gfp-gpt-AHHA。用rFPV-gfp-gpt-AHHA感染CEF，待細(xì)胞病變后熒光顯微鏡下觀察，所有的病毒蝕斑均呈現(xiàn)綠色熒光（圖 2），反復(fù)凍融病變的 CEF收獲增殖的 rFPV-gfp-gpt-AHHA。

2.3 rFPV-gfp-gpt-AHHA的PCR鑒定及HA基因表達(dá)產(chǎn)物的western blot鑒定 以提取的重組禽痘病毒的總DNA為模板，用特異性引物進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果得到大小約為1 700 bp的條帶，并與理論值相符（圖3），同時(shí)測(cè)序的結(jié)果也顯示rFPV-gfp-gpt-AHHA中插入了HA基因的ORF片段并且沒有發(fā)生氨基酸突變。用特異性多克隆血清進(jìn)行的western blot鑒定也表明rFPV-gfp-gpt-AHHA能夠穩(wěn)定的表達(dá)HA 蛋白（圖 3）。

2.4 rFPV-gfp-gpt-AHHA和FPV的生長(zhǎng)曲線 病毒在不同生長(zhǎng)點(diǎn)的蝕斑結(jié)果顯示rFPV-gfp-gpt-AHHA和FPV在正常條件下培養(yǎng)96 h后病毒滴度達(dá)到最大值，兩者之間生長(zhǎng)情況基本一致（圖4）。生長(zhǎng)曲線表明外源基因的插入并沒有影響親本FPV的復(fù)制，rFPV-gfp-gpt-AHHA能夠穩(wěn)定的復(fù)制。

3 討論

針對(duì)AIV，具有免疫保護(hù)性的蛋白主要是HA、NA和NP，但由于抗NA的抗體不能夠中和病毒，而NP蛋白在體內(nèi)誘導(dǎo)的免疫原性還不足以對(duì)致死攻擊提供有效的保護(hù)[11]，所以HA蛋白是目前流感亞單位疫苗和重組活載體疫苗的主要免疫性抗原。

圖4 rFPV-gfp-gpt-AHHA和FPV的生長(zhǎng)曲線Fig.4 One-step growth curve for rFPV-gfp-gpt-AHHA and FPV

喬傳玲等將AIV A/Goose/Guangdong/3/96（H5N1）的HA基因同源重組到親本痘病毒S-FPV-017中，構(gòu)建的重組禽痘病毒活載體疫苗自2005年起開始在中國(guó)部分地區(qū)投入使用并取得良好的效果[9]，但為了應(yīng)對(duì)AIV重組變化可能帶來的抗原漂移，本實(shí)驗(yàn)選取了流行于我國(guó)南方水禽中的H5N1高致病性禽流感抗原群的代表株AH/06的HA基因進(jìn)行同源重組，制備新一代的痘病毒活載體流感疫苗。重組禽痘病毒的篩選和純化工作是本實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)顯示由于原代細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率比較低，因此在重組禽痘病毒最初幾代的篩選過程中不能利用gpt篩選標(biāo)記進(jìn)行藥物壓力篩選，以防重組禽痘病毒的丟失。本實(shí)驗(yàn)中我們首先利用gfp標(biāo)記進(jìn)行多輪篩選后，再同時(shí)利用gfp和gpt雙重篩選標(biāo)記進(jìn)一步的純化重組禽痘病毒。同時(shí)為提高HA蛋白的表達(dá)量本實(shí)驗(yàn)在HA基因的起始密碼子之前加入了Kozak序列。

本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了能夠穩(wěn)定復(fù)制的rFPV-gfp-gpt-AHHA，并對(duì)其表達(dá)的HA蛋白進(jìn)行了western blot驗(yàn)證，表明了rFPV-gfp-gpt-AHHA表達(dá)的HA蛋白具有良好的抗原活性，為進(jìn)一步的免疫效力研究奠定了基礎(chǔ)。

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