異丙腎上腺素激發(fā)試驗(yàn)在大鼠酒精性心肌病模型評(píng)價(jià)中的應(yīng)用*

鄒 熠,許松柏,方秋娟,王瑞幸△

(1.福建醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院病理科,福州 350004;2.福建省晉江市醫(yī)院,晉江 362200;3.福建醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系,福州 350004)

臨床觀察表明,長(zhǎng)期飲酒尤其烈性酒可造成酒精性心肌病(alcoholic cardiomyopathy,ACM)[1,2]。我國(guó)有飲酒習(xí)慣者高達(dá)3.6億人,其中2 200多萬(wàn)人飲酒量達(dá)酗酒標(biāo)準(zhǔn),但酒精性心肌病的基礎(chǔ)研究幾近空白。目前歐美國(guó)家已有學(xué)者建立ACM動(dòng)物模型[3],但多數(shù)為高成本的自由飲模型,相應(yīng)模型評(píng)價(jià)手段不甚敏銳,且無(wú)法對(duì)模型動(dòng)物的心力儲(chǔ)備狀況進(jìn)行評(píng)判。本研究采用白酒定量灌胃法建立ACM大鼠模型,將左心室插管同異丙腎上腺素激發(fā)試驗(yàn)(isoprenaline provocation test,IPT)相結(jié)合,通過(guò)直接從左心室內(nèi)采集大鼠左心室血流動(dòng)力學(xué)參數(shù),對(duì)其靜息狀態(tài)、激發(fā)狀態(tài)的心功能(心力儲(chǔ)備)行全面評(píng)價(jià)。同時(shí),心肌標(biāo)本的病理學(xué)及超微結(jié)構(gòu)改變也得以觀察,以進(jìn)一步揭示心臟功能學(xué)改變的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

成年雄性SD大鼠24只,體重200～250 g(上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司,動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(滬)2007-0005)?！岸侇^”白酒(52°v/v北京順鑫農(nóng)業(yè)股份有限公司牛欄山酒廠),異丙腎上腺素(上海禾豐制藥有限公司)。RM-6240多道生理信號(hào)采集系統(tǒng)(成都儀器廠),PE50聚乙烯導(dǎo)管(外徑0.965 mm;內(nèi)徑0.58 mm;美國(guó)Becton Dickinson公司)、PE10聚乙烯導(dǎo)管(外徑0.61 mm;內(nèi)徑0.28 mm;美國(guó)Becton Dickinson公司)。

1.2 大鼠ACM模型建立

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,隨機(jī)分為正常對(duì)照組和模型組(n=12)。按晝夜時(shí)程,在穩(wěn)定室溫及濕度條件下,全價(jià)顆粒飼料喂養(yǎng),自由飲水。模型組大鼠定量白酒灌胃(白酒劑量20 g/(kg·d),等效給予乙醇劑量10 g/(kg·d),一天內(nèi)分兩次灌入;正常對(duì)照組以蒸餾水灌胃對(duì)照。觀察動(dòng)物一般狀況、進(jìn)食量及體重。

1.3 基礎(chǔ)狀態(tài)血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)記錄

15日后,大鼠禁食不禁水12 h,以20%氨基甲酸乙酯溶液腹腔注射麻醉。于左頸外靜脈置PE10聚乙烯導(dǎo)管,用以給藥;于右頸總動(dòng)脈插入PE50聚乙烯導(dǎo)管并順動(dòng)脈推進(jìn),直至進(jìn)入左心室,用以監(jiān)測(cè)左心室血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo),記錄靜息狀態(tài)血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)。觀測(cè)指標(biāo):左心室平均收縮壓(mean left ventricle systolic pressure,mLVSP)、左心室平均舒張壓(mean left ventricle diastolic pressure,mLVDP)、左心室平均壓(mean left ventricle pressure,mLVP)、心率(heart rate,HR)、左心室最大收縮速度(maximal rise velocity of left ventricular pressure,+dp/dtmax)、左心室最大舒張速度(maximal fall velocity of left ventricular pressure,-dp/dtmax)。

1.4 異丙腎上腺素激發(fā)試驗(yàn)(IPT)

記錄基礎(chǔ)狀態(tài)血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)后,以2 ml/kg劑量,快速注入生理鹽水,記錄5 min;后以12.5 ng/kg 、25.0 ng/kg 、50.0 ng/kg 、100.0 ng/kg 、200.0 ng/kg、400.0 ng/kg劑量分別給予異丙腎上腺素(ISO),各劑量間間隔10 min用以觀測(cè)。實(shí)驗(yàn)全程使用RM-6240系統(tǒng)自帶軟件記錄。

1.5 左心室質(zhì)量測(cè)量與形態(tài)學(xué)觀察

模型大鼠記錄血流動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)后迅速開胸取心,按統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)修剪心臟周圍殘余組織后稱量左心室質(zhì)量。稱量后,取心尖部分放入10%甲醛溶液固定,石蠟包埋,切片,HE染色,光學(xué)顯微鏡下行組織形態(tài)學(xué)觀察。左心室心肌組織取材,將組織塊切成1 mm大小組織塊浸于戊二醛溶液中,鋨酸固定,酒精丙酮梯度脫水,環(huán)氧樹脂包埋,超薄切片機(jī)制50 nm～70 nm超薄切片,透射電子顯微鏡觀察超微結(jié)構(gòu)。

1.6 結(jié)果分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般狀況

正常組大鼠無(wú)死亡,體型壯碩,食欲好;模型組大鼠死亡2只,均為實(shí)驗(yàn)后期嚴(yán)重的腹脹厭食所致,存活者體形消瘦,食欲差。兩組大鼠的體重比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01,表1)。

2.2 基礎(chǔ)狀態(tài)參數(shù)比較

使用RM-6240系統(tǒng)配備軟件選取所記錄波形計(jì)算各指標(biāo)平均值,正常組及模型組大鼠 mLVSP、mLVDP、mLVP等血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)平均值見表2,其中模型組大鼠的±dp/dtmax、mLVSP、mLVP、HR顯著低于正常組大鼠。

Tab.1 Comparison of body weight(g,±s)

Tab.1 Comparison of body weight(g,±s)

**P＜0.01 vs control

Group n Body weight 1 d 5 d 10 d 15 d Control 12 232.57±11.09 297.97±15.11 342.85±12.46 380.58±13.67 Ethanol 10 233.81±13.28 226.63±19.15** 236.38±21.79** 243.88±20.13**

Tab.2 Hemodynamic data in resting state(±s)

Tab.2 Hemodynamic data in resting state(±s)

mLVSP:Mean left ventricle systolic pressure;mLVDP:Mean left ventricle diastolic pressure;mLVP:Mean left ventricle pressure;HR:Heart rate;±dp/dtmax:Maximal rise/fall velocity of left ventricular pressure*P＜0.05,**P＜0.01 vs control

Group n mLVSP(mmHg)mLVDP(mmHg)mLVP(mmHg)HR(beats/min)+dP/dtmax(mmHg/s)-dP/dtmax(mmHg/s)Control 12 140.18±26.03-2.55±2.05 48.98±10.58 373.60±25.02 1 0855.0±1 563.2 -7 199.7±1 211.1 Ethanol 10 108.13±6.20**-2.73±1.67 37.55±3.80* 297.20±61.49*8 272.3±1 484.5*-5 771.9±785.4*

2.3 異丙腎上腺素激發(fā)試驗(yàn)(IPT)

正常組、模型組大鼠的mLVSP、mLVDP、mLVP變化規(guī)律性不大,而HR、+dp/dtmax、-dp/dtmax變化較有規(guī)律?；A(chǔ)狀態(tài)、注射生理鹽水及各劑量ISO后,模型組大鼠HR值均低于正常組,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);+dp/dtmax值均低于正常組,除400 ng/kg劑量外,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);-dp/dtmax值均低于正常組,除 12.5 ng/kg、25 ng/kg、50 ng/kg劑量外,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

兩組大鼠HR均隨ISO劑量升高而加大,有很好的劑量依賴關(guān)系:模型組大鼠200 ng/kg處達(dá)到峰值,加大濃度后HR基本不變獲略增;正常組大鼠HR始終隨劑量增大而升高,在所給濃度內(nèi)未見峰值。模型組大鼠+dp/dtmax先升高,于12.5 ng/kg處出現(xiàn)最高值,之后下降,變化較為平穩(wěn);正常組大鼠+dp/dtmax值略有波動(dòng),總體仍同模型組呈現(xiàn)相同趨勢(shì),但于更高劑量(25ng/kg)出現(xiàn)最高值。模型組大鼠-dp/dtmax的絕對(duì)值逐漸增高,在12.5 ng/kg～50 ng/kg之間基本穩(wěn)定,正常組大鼠于生理鹽水處達(dá)最高值,開始注射ISO后,隨劑量增加逐漸增大,200 ng/kg處達(dá)峰,之后下降(表3)。

Tab.3 Result of IPT(±s)

Tab.3 Result of IPT(±s)

HR:Heart rate;±dp/dtmax:Maximal rise/fall velocity of left ventricular pressure;IPT:Isoprenaline prowcation test;ISO:Isoprenaline*P＜0.05,**P＜0.01 vs control

Concentration of ISO(ng/kg)HR(beats/min)+dP/dtmax(mmHg/s)-dP/dtmax(mmHg/s)Control Ethanol Control Ethanol Control Ethanol 0(NS) 381.20±19.92312.10±31.99** 12 381.4±689.09 978.9±631.1** -8 553.9±468.2-7 567.3±835.4*12.5 396.10±22.20318.40±28.91** 12 082.5±818.810 336.5±933.3** -7 954.3±669.5-7 215.9±749.9 25.0 415.60±16.51341.30±25.97** 12 446.6±731.310 172.7±923.5* -7 984.5±786.4-7 188.6±943.6 50.0 429.40±22.29341.80±35.24** 12 318.9±1 052.710 052.3±1 112.9*-7 985.6±730.2-7 175.3±1 129.4 100.0 433.50±24.10350.00±25.48** 11 639.4±888.99 651.1±1 043.8* -8 225.7±1 018.4-6 268.5±1 037.1*200.0 441.00±30.93352.00±18.24** 11 429.3±692.59 634.4±1 202.4* -8 764.9±840.3-6 417.5±1 383.1*400.0 449.00±28.61350.50±24.77** 10 890.0±1 190.59 452.6±799.3* -7 889.9±884.2-6 175.3±1 115.3*

2.4 形態(tài)學(xué)觀察

模型組大鼠心臟體積明顯大于正常組大鼠心臟,心腔擴(kuò)大,室壁軟癟變薄、張力低(圖 1A),心室質(zhì)量(HW)亦低于正常組,行雙尾t檢驗(yàn)分析顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),心重量體重量比(HW/BW)稍高,但尚無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表4)。

Tab.4 Comparison of heart weight(±s)

Tab.4 Comparison of heart weight(±s)

HW:Heart weight;BW:Body weight*P＜0.05 vs control

Group n HW(g) HW/BW Control 12 1.1303±0.0774 0.00297±0.00014 Ethanol 10 0.7292±0.0609* 0.00299±0.00019

病理切片顯示,模型組大鼠左室壁變薄,心肌充血,其間有灶性出血;肌束疏松紊亂,有斷裂,壁間血管擴(kuò)張明顯,血管周圍炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),且有少量炎癥滲出;內(nèi)膜面心肌細(xì)胞擴(kuò)大,輪廓不清、胞質(zhì)疏松,部分細(xì)胞胞漿淡染,細(xì)胞核有畸形出現(xiàn)。乳頭肌細(xì)胞脂肪變性,近內(nèi)膜面細(xì)胞胞漿水腫、顆粒狀,其中有空泡生成(圖1B、D)。正常組大鼠心肌縱切面可見細(xì)胞排列規(guī)整,大小一致,核居中、細(xì)長(zhǎng)。橫切面心肌排列有序,胞質(zhì)均勻,胞核比例正常(圖1C、E,圖1見彩圖頁(yè)Ⅰ)透射電子顯微鏡下,正常組心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)線粒體眾多,聚集在一起并含有密集的嵴;肌原纖維排列規(guī)整,無(wú)斷裂,其A帶、I帶與H帶和M線、Z線清晰可見(圖2A)。模型組大鼠線粒體變形腫脹,可見聚集融合;嵴紊亂溶解、模糊不清。肌原纖維排列不規(guī)整,有斷裂、溶解發(fā)生。A帶、I帶、與H帶、M線、Z線模糊不清(圖2B)。

Fig.2 Electronograph of Myocardium(×12.5k)

3 討論

酒精長(zhǎng)期作用于飲酒者心臟,心肌細(xì)胞凋亡丟失而導(dǎo)致有效收縮單位數(shù)量減少[4],心肌發(fā)生重塑、纖維化[5]致使室壁順應(yīng)性降低,同時(shí)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器功能受損[6]、收縮蛋白破壞[7]、鈣離子相關(guān)蛋白紊亂[8]將進(jìn)一步削弱心肌細(xì)胞的收縮能力。另一方面,酒精亦可通過(guò)神經(jīng)內(nèi)分泌因素介導(dǎo)而對(duì)心臟產(chǎn)生間接毒害[9],導(dǎo)致心功能和(或)代謝發(fā)生改變。本研究中,大鼠經(jīng)過(guò)15日高度酒灌胃,已出現(xiàn)心肌收縮力減退、心排量降低、心臟擴(kuò)大、心肌細(xì)胞密度降低、線粒體融合腫脹、嵴紊亂等現(xiàn)象,其功能學(xué)及形態(tài)學(xué)改變均符合臨床[6]。酒精性心肌病大鼠模型已基本建立。

在心血管生理功能的評(píng)價(jià)上,本研究將左心室插管同異丙腎上腺素激發(fā)試驗(yàn)相結(jié)合,前者以其敏感性和準(zhǔn)確性著稱,可直接采集并實(shí)時(shí)定量分析各種血流動(dòng)力學(xué)參數(shù),同超聲心動(dòng)圖方法相比,更利于監(jiān)測(cè)心臟功能學(xué)的微小變化。通過(guò)該項(xiàng)技術(shù),本實(shí)驗(yàn)不僅觀察到靜息狀態(tài)下模型組大鼠左心室最大收縮速度、左心室最大舒張速度、左室平均收縮壓及心率的明顯下降,同時(shí)也發(fā)現(xiàn)了左室平均舒張壓的略微升高。上述數(shù)據(jù)一方面提示了模型組大鼠心肌質(zhì)量下降,心臟收縮能力下降;另一方面也說(shuō)明了左心室壁順應(yīng)性減低,心臟舒張、血液充盈功能受到影響。

在獲得靜息狀態(tài)模型組大鼠心血管生理數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上,為了對(duì)其心力儲(chǔ)備進(jìn)行進(jìn)一步考察,本研究采用了異丙腎上腺素激發(fā)試驗(yàn)(IPT)。異丙腎上腺素(ISO)為作為常用的非選擇性β受體激動(dòng)劑,注射后將導(dǎo)致大鼠心率、心肌收縮力、心排出量發(fā)生正性改變,引出心肌潛在的舒縮能力,從而對(duì)其心力儲(chǔ)備進(jìn)行評(píng)價(jià)。模型組大鼠注射ISO后,雖各項(xiàng)指標(biāo)有所上升,但無(wú)法超越正常組,且波形大多不穩(wěn)定,體現(xiàn)了其心力儲(chǔ)備以及整體調(diào)節(jié)能力的下降。所有監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)中,心率和左心室最大收縮速率為劑量依賴性關(guān)系最好的兩項(xiàng)監(jiān)測(cè)指標(biāo),兩組動(dòng)物的相關(guān)數(shù)據(jù)顯示出較為相似的變化規(guī)律,提示模型組大鼠尚能完成心力儲(chǔ)備的釋放。但是,模型組大鼠在較低濃度ISO的刺激下便達(dá)到各觀測(cè)指標(biāo)峰值,且各峰值顯著低于正常組大鼠,說(shuō)明其心力儲(chǔ)備量明顯減少,在較低ISO濃度時(shí)心力儲(chǔ)備即被耗竭,而無(wú)法滿足更高濃度ISO刺激下更強(qiáng)心臟收縮的要求。同基礎(chǔ)狀態(tài)相比,ISO激發(fā)下,兩組大鼠血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)差異也更為明顯,各指標(biāo)差距得以大幅放大,部分原正常指標(biāo)出現(xiàn)異常,更為直觀地顯現(xiàn)了模型組大鼠心臟舒縮功能的下降及潛在的心功能異常。此外,本實(shí)驗(yàn)還觀察到,在IPT初的生理鹽水注射中,正常組大鼠的心臟表現(xiàn)出更為強(qiáng)烈的生理反應(yīng)。這個(gè)現(xiàn)象很好的說(shuō)明了模型組大鼠心血管系統(tǒng)對(duì)血容量改變的反應(yīng)能力下降,證明了模型鼠心血管整體調(diào)節(jié)機(jī)制啟動(dòng)或作用效果(心肌舒縮能力改變)的異常。

將以上功能學(xué)參數(shù)結(jié)果同形態(tài)學(xué)改變比較分析,可發(fā)現(xiàn)兩者間存在著較好的一致性:模型大鼠心肌細(xì)胞壞死、退行性變,心肌質(zhì)量下降,導(dǎo)致心臟外在及儲(chǔ)備收縮能力下降;心肌細(xì)胞肥大和(或)增生,造成左心室壁順應(yīng)性減低,影響心臟舒張功能;同時(shí)心室擴(kuò)張,心肌收縮初長(zhǎng)度加大,使得心肌收縮時(shí)難以處于最適初長(zhǎng)度范圍。在電鏡片中,心肌細(xì)胞肌原纖維斷裂、線粒體受損嚴(yán)重,致使心肌收縮的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)受到破壞、細(xì)胞能量供應(yīng)銳減,進(jìn)一步減弱心臟舒縮能力和心力儲(chǔ)備,降低每搏輸出量,加重心功能紊亂。此外,值得指出的是,研究中模型組大鼠靜息與激發(fā)狀態(tài)下心率均低于正常組大鼠,這一現(xiàn)象是慢性酒精攝入所特有的,區(qū)別于急性酒精作用的正性心率效應(yīng)[10]。

綜上,本研究采用酒精灌胃法成功建立了ACM大鼠模型,并通過(guò)左心室插管、IPT、病理及超微結(jié)構(gòu)觀察等多種方法對(duì)模型進(jìn)行了較為全面的評(píng)價(jià)。其中IPT作為一種便捷手段,能夠有效激發(fā)受試動(dòng)物在麻醉狀態(tài)下的心力儲(chǔ)備,并予以定量考察。該法對(duì)組間心功能指標(biāo)差異具放大效應(yīng),可使各組間參數(shù)差異增幅,利于觀察和比較分析;同時(shí),其還可顯示靜息狀態(tài)下難以偵測(cè)的心功能異常,使輕微心功能下降得以更有效暴露,特別利于疾病早期模型的評(píng)價(jià),對(duì)其他心臟病模型亦有推廣應(yīng)用價(jià)值。

衷心感謝福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科張聲主任醫(yī)師、福建醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)系張文敏教授、福建醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)與工程學(xué)院黃焱教授在文稿修改與病理學(xué)觀察方面所給與的幫助、指導(dǎo),感謝何瑞嵐老師贈(zèng)予的相關(guān)實(shí)驗(yàn)資料。

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