水黃皮根總黃酮對大鼠乙酸型胃潰瘍胃黏膜EGF及TGF-α表達(dá)的影響*

劉可云,朱 毅,黃賢珍

(1.湖北民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室,恩施 445000;2.海南省藥品檢驗(yàn)所,?？?570216;3.湖北省恩施州中心醫(yī)院腎內(nèi)科,恩施 445000)

水黃皮 Pongamia pinnata(L.)Merr.(異名Pongamia glabra)為豆科(Leguminosae)水黃皮屬(Pongamia Vent.)的半紅樹植物,別名水流豆,廣泛分布于印度、馬來西亞及我國南部的廣東、廣西、海南。在印度,其種子和種子油用來治療白斑病、麻風(fēng)病、腰部風(fēng)濕痛、關(guān)節(jié)風(fēng)濕病,葉子用于治療痔瘡、腫瘤、傷口消炎等病癥[1]。前期動物研究證實(shí)水黃皮根總黃酮(pongamia pinnata root flavonoids,PRF)具有明顯的抗大鼠實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍作用[2]。本實(shí)驗(yàn)擬通過研究水黃皮根總黃酮對乙酸型胃潰瘍大鼠表皮生長因子(epidermal growth factor-α,EGF)及轉(zhuǎn)化生長因子-α(transforming growth factor-α,TGF-α)表達(dá)的影響 ,從分子水平探討該藥促進(jìn)潰瘍愈合的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級SD大鼠,雌雄兼用,體重180～200g,由廣東省實(shí)驗(yàn)動物中心提供,合格證號:SCXK(粵)2002-0002。在SPF級動物房內(nèi),恒溫(20±2)℃,濕度55%～65%,光照、黑暗各12 h交替,中央空調(diào)集中通風(fēng)每小時(shí)8～15次條件下飼養(yǎng)。喂養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)飼料,飲用水為過濾除菌后的城市自來水。

1.1.2 藥物與試劑 水黃皮根,2006年3月采于海南省?？谑?由海南省藥品檢驗(yàn)所中藥室陳國彪主任藥師鑒定為Pongamia pinnata(L.)Merr的根莖。水黃皮根總黃酮由海南省藥品檢驗(yàn)所中藥室提供,通過成分鑒定和含量分析,總黃酮純度＞65%。西咪替丁片劑(Cimetiding,Cim),購自海南制藥廠有限公司,批號:050701。以上藥品均用0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液配制為混懸液。大鼠EGF放免試劑盒,由中國原子能科學(xué)研究所提供,批號:200611。兔抗大鼠EGF、TGF-α均由武漢博士德生物工程公司提供。SP試劑盒和DAB顯色試劑盒由北京中杉金橋公司提供,批號分別為:52282108和66286185。

1.1.3 主要儀器 K15低溫離心機(jī),美國Sigma公司;SN-69T放免γ計(jì)數(shù)器,上海原子核研究所日環(huán)儀器廠;HM340石蠟切片機(jī),德國萊卡公司;BX50顯微鏡,日本奧林巴斯;HMIAS-2000醫(yī)學(xué)病理分析系統(tǒng),同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)千屏影像工程公司。

1.2 動物模型制備

參照文獻(xiàn)[3]方法,除正常組外各組大鼠禁食24 h,用3%戊巴比妥鈉(0.1 ml/100 g)腹腔注射麻醉,常規(guī)消毒,自劍突向下沿腹中線剪開約2 cm,自肝臟后找出胃,將胃移出腹腔,用微量注射器將0.02 ml 30%的乙酸(假手術(shù)組注射等體積生理鹽水)注射至胃竇部前壁漿膜下近肌層處,待出現(xiàn)直徑約3 mm半透明的白斑后,將胃送還腹腔,以大網(wǎng)膜包裹,縫合腹膜、肌層和皮膚。

1.3 動物分組和給藥

大鼠隨機(jī)分為6組,即正常組、模型組、PRF(50、150和450 mg/kg)組、西咪替丁組 140 mg/kg組,每組8只。造模3 d后,PRF組和西咪替丁組按照劑量灌胃給藥,灌胃體積為10 ml/kg,正常組和模型組均灌胃等體積的0.5%CMC-Na溶液,每日一次,共14 d。

1.4 標(biāo)本采集和處理

治療14 d后,大鼠禁食不禁水24 h,用3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉,摘眼球取血2～3 ml,3 000 r/min離心10 min,分離血清,置于EP管中,-20℃冰箱保存,待測EGF。破腹,在距賁門和幽門1.5 cm處結(jié)扎、離斷,取出全胃。胃內(nèi)注射8 ml含0.1%DEPC的4%多聚甲醛,并全胃置于0.1%DEPC的4%多聚甲醛中固定20 min后,沿胃大彎剪開,冰生理鹽水沖洗,濾紙吸干后鋪開,以游標(biāo)卡尺測定潰瘍最大長徑及垂直于最大長徑的最大寬徑。然后將胃置于含0.1%DEPC的4%多聚甲醛繼續(xù)固定12 h,以平行與胃潰瘍長軸方向的最長徑為中心取材,按常規(guī)脫水,石蠟包埋,并以潰瘍灶或潰瘍疤痕的最長徑為中心5 μ m厚度連續(xù)切片,行HE染色和EFF、TGF-α的免疫組化顯色。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 胃粘膜大體觀察 觀察胃竇部潰瘍的大小、深淺、基底清潔度,有無覆白苔,周圍粘膜色澤及充血水腫等情況。同時(shí)按照文獻(xiàn)[4]方法計(jì)算潰瘍指數(shù)(Ulcer Index,UI)=潰瘍最大長徑 垂直于最大長徑的最大寬徑。并按公式(1-實(shí)驗(yàn)各組潰瘍指數(shù)均值/模型組潰瘍指數(shù)均值)100%計(jì)算潰瘍抑制率。

1.5.2 血清EGF水平測定 自-20℃冰箱取出血清,按照試劑盒說明書以放免法測定血清EGF,以pg/ml表示。

1.5.3 免疫組化及原位雜交顯色 應(yīng)用免疫組化SP法檢測大鼠胃黏膜EGF、TGF-α表達(dá)水平。以PBS替代一抗作為陰性對照,以人乳腺癌標(biāo)本作為陽性對照。以胞膜或胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為顯色陽性。具體操作參照說明書進(jìn)行。應(yīng)用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng),在光學(xué)顯微鏡×400倍下,選取5個(gè)視野 ,以象素點(diǎn)長 0.389 μ m,154.6 μ m ×115.5 μ m 測量窗下測量陽性細(xì)胞面積百分比及其平均積分光密度,取均值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件,所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,不同組間比較采用單因素方差分析,與對照組比較采用dunnet-t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 PRF對大鼠乙酸型胃潰瘍胃黏膜潰瘍指數(shù)的影響

除正常組外各組大鼠腺胃小彎側(cè)黏膜均可見一潰瘍。模型組的大鼠潰瘍面積大,其上被覆白苔,潰瘍底較污穢,周圍黏膜環(huán)堤樣水腫隆起;PRF中、高劑量組及Cim組的大鼠潰瘍面積較小且較表淺,潰瘍基底普遍色紅,覆淺白苔,周邊黏膜輕度水腫。計(jì)算潰瘍UI和潰瘍抑制率發(fā)現(xiàn),PRF中、高劑量組及Cim組UI明顯低于模型組(P＜0.01),低劑量組UI也低于模型組但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。與西咪替丁組相比,PRF大劑量組UI明顯降低(P＜0.05),而中劑量沒有明顯差異(P＞0.05),但是PRF低劑量組UI明顯大于Cim組(P＜0.05,表1)。

2.2 PRF對乙酸型胃潰瘍大鼠血清EGF水平的影響

與正常組比較,模型組血清EGF含量顯著增高(P＜0.05);與模型組比較,PRF中、高劑量組和Cim組血清EGF含量明顯增高(P＜0.05,P＜0.01);與西咪替丁組比較,PFR高劑量組EGF含量明顯增高(P＜0.05),而中劑量組EGF未見明顯變化(P＞0.05),但西咪替丁組明顯高于PRF低劑量組(P＜0.05,表 1)。

Tab.1 Effects of PRF on Ulcer Index and contents of EGF in blood serum in rats(±s,n=8)

Tab.1 Effects of PRF on Ulcer Index and contents of EGF in blood serum in rats(±s,n=8)

PRF:Pongamia pinnata root flavonids;Cim:Cimetiding**P＜0.01 vs normal group;#P＜0.05,##P＜0.01 vs model group;△P＜0.05 vs Cim group

Group Dose(mg/kg) Ulcer Index The ulcer inhibition rate/%The contents of EGF in blood serum(pg/ml)Normal - - - 552.21±76.91 Model - 27.32±5.27* - 623.72±81.10*PRF 50 20.13±3.76 26.32 629.56±89.04 150 15.86±3.19**## 41.98.56 711.07±80.15**#450 5.83±2.46**##△ 78.66 728.94±106.55**#△Cim 140 12.33±4.05**## 54.87 656.25±87.17**#

2.3 PRF對大鼠乙酸型胃潰瘍胃黏膜EGF表達(dá)的影響

正常組的大鼠EGF的表達(dá)為弱陽性,定位于胞漿,主要集中在胃腺頸部,陽性表達(dá)細(xì)胞以胃黏膜壁細(xì)胞、頸部細(xì)胞為主。與正常組比較,模型組、Cim組和PRF各劑量組潰瘍邊緣組織陽性表達(dá)明顯增強(qiáng)(P＜0.01)。與模型組比較,PRF中、高劑量組和Cim組表達(dá)均顯著增加(P＜0.05,P＜0.01)。與Cim組比較,PRF低劑量組EGF表達(dá)明顯低于Cim組(P＜0.05),PRF中劑量組EGF表達(dá)與Cim組沒有顯著性差異(P＞0.05),而PRF高劑量組潰瘍邊緣胃黏膜EGF表達(dá)則顯著強(qiáng)于Cim組(P＜0.05,圖1,表 2)。

Tab.2 Effects of PRF on EGF expression of gastric ulcer induced by acetic acid(±s,n=8)

Tab.2 Effects of PRF on EGF expression of gastric ulcer induced by acetic acid(±s,n=8)

PRF:Pongamia pinnata root flauonoids;Cim:Cimetiding**P＜0.01 vs normal group;#P＜0.05,##P＜0.01 vs control group;△P＜0.05 vs Cim group

Group Dose(mg/kg)Percentage of acreage(%)Integral optic density Normal- 5.82±1.30 0.59±0.21 Model - 13.01±4.03** 1.47±0.34**PRF 50 17.57±3.69** 1.92±0.63**150 24.68±4.11**## 3.25±0.84**##450 27.98±4.30**##△ 3.73±1.23**##△Cim 140 20.45±5.24**# 2.48±0.81**##

Fig.1 Effects of PRF on EGF expression of gastric ulcer induced by acetic acid in rats(DAB×400)

2.4 PRF對大鼠乙酸型胃潰瘍胃黏膜TGF-α表達(dá)的影響

正常組的大鼠TGF-α的表達(dá)為弱陽性,定位于胞漿,主要集中在胃腺頸部、基底部,陽性表達(dá)細(xì)胞以胃黏膜壁細(xì)胞、頸部細(xì)胞為主。與正常組比較,模型組、Cim組和PRF各劑量組潰瘍邊緣組織陽性細(xì)胞表達(dá)積分光密度明顯增強(qiáng)和陽性細(xì)胞面積百分比明顯增多(P＜0.01)。與模型組比較,PRF中、高劑量組和Cim組陽性細(xì)胞表達(dá)積分光密度和陽性細(xì)胞面積百分比表達(dá)均顯著升高(P＜0.01),PRF低劑量組陽性細(xì)胞表達(dá)積分光密度顯著增強(qiáng)陽性細(xì)胞表達(dá)積分光密度,而陽性細(xì)胞面積百分比沒有明顯差異(P＞0.05)。與Cim組比較,PRF低劑量組TGF-α表達(dá)明顯低于Cim組(P＜0.05),PRF中劑量組TGF-α表達(dá)與Cim組沒有顯著性差異(P＞0.05),而PRF高劑量組潰瘍邊緣胃黏膜TGF-α表達(dá)則顯著高于Cim 組(P＜0.05,表3)。

Tab.3 Effects of PRF on TGF-αexpression of gastric ulcer induced by acetic acid in rats(±s,n=8)

Tab.3 Effects of PRF on TGF-αexpression of gastric ulcer induced by acetic acid in rats(±s,n=8)

PRF:Pongamia pinnata root flavonoids;Cim:Cimetiding**P＜0.01 vs normal group;#P＜0.05,##P＜0.01 vs control group;△P＜0.05,△△P＜0.01 vs Cim group

Group Dose(mg/kg)Percentage of acreage(%)Integral optic density Normal- 8.73±2.81 0.71±0.22 Model- 15.13±3.94** 1.59±0.26**PRF 50 18.65±4.67**# 1.85±0.43**150 25.52±5.02**## 2.51±0.65**##450 28.68±6.07**##△△3.09±0.95**##△Cim 140 24.79±4.98**## 2.61±0.78**#

3 討論

由于乙酸型大鼠胃潰瘍模型具有形態(tài)類似于臨床胃潰瘍,病變持續(xù)時(shí)間長,其修復(fù)過程與人的胃潰瘍類似[5],因此比較適合于藥物治療胃潰瘍的療效評價(jià),以及藥理作用機(jī)制的研究。對實(shí)驗(yàn)性潰瘍愈合過程的研究表明[6],不管潰瘍成因如何,一旦潰瘍形成,其修復(fù)及愈合都經(jīng)歷共同相似的過程。壞死物的清除,潰瘍底部的肉芽組織形成,進(jìn)而形成纖維組織和瘢痕組織。潰瘍邊緣的粘膜結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,腺體呈囊狀擴(kuò)張且頂端向潰瘍底部凹陷,形成一“過渡帶”。在生長因子的作用下,潰瘍邊緣的粘膜上皮增生、分化并向潰瘍中心移行,逐漸以單層上皮覆蓋潰瘍底部;擴(kuò)張的腺體及再生的上皮細(xì)胞逐漸形成管狀結(jié)構(gòu),分化腺體,最終形成正常成熟的腺體。胃潰瘍的愈合是一個(gè)非常復(fù)雜的過程,包括細(xì)胞移行、分化、增殖和細(xì)胞基質(zhì)形成及新生血管生成等,多個(gè)細(xì)胞因子參與了這一過程。

EGF是主要存在于頜下腺、十二指腸Brunner腺頜胰腺中,是一種含有53個(gè)氨基酸的單鏈多肽[7]?，F(xiàn)已證實(shí)EGF是一種具有抑制胃酸分泌、促進(jìn)上皮細(xì)胞增殖,組織修復(fù)及細(xì)胞保護(hù)作用的內(nèi)源性物質(zhì),在保護(hù)胃粘膜免受損傷因子破壞、維持胃腸粘膜完整性方面起到非常重要的作用。在小鼠實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍模型中,在潰瘍發(fā)生的第2～4天,即有EGFRmRNA表達(dá),4天后有EGF過度表達(dá)。大鼠乙酸胃潰瘍自愈過程中,EGF、TGF-α、EGFR的表達(dá)發(fā)生規(guī)律性的變化,潰瘍邊緣組織表達(dá)比正常組明顯增高,壞死組織無表達(dá),肉芽組織、瘢痕組織少有表達(dá),潰瘍的早期表達(dá)不明顯,潰瘍的愈合期則表達(dá)明顯[8]。

EGFR是一具有酪氨酸激酶活性的跨膜蛋白,分子量為170 000,主要分布在胃壁、十二指腸和小腸粘膜上,有 EGF 、TGF-α兩種配體,對 EGF、TGF-α有高度親和力,對其誘導(dǎo)產(chǎn)生變構(gòu),形成受體二聚體,激活受體膜內(nèi)區(qū)域的酪氨酸蛋白激酶,使自身的一系列酪氨酸被磷酸化,通過Grb2和Sos最終激活P21ras而傳導(dǎo)信號,調(diào)節(jié)細(xì)胞生長與分化[9]。

TGF-α是EGF家族中的另一參與胃粘膜損傷后修復(fù)的主要調(diào)節(jié)肽,產(chǎn)生于整個(gè)胃腸道,尤以胃竇部粘膜表達(dá)量高,TGF-α具有對多種細(xì)胞促有絲分裂作用,如上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、纖維組織和粘膜組織等。在胃腸道TGF-α參與調(diào)節(jié)粘膜上皮的更新和粘膜損傷后的修復(fù),是維持粘膜完整性的重要介質(zhì),被稱為“粘膜完整肽”[7]。壁細(xì)胞膜表面有其受體,提示TGF-α通過自分泌的形式調(diào)節(jié)壁細(xì)胞的泌酸功能[10]。

本研究通過放免法、免疫組化法,探討了PRF對大鼠乙酸燒灼型胃潰瘍胃粘膜組織EGF、TGF-α表達(dá)的影響。在治療14 d后,模型組大鼠 EGF、TGF-α的表達(dá)較正常組強(qiáng),EGF、TGF-α、定位于胞漿,主要集中在潰瘍邊緣組織的胃腺頸部及基底部的壁細(xì)胞、頸部細(xì)胞。與文獻(xiàn)報(bào)道一致[7]。胃腺頸部及基底部是胃粘膜上皮細(xì)胞增殖的部位。因此提示,PRF組能顯著增加潰瘍邊緣組織EGF、TGF-α表達(dá)。提示PRF可能通過促進(jìn)潰瘍邊緣粘膜組織細(xì)胞的分化、增殖來促進(jìn)潰瘍的修復(fù)和愈合。EGFR的增加除了介導(dǎo)粘膜上皮的分裂、增殖外,還介導(dǎo)抑制胃酸的分泌,是胃潰瘍組織修復(fù)過程中的主要環(huán)節(jié)。據(jù)報(bào)道[10]當(dāng)血液循環(huán)中的EGF與該受體結(jié)合后,可抑制胃酸的分泌。本研究發(fā)現(xiàn)PRF能明顯抑制胃酸的分泌;能顯著提高血清中EGF的含量。提示PRF可能通過增加血液中EGF含量,提高胃粘膜組織EGF表達(dá),抑制胃酸的分泌、促進(jìn)潰瘍的愈合。

由此推測PRF促進(jìn)乙酸燒灼型潰瘍愈合可能與促進(jìn)潰瘍邊緣組織EGF、TGF-α的表達(dá),刺激潰瘍邊緣“愈合帶”上皮細(xì)胞增殖、分化和移行,增加胃粘膜的血流量,改善微循環(huán),抑制胃酸的分泌有關(guān)。

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