HPLC 法測定復(fù)方喜樹堿貼膏中喜樹堿的含量

劉偉林

廣西壯族自治區(qū)食品藥品檢驗所，廣西 南寧 530021

喜樹堿 (Camptothecine)為具抗腫瘤活性，為植物喜樹的果實中提取的生物堿，其注射液作為抗惡性腫瘤藥已在臨床上應(yīng)用。復(fù)方喜樹堿貼膏為喜樹堿、山蒼子油、冰片等的復(fù)方橡膠制劑，為角質(zhì)促成劑，減少局部皮膚角質(zhì)增生，主要用于斑塊狀，尋常型銀屑病。其主要有效成分為喜樹堿，具有抗腫瘤活性，故對其進(jìn)行含量測定是產(chǎn)品質(zhì)量控制的關(guān)鍵。該制劑原含量測定方法為紫外導(dǎo)數(shù)光譜法，是測定共軛體系的吸收光譜，而復(fù)方喜樹堿貼膏除含喜樹堿外，還共存有10-羥基喜樹堿 (10-hgdroxg Camptothecine)、10-甲氧基喜樹堿 (10-methoxy Camptothecine)等同系物，因此其測定受到干擾?，F(xiàn)采用HPLC法，將喜樹堿與其他干擾成分分離，結(jié)果滿意。

我們采用高效液相色譜法，對喜樹堿進(jìn)行含量測定方法研究，經(jīng)方法學(xué)考察，其準(zhǔn)確性、精密度、重現(xiàn)性均較好，可用于產(chǎn)品的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

儀器 ①Waters高效液相色譜儀 (1、600E泵，2487紫外檢測器，717自動進(jìn)樣器;2、515泵×2，996二極管陣列檢測器，717自動進(jìn)樣器)，Millennium32色譜工作站，Inertsil ODS-3 C18色譜柱，4.6×250mm，5μm; ② Sartorius BP211D電子天平。

喜樹堿對照品 (20011025)由廣西東蘭藥廠提供 (高效液相法歸一化純度檢查為98.80%。)

樣品 復(fù)方喜樹堿貼膏，批號：20080301，20080302，200820303;陰性樣品 (內(nèi)含除喜樹堿外的其它成分);均由桂林天和藥業(yè)股份有限公司提供。

流動相用的甲醇、四氫呋喃均為色譜純，水為純化水。其余試劑均為化學(xué)純。

2 試驗及結(jié)果

2.1 溶出及提取條件的選定

本品劑型為橡膠膏劑，方中除所含4種原料相互干擾外，基質(zhì) (主要由橡膠、松香、溶媒等組成)對含量測定的影響較大，應(yīng)盡量予以清除。故采取先以石油醚將膏體從載體中溶解分離，再用75%甲醇提取喜樹堿。

經(jīng)實驗，用75%甲醇提取5次后，提取液在紫外光燈(254nm)下檢視，已無熒光，說明喜樹堿已被提取完全。為保證提取完全，將提取次數(shù)定為6次。

2.2 對照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取喜樹堿對照品16.14mg(相當(dāng)于喜樹堿純品15.95mg)，置200ml量瓶中，加甲醇適量，于60℃水浴中振搖溶解，冷卻后用甲醇稀釋至刻度，搖勻;即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品10片，除去隔膜，剪成細(xì)條，混勻，精密稱取適量W(約相當(dāng)于1/2片)，置錐形瓶中，用石油醚 (60～90℃)20、15、10、10ml攪拌洗滌4次，洗滌液合并，移入分液漏斗中，再用75%甲醇溶液振搖提取 6次 (20、15、15、15、15、15ml，每次用75%甲醇溶液先洗滌錐形瓶中布條)，分取下層液，濾入100ml量瓶中，用75%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 取不含喜樹堿的陰性樣品10片，按“供試品溶液的制備”項下的方法操作，即得。

2.3 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

2.3.1 色譜條件 柱溫30℃，檢測波長：254nm，流動相：甲醇—10%四氫呋喃 (48：52)，流速：1.0ml/min，進(jìn)樣量為 20μl。

2.3.2 檢測波長的確定

采用上述的液相色譜條件，取喜樹堿對照品溶液注入液相色譜儀中，進(jìn)行二極管陣列檢測器光譜掃描，其在253.6nm、358.2nm 和 366.5nm 處都有吸收峰，以 253.6nm吸收最高，故選取254nm作為測定波長。

在上述色譜條件下，分別吸取對照品溶液，供試品溶液和陰性對照溶液各20μ1，注入液相色譜儀，色譜圖見圖1、2、3。供試品在與喜樹堿對照品相同的保留時間里有一對應(yīng)的色譜峰，陰性對照溶液 (缺喜樹堿)無干擾;以喜樹堿計，理論板數(shù)為3000，分離度大于1.5，故此色譜條件可滿足測定的要求。

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取喜樹堿對照品溶液 5.0、10.0、20.0、30.0、40.0ml，分置100ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度。分別取上述對照品溶液20μl注入液相色譜儀，測定。以進(jìn)樣量X(μg)對峰面積Y(A)進(jìn)行線性回歸分析得回歸方程：y=2584829.1x-6368.3，r=1.0000。

結(jié)果表明，喜樹堿進(jìn)樣量在0.039875～0.319μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗

吸取供試品溶液 (批號20080301)各20μl，分別連續(xù)注入液相色譜儀6次，測定峰面積，RSD為0.25%(n=6)，結(jié)果表明精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗

取樣品 (批號20080301)，依法操作，平行操作6份，吸取供試品溶液20μl，注入液相色譜儀，計算含量，含量分別為 83.60%、83.94%、84.04%、83.25%、83.77%、83.45%，RSD為0.36%，結(jié)果表明重復(fù)性較好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取對照品溶液，按照擬定的含量測定方法測定，放置1、2、4、6、12小時后，再次測定，RSD為0.68%，結(jié)果表明溶液穩(wěn)定性良好。

2.8 回收率試驗

采用模擬回收試驗方法。取陰性樣品 (缺喜樹堿)1/2片，除去隔膜，剪成細(xì)條，置錐形瓶中，共9份，分別精密加入喜樹堿對照液 ［精密稱取喜樹堿對照品①66.98mg(相當(dāng)于 66.18mg)，②82.96mg(相當(dāng)于 81.96mg)，③99.04mg(相當(dāng)于97.85mg)，分置 100ml量瓶中，加甲醇適量，于60℃水浴中振搖溶解，冷卻后用75%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。］1ml，每個濃度加3份，用石油醚(60～90℃)20、15、10、10ml攪拌洗滌四次，洗滌液移入分液漏斗中，按“2.2.2供試品溶液的制備方法”制備供試品溶液，依法測定，計算回收率。結(jié)果三種濃度共9份的平均回收率為97.8%(RSD為0.62%，n=9)。

2.9 含量測定及限度

取本品3批，按擬定的含量測定方法測定，結(jié)果分別為 83.64%(RSD 為 0.55%，n=2)、90.30%(RSD 為0.15%，n=2)、84.24%(RSD 為 0.60%，n=2)。由結(jié)果知，含量均在標(biāo)示量的83.0% ～91.0%以內(nèi)，考慮到本品為外用橡皮膏劑，生產(chǎn)工藝煩瑣，樣品含量差異較大，故擬定含量限度為80.0% ～120.0%。

3 討論

本文建立了反相高效液相色譜法測定復(fù)方喜樹堿貼膏中喜樹堿含量得方法，為進(jìn)一步完善復(fù)方喜樹堿貼膏的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了準(zhǔn)確、簡單、可行的測定方法。

我們比較了甲醇-水、乙腈-水及乙腈-10%四氫呋喃等流動相系統(tǒng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)后者具有最佳分離效果。

在實驗中我們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)提取溫度較高時，容易將喜樹堿提取完全。當(dāng)溫度高于30℃時，提取次數(shù)僅為3～4次即可將喜樹堿提取完全，因此為了將喜樹堿提取完全，應(yīng)控制提取溫度在一個較高的范圍。