分散微固相萃取-超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜法測定葡萄酒和啤酒中多菌靈和噻菌靈

高 潔, 陳達(dá)煒, 趙云峰

(國家食品安全風(fēng)險評估中心, 衛(wèi)生部食品安全風(fēng)險評估重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100021)

多菌靈(carbendazim)和噻菌靈(thiabendazole)均為苯并咪唑類殺菌劑,具有高效、低毒、廣譜、內(nèi)吸性等特點(diǎn),被廣泛用于水果、蔬菜的病蟲害防治及防腐。多菌靈能有效抑制病原菌的繁殖和生長,是一種可疑的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物,具有顯著的生殖毒性。噻菌靈主要應(yīng)用于果蔬的防腐,已有動物實(shí)驗(yàn)表明其具有急性腎毒性[1]?；谶@類殺菌劑對人類健康潛在的危害性,國際食品法典委員會(CAC)、歐盟、美國、日本等組織和國家先后制定了這類殺菌劑在農(nóng)產(chǎn)品及加工食品中的最大殘留限量(MRL)[2-4]。我國在頒布的食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[5]中也規(guī)定了其在蔬菜、水果、谷物、飲料等食品中的MRL,如多菌靈在葡萄和大麥中的MRL值分別為3 mg/kg和0.5 mg/kg,但目前尚未對葡萄酒和啤酒等酒類中的這類殺菌劑作出限量規(guī)定。

葡萄酒是用新鮮葡萄或葡萄汁經(jīng)過發(fā)酵后制成的,啤酒由麥芽發(fā)酵而成,葡萄或麥芽在種植過程中,為防止病蟲害都有可能使用苯并咪唑類農(nóng)藥,導(dǎo)致葡萄酒和啤酒中存在該類農(nóng)藥殘留。目前國內(nèi)外對農(nóng)產(chǎn)品及加工食品中苯并咪唑類殺菌劑的檢測方法主要有氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[6]、高效液相色譜法(HPLC)[7,8]、液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)[9,10]等,多集中在蔬菜、水果、果汁等食品基質(zhì),針對酒類食品的研究則很少。在實(shí)際樣品分析中,樣品前處理是整個分析過程中的重要一環(huán)。苯并咪唑類農(nóng)藥的前處理方法主要有液-液萃取法[11]、QuEChERS法[12,13]、固相萃取法(SPE)[14,15]、固相微萃取法[16]等。分散微固相萃取(DMSPE)技術(shù)的原理是,將待凈化提取液直接加入裝有填料的離心管中,先通過渦旋振蕩等方式將目標(biāo)物吸附于填料上,后用解吸附溶劑進(jìn)行洗脫,從而起到凈化的作用[17]。DMSPE技術(shù)相較于傳統(tǒng)的SPE技術(shù),無需繁瑣的淋洗、平衡和濃縮等過程,具有耗時短、消耗溶劑少和價格低廉等特點(diǎn)。該技術(shù)尤其適用于含水基質(zhì),如環(huán)境水、酒類或飲料,石墨烯、碳納米管和磁性材料是該技術(shù)最為常用的吸附填料[18-20]。強(qiáng)陽離子交換填料(PCX)作為一種高分子聚合填料,帶有磺酸根官能基團(tuán),對堿性物質(zhì)具有較佳的吸附作用,已在SPE中廣泛應(yīng)用[21]。

本研究基于多菌靈和噻菌靈弱堿性的結(jié)構(gòu)特征,選取PCX作為吸附劑,采用DMSPE技術(shù)對葡萄酒和啤酒樣品進(jìn)行前處理,結(jié)合超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜(UHPLC-HRMS)技術(shù),建立了快速測定葡萄酒和啤酒中多菌靈和噻菌靈的方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)(Q Exactive,美國Thermo-Fisher公司);渦旋混合器(美國Scientific Industries公司)。

多菌靈、噻菌靈和多菌靈-d4標(biāo)準(zhǔn)品(純度>98.0%, Dr. Ehrenstorfer公司);乙腈(色譜純,美國Fisher Scientific公司);甲酸和甲酸銨(HPLC級,美國Tedia公司);氨水(HPLC級,上海安譜公司);實(shí)驗(yàn)用水為超純水,由美國Millipore公司純水儀制備。

陽離子交換聚合填料(PCX,天津博納艾杰爾公司)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取多菌靈、噻菌靈及多菌靈-d4標(biāo)準(zhǔn)品10 mg(精確至0.1 mg)于10 mL容量瓶中,用甲醇溶解并定容至刻度,配成1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液,于-20 ℃儲存。用甲醇稀釋多菌靈和噻菌靈標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液,配制成10 mg/L和1 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,于-4 ℃儲存。用甲醇稀釋多菌靈-d4標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液,配制成1 mg/L的內(nèi)標(biāo)工作液,于-4 ℃儲存。

1.3 樣品處理

啤酒樣品預(yù)先通過超聲處理30 min后,準(zhǔn)確吸取酒類樣品1.0 mL于裝有15 mg PCX填料的2 mL離心管中(含內(nèi)標(biāo)多菌靈-d42 μg/L),渦旋混勻30 s后,將其轉(zhuǎn)移至帶有0.22 μm微孔濾膜的1 mL 針頭注射器中過濾,棄去濾液,目標(biāo)物則吸附于PCX填料上,保留在0.22 μm微孔濾膜上;PCX填料使用注射器進(jìn)一步用1 mL乙腈淋洗后,用2.0 mL 5%(體積分?jǐn)?shù))氨水乙腈-水(4∶6, v/v)洗脫,收集洗脫液,供儀器分析。

1.4 儀器分析條件

色譜條件:BEH C18色譜柱(50 mm×2. 1 mm, 1.7 μm)。流動相A為水,含0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸和5 mmol/L甲酸銨,B為甲醇,含0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸和5 mmol/L甲酸銨。梯度洗脫:0～2.0 min, 20%B; 2.0～3.0 min, 20%B～30%B; 3.0～3.5 min, 30%B～90%B; 3.5～5.5 min, 90%B～20%B。進(jìn)樣量:5 μL;流速:200 μL/min;柱溫:40 ℃。

質(zhì)譜條件:采用加熱電噴霧離子化(heated electrospray ionization, HESI)方式;噴霧電壓3.5 kV;毛細(xì)管溫度320 ℃;加熱器溫度300 ℃;鞘氣40 arb,輔助氣10 arb;正離子采集模式,定量掃描模式為靶向單一離子監(jiān)測(targeted single ion monitoring, tSIM),分辨率為70 000 FWHM,掃描寬度為4 Da,定性二級質(zhì)譜掃描模式為數(shù)據(jù)依賴的二級質(zhì)譜掃描(data dependent tandem mass spectrometry, ddMS2),分辨率為17 500 FWHM, 歸一化碰撞能量(normalized collision energy, NCE)為60%。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜采集模式的選擇

本研究比較了Q Exactive HRMS中3種定量掃描模式,包括全掃描(full scan, FS)、tSIM和平行反應(yīng)監(jiān)測(parallel reaction monitoring, PRM)。其中FS和tSIM模式是以化合物的精確母離子進(jìn)行定量,而PRM模式是先在一級質(zhì)譜中選擇性地提取目標(biāo)化合物的母離子,而后經(jīng)過高能量碰撞池對母離子進(jìn)行碎片裂解,在二級質(zhì)譜中監(jiān)測該母離子的所有碎片,以精確二級碎片離子進(jìn)行定量分析。采用直接進(jìn)樣方式,對質(zhì)量濃度為0.1 μg/L的多菌靈和噻菌靈混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分別采用以上3種模式進(jìn)行掃描分析,發(fā)現(xiàn)目標(biāo)化合物多菌靈和噻菌靈在tSIM和PRM模式下的分析性能均較FS模式更高,信噪比(S/N)約為FS模式的4倍(見圖1a),這主要是由于tSIM較FS模式具有更窄的質(zhì)量掃描寬度(4 Da),從而產(chǎn)生較低的背景噪音,而PRM模式則是通過二級質(zhì)譜碎裂降低背景噪音,但tSIM操作較PRM模式簡單,無需進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化。因此,最終選擇tSIM模式對目標(biāo)化合物進(jìn)行定量分析。目標(biāo)化合物的定性確證,通過ddMS2模式對母離子進(jìn)行二級質(zhì)譜碎裂,在60%的NCE能量下獲取二級質(zhì)譜碎片譜圖,目標(biāo)化合物的二級質(zhì)譜碎片離子信息見表1,圖1b為多菌靈的二級質(zhì)譜碎片離子圖。

表 1 分析物的保留時間和質(zhì)譜信息Table 1 Retention times and mass spectrometric information of the analytes

2.2 樣品前處理方法的選擇與優(yōu)化

根據(jù)目標(biāo)化合物多菌靈和噻菌靈弱堿性的結(jié)構(gòu)特征,選取帶有磺酸根官能基團(tuán)的強(qiáng)陽離子交換填料作為DMSPE前處理的吸附填料,通過渦旋振蕩對目標(biāo)化合物進(jìn)行選擇性吸附;氨水乙腈-水溶液則可作為解吸附溶劑,將目標(biāo)化合物從PCX填料上洗脫,從而達(dá)到提取與凈化樣品的目的。

對于DMSPE前處理技術(shù),吸附填料PCX的用量、洗脫溶劑中氨水的體積分?jǐn)?shù)、乙腈的體積分?jǐn)?shù)和洗脫體積是影響提取效率的主要因素。在前期研究[17]中發(fā)現(xiàn)，PCX在對堿性物質(zhì)的吸附過程較快,僅短短30 s即可達(dá)到吸附平衡。因此,本研究針對上述參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,以回收率為考核指標(biāo),在空白葡萄酒50 μg/L的加標(biāo)水平下,分別對PCX用量(5～30 mg)、氨水的體積分?jǐn)?shù)(1%～10%)、洗脫溶劑中乙腈的體積分?jǐn)?shù)(30%～100%)和洗脫體積(1.0～3.0 mL)進(jìn)行考察,結(jié)果如圖2所示。圖2a顯示,隨著PCX用量的增加(5～15 mg),多菌靈和噻菌靈的吸附效應(yīng)不斷增加,當(dāng)用量達(dá)到20 mg及以上,吸附效應(yīng)達(dá)到平衡,說明高表面比的PCX填料具有較高的吸附性能,故本實(shí)驗(yàn)采用PCX的用量為15 mg。在一定濃度的氨水洗脫劑下,吸附于PCX填料上的堿性目標(biāo)物易從PCX填料上解吸附下來。圖2b顯示,洗脫溶劑中氨水的體積分?jǐn)?shù)為5%時,洗脫效果達(dá)到最佳。乙腈具有較強(qiáng)的洗脫能力,但高比例的乙腈也會將弱極性雜質(zhì)洗脫下來,本研究考察不同體積分?jǐn)?shù)的乙腈對目標(biāo)物的洗脫能力。圖2c顯示,乙腈體積分?jǐn)?shù)為40%時，含5%(體積分?jǐn)?shù))氨水的乙腈水溶液可以將目標(biāo)物洗脫,同時無

圖 1 (a)多菌靈(0.1 μg/L)在3種不同質(zhì)譜采集模式下、噻菌靈(0.1 μg/L)在tSIM模式下的提取離子色譜圖和(b)多菌靈的碎片離子質(zhì)譜圖 Fig. 1 (a) Exactive ion chromatograms of carbendazim(0.1 μg/L) in three different acquistion modes, thiabendazole (0.1 μg/L) in tSIM mode and (b) fragment mass spectrum from carbendazim FS: full scan;PRM: parallel reaction monitoring; tSIM: targeted single ion monitoring.

圖 2 (a)PCX填料用量、(b)氨水的體積分?jǐn)?shù)、(c)乙腈的體積分?jǐn)?shù)和(d)洗脫體積對多菌靈和噻菌靈提取效率的影響 Fig. 2 Effects of (a) the amount of a strong cation exchangeadsorbent (PCX), (b) the volume percentage of ammonium hydroxide, (c) the volume percentage of acetonitrile, and (d) the desorption solvent volume on extraction efficiencies of carbendazim and thiabendazole

溶劑效應(yīng)存在,而乙腈的體積分?jǐn)?shù)為50%時存在一定的溶劑效應(yīng),100%時則溶劑效應(yīng)明顯。因此最終選擇5%(體積分?jǐn)?shù))氨水乙腈-水(4∶6, v/v)進(jìn)行洗脫。洗脫溶劑的體積將直接影響分析目標(biāo)物的回收效率,圖2d顯示,2.0 mL的洗脫溶劑可以將目標(biāo)化合物多菌靈和噻菌靈完全洗脫。綜上分析,本研究采用15 mg PCX吸附多菌靈和噻菌靈,用2.0 mL 5%(體積分?jǐn)?shù))氨水乙腈-水(4∶6, v/v)進(jìn)行洗脫。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)的考察

用5%(體積分?jǐn)?shù))氨水乙腈-水(4∶6, v/v)配制多菌靈和噻菌靈的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。同時,按照1.3節(jié)中前處理方法,用空白葡萄酒和啤酒樣品制備空白葡萄酒和啤酒基質(zhì)溶液,用空白基質(zhì)溶液配制同濃度水平的系列基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液。通常以基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率與純?nèi)軇┡渲茦?biāo)準(zhǔn)曲線的斜率之比來評價基質(zhì)效應(yīng),比值越接近1.0,說明基質(zhì)效應(yīng)越弱。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,多菌靈在葡萄酒和啤酒樣品中的曲線斜率比值分別為0.96±0.01和1.01±0.02 (n=3),噻菌靈的斜率比值分別為0.94±0.03和0.98±0.01 (n=3),說明多菌靈和噻菌靈在葡萄酒和啤酒樣品中不存在明顯的基質(zhì)效應(yīng),本方法凈化效果良好。

2.4 定量方法學(xué)考察

2.4.1 線性范圍、檢出限與定量限

配制多菌靈和噻菌靈的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,質(zhì)量濃度范圍為0.01～50 μg/L,內(nèi)標(biāo)法定量,內(nèi)標(biāo)多菌靈-d4的質(zhì)量濃度為1 μg/L。將標(biāo)準(zhǔn)溶液注入儀器中,以標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),多菌靈、噻菌靈分別與多菌靈-d4提取母離子的色譜峰峰面積比值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明,多菌靈和噻菌靈在表2所列的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)R2≥0.999 9。對空白葡萄酒和啤酒樣品分別進(jìn)行低水平加標(biāo)試驗(yàn),按已建立的方法測定。以3倍信噪比對應(yīng)的加標(biāo)水平為檢出限,10倍信噪比對應(yīng)的加標(biāo)水平為定量限,結(jié)果顯示葡萄酒和啤酒具有相同的檢出限和定量限,具體結(jié)果見表2。從結(jié)果看,能夠滿足酒類樣品中多菌靈和噻菌靈殘留檢測的要求。

表 2 分析物的線性關(guān)系、檢出限及定量限Table 2 Linear relationships, LODs and LOQs of the analytes

R2: correlation coefficient;Y: peak area ratio of the analyte to the internal standard;X: mass concentration of the analyte, μg/L.

2.4.2 準(zhǔn)確度和精密度

分別取空白葡萄酒和空白啤酒進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn),加標(biāo)水平為0.1、1.0和100 μg/L,每個水平制備6份平行樣品,并連續(xù)進(jìn)樣5天。以空白酒類樣品加標(biāo)的回收率表示方法的準(zhǔn)確度;以同一天6份平行樣品測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差作為日內(nèi)精密度(RSDr),而連續(xù)5天樣品測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差作為日間精密度(RSDR)。按照1.3節(jié)方法處理,結(jié)果見表3。多菌靈和噻菌靈在葡萄酒樣品中的回收率分別為95.6%～109.4%和87.5%～94.9%,日內(nèi)精密度分別為1.8%～5.2%和2.3%～4.8%,日間精密度分別為4.3%～8.6%和5.9%～9.3%;在啤酒樣品中的回收率分別為98.5%～110.2%和90.7%～102.8%,日內(nèi)精密度分別為2.7%～4.2%和1.3%～3.7%,日間精密度分別為5.7%～8.7%和4.8%～9.4%。表明本方法的準(zhǔn)確度和精密度良好。

表 3 不同添加水平下的回收率和精密度Table 3 Recoveries and precisions at different spiked levels

RSDr: intra-day precision; RSDR: inter-day precision.

表 4 葡萄酒和啤酒中多菌靈和噻菌靈的測定結(jié)果Table 4 Results of the determination of carbendazim and thiabendazole in wine and beer

Wine samples: W1-W51, beer samples: B1-B33; ND: results <0.02 μg/L for carbendazim, and <0.01 μg/L for thiabendazole.

圖 3 tSIM模式下陽性樣品中多菌靈的提取離子色譜圖Fig. 3 Exactive ion chromatograms of carbendazim in tSIM mode for positive samplesa. wine (sample No. W8, 47.17 μg/L); b. beer (sample No. B8, 0.15 μg/L).

2.5 實(shí)際樣品的測定

采用已建立的方法對市售的51份葡萄酒樣品(W1～W51)和33份啤酒樣品(B1～B33)進(jìn)行了檢測,結(jié)果見表4。其中,葡萄酒中均檢出多菌靈,檢出含量為0.09～633.81 μg/L,平均值為56.20 μg/L,中位數(shù)為26.24 μg/L,含量大于100 μg/L的占有比為13.7%;葡萄酒中噻菌靈的檢出率為9.8%,含量范圍為ND～0.74 μg/L。啤酒中多菌靈檢出含量較低(低于1 μg/L),范圍為ND～0.63 μg/L,而噻菌靈則未檢出。陽性葡萄酒和啤酒樣品中檢出多菌靈的色譜圖見圖3。上述結(jié)果表明,本方法靈敏度高,樣品處理快捷簡便,凈化效果好,適用于葡萄酒和啤酒中多菌靈和噻菌靈殘留的快速分析測定。

3 結(jié)論

本研究基于PCX填料的分散微固相萃取技術(shù)與同位素稀釋的高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),建立了同時測定葡萄酒和啤酒中多菌靈和噻菌靈殘留量的方法。該方法樣品前處理時間短,每個樣品僅耗時3 min,操作簡單、成本低、有機(jī)溶劑消耗少,同時凈化效果良好,靈敏度高,準(zhǔn)確度及精密度均能滿足酒類中農(nóng)藥殘留檢測的要求,為我國酒類食品的常規(guī)監(jiān)測和監(jiān)管提供了可靠的技術(shù)手段。

[1] Yu G C, Wang X F. Occupation and Health, 2008, 24(17): 1834

于功昌, 王筱芬. 職業(yè)與健康, 2008, 24(17): 1834

[2] Codex Alimentarius Commission. Pesticide Residues in Food and Feed. [2017-08-21]. http://www.fao.org/fao-who-codexalimentarius/codex-texts/dbs/pestres/pesticides/en/

[3] Commission Regulation (EC) 396/2005

[4] Song W C, Shan W L, Ye J M, et al. Chinese Journal of Pesticide Science, 2009, 11(4): 414

宋穩(wěn)成, 單煒力, 葉紀(jì)明, 等. 農(nóng)藥學(xué)學(xué)報, 2009, 11(4): 414

[5] GB 2763-2016

[6] Lu D, Qiu X, Feng C. J Chromatogr B, 2012, 895/896(1): 17

[7] Al-Ebaisat H. Arabian J Chem, 2011, 4(1): 115

[8] Wang L, Zhang M, Zhang D. Food Control, 2016, 60(1): 1

[9] Zamora T, Pozo O J, López F J, et al. J Chromatogr A, 2004, 1045(1/2): 137

[10] Li C L, Le Y, Yin G H, et al. Chinese Journal of Pesticide Science, 2015, 17(5): 579

李春麗, 樂淵, 尹桂豪, 等. 農(nóng)藥學(xué)學(xué)報, 2015, 17(5): 579

[11] Hanot V, Goscinny S, Deridder M. J Chromatogr A, 2015, 1384(1): 53

[12] Trevisan M T S, Owen R W, Calatayud-Vernich P, et al. J Chromatogr A, 2017, 1512(1): 98

[13] Kim K, Park D, Kang G, et al. Food Chem, 2016, 208(1): 239

[14] Zheng X P, Ding L P, Chen Z T, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2015, 33(6): 652

鄭香平, 丁立平, 陳志濤, 等. 色譜, 2015, 33(6): 652

[15] Liu X S, Zheng L, Huang W W, et al. Journal of Instrumental Analysis, 2013, 52(1): 84

劉曉松, 鄭玲, 黃文雯, 等. 分析測試學(xué)報, 2013, 52(1): 84

[16] Hu Y X, Yang X M, Wang Z, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2005, 23(6): 581

胡彥學(xué), 楊秀敏, 王志, 等. 色譜, 2005, 23(6): 581

[17] Chen D W, Yin Y Q, Miao H, et al. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2015, 43(4): 570

陳達(dá)煒, 殷軼群, 苗虹, 等. 分析化學(xué), 2015, 43(4): 570

[18] Jimenez-Soto J M, Cardenas S, Valcarcel M. Anal Chim Acta, 2012, 714(1): 76

[19] Mahpishanian S, Sereshti H. Talanta, 2014(1), 130: 71

[20] Yu X, Yang H S. Food Chem, 2017, 217(1): 303

[21] Fontanals N, Miralles N, Abdullah N, et al. J Chromatogr A, 2014, 1343(1): 55