α－SMA在肝包蟲囊腫周圍組織中的表達(dá)＊

劉桂生，彭心宇，吳向未，趙 瑾，張永國，張示杰，孫 紅，張宏偉

2.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理教研室 ，石河子 832008

肝包蟲病是畜牧地區(qū)常見的人獸共患性疾病，前期研究發(fā)現(xiàn)肝包蟲囊腫周圍纖維囊壁分為兩層，外囊層和外膜層，且二者的形成機(jī)制不同［1］，外膜是由于肝細(xì)胞變性、萎縮、壞死及寄生蟲體刺激等原因，啟動(dòng)肝纖維化機(jī)制，被擠壓肝內(nèi)的Glisson系統(tǒng)和肝靜脈系統(tǒng)及其所屬纖維結(jié)構(gòu)不斷纖維化，最終形成包繞在外囊周圍，外囊是棘球蚴定位于宿主臟器后由于宿主的免疫功能形成的肉芽腫，在外膜中TGF－β1的表達(dá)高于外囊［2］，TGF－β1是一種具有多種生理功能的多肽，其作用因靶細(xì)胞和作用濃度不同而不同。TGF－β1是提高肝纖維化最有效的細(xì)胞因子，能夠抑制肝細(xì)胞的增殖，激發(fā)HSC的活化，同時(shí)也能誘導(dǎo)肉芽組織中肌成纖維細(xì)胞表達(dá)高水平的A－SMA m RNA［3］。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化的方法檢測(cè)α－平滑肌肌動(dòng)蛋白在50例肝包蟲囊腫中的表達(dá)，來探討其肝包蟲囊腫的病理生長(zhǎng)過程的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源及取材 收集2010年3月－2011年6月間石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院肝包蟲新鮮手術(shù)標(biāo)本50例，男27例，女23例。年齡10～78歲。大部分病例無特殊臨床表現(xiàn)，并經(jīng)手術(shù)證實(shí)。所有標(biāo)本取材均包括肝包蟲外囊、外膜及其鄰近肝實(shí)質(zhì)組織。

1.2 免疫組織化學(xué)染色 采用免疫組織化學(xué)En－Vision二步法。En Vision試劑盒、一抗為鼠抗人α－SMA（中杉金橋）。每批染色以磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作陰性空白對(duì)照，同時(shí)用已知陽性表達(dá)的子宮肌瘤組織切片作陽性對(duì)照。具體方法按說明書進(jìn)行。結(jié)果判斷：根據(jù)顯色深淺劃分為4級(jí)，呈棕褐色或棕黃色反應(yīng)分別為強(qiáng)陽性（＋＋＋）或陽性（＋＋），淺黃色反應(yīng)為弱陽性（＋），無著色為陰性（－）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 對(duì)結(jié)果計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

2.1.1 陽性對(duì)照中α－SMA呈棕黃色片狀分布（圖1）；陰性對(duì)照中無著色（圖2）。

圖1 陽性對(duì)照（SP，×100）Fig.1 Positive control（SP，×100）

圖2 陰性對(duì)照（SP，×100）Fig.2 Negative control（SP，×100）

2.1.2 肝包蟲囊腫周圍α－SMA在外膜層表達(dá)呈棕黃色片狀分布，定位于肌成纖維細(xì)胞。在外囊偶有表達(dá)，且多為淺黃色散在分布（圖4），定位于肌成纖維細(xì)胞。周圍肝組織中成棕黃色片狀分布，主要集中在Glisson系統(tǒng)，定位于肌成纖維細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞（圖3）。其在外囊表達(dá)陽性率低于外膜層，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝30.136，P＜0.01）（表1）。

圖3 免疫組織化學(xué)檢測(cè)α－平滑肌肌動(dòng)蛋白在肝包蟲囊腫周圍組織中的表達(dá)（SP，×40）Fig.3 Expression ofα－SMA in the surrounding tissues of hydatid cysts（SP，×40）

圖4 免疫組織化學(xué)檢測(cè)α－平滑肌肌動(dòng)蛋白在肝包蟲囊腫周圍纖維囊壁中的表達(dá)DAB染色，肝包蟲囊腫周圍纖維囊壁分兩層（IL：外囊；EL：外膜）。EL呈棕褐色反應(yīng)為強(qiáng)陽性（?），IL無著色為陰性（－）（SP，×100）Fig.4 Expression ofα－SMA in the pericystic layers of hydatid cystsDAB staining，delaminated expression was observed in the pericystic layer（inner－layer，IL；external－layer，EL）（SP，×100）

3 討 論

成纖維細(xì)胞（fibroblast，F(xiàn)B）是創(chuàng)傷愈合中的主要修復(fù)細(xì)胞，不僅具有旺盛的合成功能，還能合成一種類似平滑肌細(xì)胞具有收縮功能的細(xì)胞亞型－肌成纖維細(xì)胞（myofibroblast；MFB），MFB表達(dá)有平滑肌細(xì)胞特有的α－平滑肌肌動(dòng)蛋白（α－smooth muscle actin，α－SMA），其特性還包括雙極型的細(xì)胞形態(tài)，大量應(yīng)力纖維及轉(zhuǎn)膜連接的形成［4］。遷移中的FB轉(zhuǎn)化為MFB，MFB既能合成膠原纖維，又具有收縮功能［5］。肌成纖維細(xì)胞最早由 Gabbiani（1971）報(bào)道，其形態(tài)特點(diǎn)介于FB和平滑肌細(xì)胞之間，光鏡下為梭形或長(zhǎng)扁形細(xì)胞，不易與結(jié)締組織中其他細(xì)胞區(qū)分；電鏡觀察可見胞質(zhì)內(nèi)微絲束、核切跡、密體及細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基質(zhì)的連接，而這些不同于FB的超微結(jié)構(gòu)是 MFB具有收縮功能的基礎(chǔ)［6］，MFB表達(dá)出α－SMA，肌成纖維細(xì)胞經(jīng)由α－SMA構(gòu)成的壓力纖維傳遞張力給細(xì)胞外基質(zhì)，從而引起組織收縮［7］，大量實(shí)驗(yàn)也證實(shí)組織的收縮與α－SMA的表達(dá)呈正相關(guān)［8－9］。α－SMA 作為細(xì)胞骨架蛋白，是成纖維細(xì)胞收縮表型的典型標(biāo)志［10］，它通過跨膜復(fù)合物Fibronexus與成纖維細(xì)胞外纖維粘連蛋白相連，在外界信號(hào)的刺激下產(chǎn)生強(qiáng)烈而持久的收縮，而成纖維細(xì)胞外纖維粘連蛋白可與細(xì)胞外基質(zhì)或其它成纖維細(xì)胞相連，從而能把成纖維細(xì)胞的收縮傳導(dǎo)至整塊組織［11］。

表1 α－平滑肌肌動(dòng)蛋白在肝包蟲囊腫周圍纖維囊壁中的表達(dá)Tab.1 Comparison of the expression of A－SMA in the pericystic layers of hydatid cysts

正常情況下，肌成纖維細(xì)胞存在于一些需要收縮的器官組織中，在某些病理狀態(tài)下，肌成纖維細(xì)胞也會(huì)出現(xiàn)［12］，尤其是在損傷修復(fù)過程中，肌成纖維細(xì)胞是傷口收縮的主要力量［13］。在某些特殊的病理狀態(tài)下，肌成纖維細(xì)胞并不消退，持續(xù)表達(dá)肌動(dòng)蛋白及分泌膠原等細(xì)胞外基質(zhì)，并產(chǎn)生收縮，從而導(dǎo)致一系列病理生理過程的發(fā)生。

肝星狀細(xì)胞是肝纖維化發(fā)生細(xì)胞機(jī)制的重要環(huán)節(jié)。肝星狀細(xì)胞是肝臟間質(zhì)細(xì)胞之一，正常肝臟的肝星狀細(xì)胞為靜止型細(xì)胞，儲(chǔ)存大量的維生素A，產(chǎn)生少量的Ⅰ型及Ⅳ型膠原［14－15］。當(dāng)肝臟發(fā)生損傷時(shí)，由枯否細(xì)胞、肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和血小板產(chǎn)生的激活始動(dòng)因子激活肝星狀細(xì)胞［16－18］。這個(gè)活化過程包括表型向肌成纖維樣的改變，增殖速度增加，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)肥大，細(xì)胞外基質(zhì)沉積增加，維生素A減少或消失，其中以α－平滑肌肌動(dòng)蛋白顯著增殖，合成大量細(xì)胞外基質(zhì)為特征［19］。

前期研究認(rèn)為由于肝細(xì)胞變性、萎縮、壞死及寄生蟲體刺激等原因，啟動(dòng)肝纖維化機(jī)制，而肝發(fā)生纖維化時(shí)，由于慢性損傷的長(zhǎng)期刺激，肝星狀細(xì)胞（hepatic stel－late cell，HSC）被激活，轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，表達(dá)α－SMA［13］。實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)在不同時(shí)期的肝包蟲囊腫周圍組織中α－SMA都有不同程度的表達(dá)，肝包蟲囊腫周圍α－SMA在外膜層表達(dá)呈棕黃色片狀分布，在外囊偶有表達(dá)，且多為淺黃色散在分布，其在外囊表達(dá)陽性率低于外膜層，而且兩者有顯著差異，這說明外膜與外囊形成機(jī)制不同。由于肝細(xì)胞變性、萎縮、壞死及寄生蟲體刺激等原因，啟動(dòng)肝纖維化機(jī)制，被擠壓肝內(nèi)的Glisson系統(tǒng)和肝靜脈系統(tǒng)及其所屬纖維結(jié)構(gòu)不斷纖維化，最終形成外膜包繞在外囊周圍。外囊是棘球蚴定位于宿主臟器后由于宿主的免疫反應(yīng)形成的肉芽腫，這與前期研究提出的外膜與外囊的形成機(jī)制相符。

研究表明在正常肝臟中α－SMA只分布于血管壁［20］。α－SMA在肝包蟲囊腫周圍肝組織中呈棕黃色片狀分布，主要集中在Glisson系統(tǒng)，這可能與肝纖維化進(jìn)程相關(guān)，而外膜的形成與肝纖維化機(jī)制相關(guān)，因此α－SMA在肝包蟲囊腫生長(zhǎng)過程中起著重要作用。可能與我們臨床上觀察到的許多現(xiàn)象相關(guān)。

上述研究尚屬初步，對(duì)于肝包蟲病囊腫自然病程中動(dòng)態(tài)生長(zhǎng)的觀察及其與α－SMA的關(guān)系，人體其他臟器的局部反應(yīng)等還有待于進(jìn)一步的研究。

［1］Wu XW，Chen XL，Peng XY，et al.The specific expression of collagen I，III and IV in the pericystic layer of hepatic hydatid cyst［J］.Chin J Zoonoses，2004，20（10）：876－879.（in Chinese）

吳向未，陳雪玲，彭心宇，等.Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原在肝包蟲囊腫周圍人體纖維囊壁中的特異性分層表達(dá)［J］.中國人獸共患病雜志，2004，20（10）：876－879.

［2］Peng XY，Wu XW，Zhang SJ，et al.Recognition on pathological structure of fibrotic cyst wall around hydatid cyst of liver［J］.World Chin J Digestol，2005，13（3）：276－279.（in Chinese）

彭心宇，吳向未，張示杰，等.肝包蟲囊腫周圍纖維囊壁病理結(jié)構(gòu)的再認(rèn)識(shí)［J］.世界華人消化雜志，2005，13（3）：276－279.

［3］Desmoulière A，Geinoz A，Gabbiani F，et al.Transforming growth factor－beta 1 induces alpha－smooth muscle actin expression in granulation tissue myofibroblasts and in quiescent and growing cultured fibroblasts［J］.J Cell Biol，1993，122（1）：103－111.

［4］Liu YK，Lu SL.The influence of mechanical stimulation on the outcome of muscle fibroblasts［J］.Chin J Traumatol，2002，18，（11）：703－704.（in Chinese）

劉英開，陸樹良.力學(xué)刺激對(duì)肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)歸的影響［J］.中華創(chuàng)傷雜志，2002，18（11）：703－704.

［5］Liu Y，Cen Y，Tang Y，et al.The role of myofibroblast in the development of pathological scar［J］.Chin J Reparat Reconstruct Surg，2005，19（1）：39－41.（in Chinese）

劉勇，岑瑛，唐穎等.肌成纖維細(xì)胞在病理性瘢痕形成中的機(jī)制［J］.中國修復(fù)重建外科雜志，2005，19（1）：39－41.

［6］Eyden B.Electron microscopy in the study of myofibroblastic lesions［J］.Semin Diagn Pathol，2003，20（1）：13－24.

［7］Hinz B，Gabbiani G.Cell－matrix and cell－cell contacts of myofibroblasts：role in connective tissue remodeling［J］.Thromb Haemost，2003，90（6）：993－1002.

［8］Zaleskas JM，Kinner B，F(xiàn)reyman TM，et al.Growth factor regulation of smooth muscle actin expression and contraction of human articular chondrocytes and meniscal cells in a collagen－GAG matrix［J］.Exp Cell Res，2001，270（1）：21－31.

［9］Tian YF，Tang SM，Luo SJ，et al.A study on the expressions

and the correlation of TGF－βandα－SMA in scar［J］.Chin J Plasts Surg，2000，16（2）：75－77.（in Chinese）

田宜肥，湯少明，羅少軍，等.TGF－β和α－SMA在瘢痕組織中的表達(dá)及相關(guān)性研究［J］.中華整形外科雜志，2000，16（2）：75－77.

［10］Muchaneta－Kubara EC，el Nahas AM.Myofibroblast phenotypes expression in experimental renal scarring［J］.Nephrol Dial Transplant，1997，12（5）：904－915.

［11］Huang H，Tang SJ，Bao WH，et al.Expression ofα－smooth muscle attin in scar fibroblastsinvitro［J］.Chin J Reparat Reconstruct Surg，2001，15（6）：347－350.（in Chinese）

黃輝，唐勝建，鮑衛(wèi)漢.α－平滑肌肌動(dòng)蛋白在瘢痕成纖維細(xì)胞中的表達(dá)［J］.中國修復(fù)重建外科雜志，2001，15（6）：347－350.

［12］Schurch W，Seemayer TA，Gabbiani G.Myofibroblast，//Stemberg SS，Histology for pathologists［M］.New York：Ra－ven Press，1992，109－144.

［13］Darby I，Skalli O，Gabbiani G.Alpha－smooth muscle actin is transiently expressed by myofibroblasts during experimental wound healing［J］.Lab Invest，1990，63（1）：21－29.

［14］Ramadori G，Armbrust T.Cytokines in the liver［J］.Eur J Gastroenterol Hepatol，2001，13（7）：777－784.

［15］Masunaga H，F(xiàn)ujise N，Shiota A，et al.Preventive effects of the deleted form of hepatocyte growth factor against various liver injuries［J］.Eur J Pharmacol，1998，342（2/3）：267－279.

［16］Lee KS，Lee SJ，Park HJ，et al.Oxidative stress effect on the activation of hepatic stellate cells［J］.Yonsei Med J，2001，42（1）：1－8.

［17］Kim WH，Matsumoto K，Bessho K，et al.Growth inhibition and apoptosis in liver myofibroblasts promoted by hepatocyte growth factor leads to resolution from liver cirrhosis［J］.Am J Pathol，2005，166（4）：1017－1028.

［18］Cramer T，Schuppan D，Bauer M，et al.Hepatoctye growth factor and c－Met expression in rat and human liver fibrosis［J］.Liver Int，2004，24（4）：335－344.

［19］Guo YH，Yu XF，Yu HQ，et al.The effect of perioperative entreal immunonutrition on live regeneration function in cirrhotic rats with partial hepatectomy［J］.Chin J Gener Surg，2007，16（3）：258－260.（in Chinese）

郭躍華，于小舫，于會(huì)群.圍手術(shù)期腸內(nèi)免疫營養(yǎng)對(duì)肝硬化肝切除大鼠肝再生的影響［J］.中國普通外科雜志，2007，16（3）：258－260.

［20］Wu XR，Lv MH，Wang Q，et al.The plasma levels of transforming growth factorβ1 and the protein expressions of a－SMA，urokinase plasminogen activator and plasmlnogen activator inhibitor－1 in liver of patients with different grades of hepaticfibrosis［J］.Chin J Hepatol，2004，12（7）：400－402.（in Chinese）

武希潤(rùn)，呂敏和，王琦等.α－平滑肌肌動(dòng)蛋白表達(dá)及血漿轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1變化在肝纖維化發(fā)生發(fā)展中的作用［J］.中華肝臟病雜志，2004，12（7）：400－402.