金黃色葡萄球菌鑒別方法探討

宋嵩文

廣西壯族自治區(qū)玉林食品藥品檢驗(yàn)所，廣西玉林 537000

金黃色葡萄球菌（SA）廣泛存在自然界，是一種引起食物中毒的常見致病菌之一，目前很多國家都把金黃色葡萄球菌列為藥品和食品衛(wèi)生的法定檢測項目[1]。對金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)?zāi)壳安捎玫姆椒ㄊ且浴吨袊幍洹?010年版及食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB4789.10-2010[2-3]。然而，SA在特殊環(huán)境中，可產(chǎn)生變異性，使細(xì)菌形態(tài)及典型的生化反應(yīng)有所改變，在檢驗(yàn)中常有假陽性發(fā)生，影響判斷結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)在常規(guī)方法的基礎(chǔ)上增加API鑒定系統(tǒng)確認(rèn)，能顯著提高金黃色葡萄球菌檢出率。因食品和藥品對金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)方法類同，且食品相對于藥品而言污染機(jī)率較大，雜菌較多，故實(shí)驗(yàn)以9批試驗(yàn)結(jié)果革蘭染色鏡檢均為陽性的食品樣品更具代表性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 對照用菌株 金黃色葡萄球菌 [CMCC（B）26 003]；樣品菌株：兩批生食魚片（批號：SP20110189、SP20110212）、三批熟肉制品（批號：SP20110151、SP20110182、SP20110745）、兩批豆制品（SP20110740、SP20110847）和兩批盒飯（批號：SP20110108、SP20110073）共9個批次，革蘭染色鏡檢試驗(yàn)均顯陽性，計劃監(jiān)管中抽取于市場。

1.1.2 培養(yǎng)基和試劑 7.5%氯化鈉肉湯；Baird-Parker培養(yǎng)基（B-P）；血瓊脂平板；腦心浸出液（BHI）肉湯；營養(yǎng)瓊脂斜面；凍干血漿；革蘭染色試劑，廣州環(huán)凱生物技術(shù)有限公司。API Staph 鑒定試條，法國生物梅里埃公司。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 恒溫培養(yǎng)箱，渦旋振蕩器，顯微鏡，ATB-new微生物鑒定系統(tǒng)（法國生物梅里埃公司）。

1.2 方法

1.2.1 分離培養(yǎng) 按 GB/T4789.10-2010方法，無菌稱取25 g樣品加入225 mL滅菌的7.5%氯化鈉肉湯中，均質(zhì)后，（36±1）℃培養(yǎng)24 h，用取上述培養(yǎng)物，分別接種于Baird-Parker瓊脂平板和血瓊脂平板上，（36±1）℃培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)結(jié)束后觀察菌落生長特征。挑取1～2個可疑菌落，分別接種致營養(yǎng)瓊脂斜面和BHI肉湯培養(yǎng)基中，置（36±1）℃培養(yǎng)24 h，同時進(jìn)行革蘭染色鏡檢。

1.2.2 血漿凝固酶試驗(yàn) 取凍干血漿1支，加入革蘭染色鏡檢試驗(yàn)均顯陽性的培養(yǎng)24 h的BHI肉湯培養(yǎng)物0.5 mL，振蕩搖勻，放置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每半小時觀察1次，至少觀察6 h。觀察是否有凝塊形成，以內(nèi)容物完全凝固，使試管倒置或傾斜時不流動者為陽性。同時用金黃色葡萄球菌及肉湯做對照試驗(yàn)。

1.2.3 API Staph 鑒定試條試驗(yàn) 取API Staph 鑒定試條，從營養(yǎng)瓊脂斜面分離菌落，調(diào)節(jié)成相當(dāng)于0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)濁度的均勻菌懸液，注入已有底物的各試管。并在裝有精氨酸雙水解酶（ADH）和尿酶（URE）管的杯內(nèi)注入礦物油，用以隔絕空氣保持厭氧環(huán)境。蓋上培養(yǎng)盒，在（36±1）℃培養(yǎng)24 h后經(jīng)ATB-new微生物鑒定系統(tǒng)鑒定。

2 結(jié)果

根據(jù)分離菌株的培養(yǎng)特性和革蘭染色形態(tài)學(xué)觀察、鏡檢、純培養(yǎng)特性的觀察、血漿凝固酶試驗(yàn)以及最終的API Staph鑒定條試驗(yàn)，確定樣品中金黃色葡萄球菌陽性。見表1。

表1 9個批次樣品試驗(yàn)結(jié)果

2.1 典型的金黃色葡萄球菌在Baird-Parker平板上培養(yǎng)特性

菌落直徑為2～3 mm，顏色呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周圍有一條混濁帶，在其外層有一透明圈，用接種針觸動時，菌落有似奶油至樹膠樣硬度。

2.2 典型的金黃色葡萄球菌在血瓊脂平板上培養(yǎng)特性

菌落較大，呈圓形，光滑突起、濕潤，金黃色、光滑濕潤、菌落周圍可見完全透明的溶血圈。

2.3 典型的金黃色葡萄球菌革蘭氏染色形態(tài)特征

革蘭陽性球菌，圓形，呈單個短鏈和葡萄簇狀或串狀排列，無鞭毛、無芽孢、無莢膜。

2.4 典型的金黃色葡萄球菌純培養(yǎng)生長特征

典型的金黃色葡萄球菌在腦心浸出液（BHI）肉湯中純培養(yǎng)后呈混濁生長。

2.5 血漿凝固酶試驗(yàn)

典型的金黃色葡萄球菌能使血漿呈膠胨狀凝固，將試管傾斜或倒置時，不能倒出，而陰性菌株和肉湯培養(yǎng)基均無凝固現(xiàn)象，以此來判定分離菌株血漿凝固酶試驗(yàn)為陽性。

3 討論

金黃色葡萄球菌在適宜的條件下會產(chǎn)生一系列特征性的接觸酶，其中包括纖維朊溶酶、玻璃酸溶酶、凝固酶和核酸酶。通過檢測細(xì)菌是否分泌這些酶，可作為判斷該菌株屬種的重要指標(biāo)之一[4]。傳統(tǒng)的金黃色葡萄球菌鑒定是通過對樣品增菌處理后，進(jìn)行平板劃線，然后，挑取可疑菌落進(jìn)行形態(tài)、染色及血漿凝固酶試驗(yàn)后，進(jìn)行判定。就血漿凝固酶試驗(yàn)而言，凝固酶基因曾被認(rèn)為是鑒定金葡菌的特異性基因，但后來發(fā)現(xiàn)有少數(shù)金葡菌并不產(chǎn)生凝固酶[5]。據(jù)高屹[6]報道，血漿凝固酶試驗(yàn)呈陽性反應(yīng)的有金黃色葡萄球菌、里昂葡萄球菌、施萊福葡萄球菌凝固亞種、部分中間型葡萄球菌、海豚葡萄球菌及部分豬葡萄球菌等。凝固酶試驗(yàn)的血漿標(biāo)準(zhǔn)是必須含有足夠濃度的凝固酶、反應(yīng)因子和纖維蛋白原，必須無溶纖維蛋白活性和無抑制劑[7]，條件相對苛刻，并且多種因素對血漿凝固酶試驗(yàn)結(jié)果有一定的影響，如：培養(yǎng)物培養(yǎng)時間、血漿凝固酶的反應(yīng)時間、所加培養(yǎng)物量的不同等，都會對血漿凝固酶的反應(yīng)結(jié)果產(chǎn)生誤差，當(dāng)血漿凝固酶試驗(yàn)出現(xiàn)未完全凝集時，也不容易準(zhǔn)確判定，容易造成漏檢。據(jù)報導(dǎo)，使用API Staph 鑒定試條鑒定金黃色葡萄球菌，可使鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性提高為93.6%[7]。表1實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過增加對分離的可疑金黃色葡萄球菌進(jìn)行API Staph 鑒定試條試驗(yàn)，檢測結(jié)果不但與國標(biāo)法的顯示陽性的檢測結(jié)果是相一致的，還可對似陽非陽的結(jié)果進(jìn)行判定，甚至對假陰性進(jìn)行修正，防止漏檢，明顯提高了金葡菌的檢出水平和準(zhǔn)確性，對日常的檢驗(yàn)工作具有很現(xiàn)實(shí)的指導(dǎo)意義，值得推廣。

[1]陳彬，黃曉蓉，湯敏英，等.基因探針法快速檢測食品中金黃色葡萄球菌的研究 [J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2007，34（6）：1017-1021.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（2010年版）[S].北京：中華醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄112-113.

[3]食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)，食品微生物學(xué)檢驗(yàn)GB 4789.10-2010[S].中華人民共和國衛(wèi)生部，2010.

[4]吳美云，敖日格樂，王純潔，等.牛糞中致病性金黃色葡萄球菌的分離鑒定及藥物試驗(yàn)[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009（3）：250-251.

[5]姜延龍，張宇，田波，等.PCR技術(shù)檢測金黃色葡萄球菌進(jìn)展[J].食品科學(xué)，2006，27（5）：265-269.

[6]高屹.細(xì)菌血漿凝固醉試驗(yàn)有幾種?如何使用？[J]中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，1999，22：35.

[7]方曉霞，陳維媚，王文天，等.Slidex Staph-kit和血漿凝固酶試驗(yàn)在金葡菌鑒定中的應(yīng)用[J].中國微生態(tài)學(xué)雜志，2007，19（4）：393.