環(huán)扎大鼠脊髓損傷早期不同時(shí)機(jī)減壓后光密度測量熱休克蛋白70的表達(dá)及其與神經(jīng)細(xì)胞凋亡的相關(guān)性研究

顧文浩 胡嵐祥 徐祝軍 王緒成 汪紅林 謝家兵

脊髓損傷(SCI)的發(fā)病率隨著現(xiàn)代交通業(yè)的發(fā)展而升高，手術(shù)減壓治療急性SCI是一種切實(shí)可行的治療方法，但是在對SCI選擇傷后干預(yù)性手術(shù)治療時(shí)間點(diǎn)上，各臨床治療中心尚沒有達(dá)成共識［1］。為探討早期不同時(shí)機(jī)減壓療效，本實(shí)驗(yàn)采用環(huán)扎法建立大鼠脊髓損傷模型，對損傷的脊髓早期減壓，應(yīng)用免疫組化法觀察HSP70的表達(dá)及TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)，光密度測量脊髓細(xì)胞的 HSP70表達(dá)陽性面積，觀察HSP70表達(dá)與神經(jīng)細(xì)胞凋亡的關(guān)系，觀察早期減壓療效。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組 84只雄性、13周齡、清潔級Sprague－Dawley大鼠，體重270～320 g，平均290.5 g。由浙江省實(shí)驗(yàn)動物中心提供，許可證號:SCXK(浙)20080033。使用隨機(jī)數(shù)字表、安全隨機(jī)法，分為4組。對照組即A組:僅行椎板切除，n=12，實(shí)驗(yàn)組分為B組:8 h脊髓減壓，n=24;C組:72 h脊髓減壓，n=24;D組:環(huán)扎術(shù)后不行脊髓減壓術(shù)，n=24。分別于手術(shù)后 1 d、3 d、7 d、14 d、21 d 處死后取出脊髓標(biāo)本。

1.2 主要試劑 (1)Rabbit Anti－Hsp70;(2)即用型SABC試劑盒;(3)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司);(4)0.01PBS(PH7.2－7.4);(5)0.01枸櫞酸緩沖液(PH6.0);(6)DAB顯色試劑盒;(7)胃蛋白酶消化液(北京中杉金橋生物有限公司);(8)4%甲醛(皖醫(yī)弋磯山醫(yī)院實(shí)驗(yàn)外科)。

1.3 動物模型建立 采用環(huán)扎法建立大鼠脊髓損傷模型［2］。以5－0普通白色絲線環(huán)扎大鼠胸腰段硬脊膜囊建立大鼠急性脊髓損傷壓迫模型。1%戊巴比妥鈉，30～40 mg/kg，大鼠腹腔內(nèi)給藥麻醉，以T13棘突為中心，取后入路，咬除T13椎板。10倍顯微鏡下，用測量線環(huán)形測量硬脊膜囊周長，測出硬脊膜囊周長(C1)，經(jīng)代數(shù)運(yùn)算(C 2 =C1×)獲得將硬脊膜囊截面壓縮至原截面積70%的周長(C2)，將原測量平面將硬脊膜囊環(huán)扎至原截面積的70%。結(jié)扎后依層縫合。B組8 h脊髓減壓，取出環(huán)扎線;C組72 h脊髓減壓，取出環(huán)扎線。D組保留環(huán)扎線。術(shù)后常規(guī)護(hù)理。

1.4 標(biāo)本采集、制備與HE染色 大鼠模型分別在手術(shù)減壓后 1 d、3 d、7 d、14 d、21 d 五個(gè)時(shí)間，將對照組和脊髓損傷組的大鼠經(jīng)心臟灌注取材，灌注后脊髓已被多聚甲醛固定變硬，以環(huán)扎損傷部位為中心、取出其上下段共1.5 cm脊髓組織，浸泡于相同甲醛溶液中后固定72 h。損傷下端0.5 cm以4 μm厚度切片，脊髓取冠狀面，撈片于涂有多聚賴氨酸的載玻片上，標(biāo)簽晾干玻片分別行HE染色。

1.5 免疫組織化學(xué)染色 分別取脊髓損傷下端組織切片用Rabbit Anti－Hsp70抗體進(jìn)行SABC免疫組織化學(xué)染色，使用DAB顯色試劑盒，TUNEL法觀察神經(jīng)細(xì)胞的凋亡水平，使用DAB顯色試劑盒染色檢測，所有實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照該試劑的標(biāo)準(zhǔn)和流程進(jìn)行。使用數(shù)碼相機(jī)(NIKON－4300日本)對顯色的圖片攝像。

1.6 光密度測量 在普通光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)下觀察每組不同時(shí)間下染色特點(diǎn)。每一染色切片隨機(jī)取5個(gè)高倍視野(10×40)進(jìn)行顯微攝影(Nikon Eclipse 80i顯微成像系統(tǒng))獲取圖像，調(diào)試完成后，維持采集的各項(xiàng)設(shè)置不變，一次性采集出所有樣本的圖像，每張切片至少隨機(jī)采集5個(gè)視野。使用圖像分析軟件(Image－Pro Plus 6.0美國)對每張切片進(jìn)行光密度測定。積分光密度(IOD)可反映所測結(jié)構(gòu)的光密度與面積的綜合變化，IOD與物質(zhì)的質(zhì)量成正比，其數(shù)值反映物質(zhì)的相對含量［3，4］。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，各組數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s)表示，四組數(shù)據(jù)均呈正態(tài)分布，方差齊性檢驗(yàn)采用比較均值單因素方差同性檢驗(yàn)，組內(nèi)組間比較采用一般線性模型單變量方差檢驗(yàn)，HSP70陽性細(xì)胞數(shù)與神經(jīng)細(xì)胞凋亡細(xì)胞數(shù)相關(guān)性采用直線相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HSP70積分光密度 使用圖像分析軟件(Image－Pro Plus 6.0美國)對每張切片進(jìn)行光密度測定，在400倍每張切片至少隨機(jī)采集5個(gè)視野。A組偶見陽性面積，各時(shí)間點(diǎn)無顯著差異。陽性面積D組高于C組，C組高于B組，實(shí)驗(yàn)組術(shù)后1 d陽性面積增加，術(shù)后3 d到達(dá)高峰，術(shù)后7 d有所降，術(shù)后21 d仍然有所表達(dá)。實(shí)驗(yàn)組組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，組內(nèi)比較術(shù)后1 d、3 d、7 d差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，術(shù)后7 d、14 d、21 d比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.2 HSP70免疫組化陽性細(xì)胞數(shù)結(jié)果 光鏡下分別觀察各組各時(shí)間點(diǎn)脊髓損傷下端的組織變化，以細(xì)胞漿和(或)核棕黃色著色為陽性細(xì)胞，在400倍視野下每張切片于灰質(zhì)取5個(gè)視野，分別計(jì)數(shù)每個(gè)視野的陽性細(xì)胞數(shù)。A組偶見免疫陽性細(xì)胞，各時(shí)間點(diǎn)無顯著差異(見圖1:A)。陽性細(xì)胞數(shù)，D組高于C組，C組高于B組，實(shí)驗(yàn)組術(shù)后1 d免疫陽性細(xì)胞增加，術(shù)后3 d到達(dá)高峰，術(shù)后7 d有所降，術(shù)后21 d仍然有所表達(dá)。實(shí)驗(yàn)組圖片見圖1:B、C、D、E、F。實(shí)驗(yàn)組組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，組內(nèi)術(shù)后1 d、3 d、7 d比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，術(shù)后7 d、14 d、21 d比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。HSP70免疫陽性細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計(jì)估算邊際均值見圖2。

2.3 Tunel凋亡細(xì)胞 凋亡細(xì)胞呈棕褐色和棕黃色，胞核固縮顆粒深染，形態(tài)不規(guī)則，為散在和彌散性分布于損傷區(qū)域及周圍。在400倍視野下每張切片于灰質(zhì)取5個(gè)視野，分別計(jì)數(shù)每個(gè)視野的陽性細(xì)胞數(shù)。對照組少見凋亡細(xì)胞。凋亡細(xì)胞數(shù)，D組高于C組，C組高于B組，實(shí)驗(yàn)各組術(shù)后1 d出現(xiàn)大量凋亡細(xì)胞，術(shù)后3 d達(dá)到高峰，術(shù)后7 d、14 d、21 d凋亡細(xì)胞逐日減少。各組組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，組內(nèi)術(shù)后1 d、3 d、7 d比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，術(shù)后7 d、14 d、21 d比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.4 HSP70陽性細(xì)胞與Tunel細(xì)胞凋亡的相關(guān)性分析 實(shí)驗(yàn)組不同時(shí)間點(diǎn)熱休克蛋白70陽性細(xì)胞、tunel陽性細(xì)胞數(shù)比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩者線性相關(guān)系數(shù)r=0.685～0.971，對r值進(jìn)行t檢驗(yàn)的假設(shè)檢驗(yàn)，P＜0.05，認(rèn)為兩者成正相關(guān)。

3 討論

目前治療脊柱脊髓損傷的主要方法是及時(shí)徹底地減壓和恢復(fù)脊柱穩(wěn)定性，減少繼發(fā)性損傷［1］。目前認(rèn)為細(xì)胞凋亡是繼發(fā)性脊髓損傷的重要組成部分，繼發(fā)性脊髓損傷中出現(xiàn)的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞死亡都是繼發(fā)細(xì)胞凋亡的結(jié)果［5］。當(dāng)發(fā)生脊髓損傷后局部熱休克蛋白(HSPs)的表達(dá)增加，可對抗脊髓繼發(fā)性損傷神經(jīng)細(xì)胞凋亡是脊髓繼發(fā)性損傷的主要機(jī)制之一，HSPs可通過以下機(jī)制抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡:抑制內(nèi)源性(線粒體內(nèi)caspase依賴的)凋亡途徑，抑制外源性(受體介導(dǎo)的)凋亡途徑，調(diào)節(jié)Bcl－2家族成員的活性促進(jìn)核轉(zhuǎn)錄因子的活化，抑制一氧化氮(NO)的大量產(chǎn)生減少自由基的毒性作用［6］。其中HSP70屬于誘導(dǎo)型HSP70，其在正常細(xì)胞中不表達(dá)或表達(dá)量很少，但在應(yīng)激源刺激下，表達(dá)量顯著增加［7］。實(shí)驗(yàn)證實(shí)HSP70對細(xì)胞保護(hù)作用，其誘導(dǎo)的數(shù)量與保護(hù)作用的強(qiáng)弱呈正相關(guān)［8］。邵將等［9］實(shí)驗(yàn)顯示，HSP70表達(dá)隨時(shí)間的延長逐漸增強(qiáng)，損傷后24～48 h達(dá)到頂峰，在此期間組織內(nèi)所有細(xì)胞均可見HSP70的陽性表達(dá)，這種表達(dá)一直持續(xù)到損傷后72 h。與本次實(shí)驗(yàn)HSP70表達(dá)的高峰期較為接近。由于HSP70屬于誘導(dǎo)型HSP，其誘導(dǎo)的機(jī)制尚不完全清楚，所以單純手術(shù)干預(yù)不能誘導(dǎo)其表達(dá)增加。因此在今后的研究中，對損傷的脊髓早期減壓的同時(shí)，短時(shí)間誘導(dǎo)出大量HSPs，達(dá)到更好地抗脊髓繼發(fā)性損傷神經(jīng)細(xì)胞凋亡，將是未來治療脊髓損傷的新路徑。

圖1 熱休克蛋白70免疫組化圖片(400倍放大)

圖2 熱休克蛋白70的估算邊際均值

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