黃酮苷對(duì)賽洛西賓過氧化作用的拮抗效應(yīng)

黃紅焰，黃喆，李玉白

（1.湖南環(huán)境生物學(xué)院，湖南 衡陽 421005；2.中國(guó)計(jì)量學(xué)院，杭州 310018）

賽洛西賓是一類能引起神經(jīng)致幻的蘑菇毒素，這類蘑菇在世界各國(guó)都普遍分布。賽洛西賓主要作用于自主神經(jīng)，引起神經(jīng)興奮、反射亢進(jìn)和感覺異常、致幻，嚴(yán)重的出現(xiàn)心動(dòng)過速、瞳孔放大，甚至出現(xiàn)妄想綜合癥。通常將含有該毒素的蘑菇稱為“神圣的蘑菇”或“幻覺蘑菇”。

純賽洛西賓為白色結(jié)晶體，對(duì)溫度敏感，效力強(qiáng)，在凍干狀態(tài)能長(zhǎng)時(shí)間保持活性。因其對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的作用，許多不法之徒利用賽洛西賓特異的致幻效應(yīng)，制作毒品。含賽洛西賓的物品在世界各國(guó)呈蔓延趨勢(shì)。賽洛西賓的問題引起全球的極大關(guān)注。

目前的有關(guān)研究中，尚無探討賽洛西賓氧化損傷作用的報(bào)道。黃酮苷是萱草活性成份提取物，有很高的藥用價(jià)值，黃酮苷的綜合開發(fā)利用是本團(tuán)隊(duì)正在進(jìn)行的研究課題。本研究以腹腔注射染毒方式研究了賽洛西賓中毒大鼠的血液生化酶、臟器系數(shù)和氧化損傷指標(biāo)，以探討賽洛西賓的氧化損傷作用，尋找賽洛西賓的效應(yīng)生物標(biāo)志物，填補(bǔ)臨床檢驗(yàn)空白，同時(shí)觀察黃酮苷抗損傷作用的效果，為臨床診療救治賽洛西賓中毒提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

（1）賽洛西賓毒素（psilocybins）：由湖南亞華種業(yè)股份有限公司生物藥廠提供；（2）受試動(dòng)物：SD大鼠，清潔級(jí)，6～8 周齡，體質(zhì)量 80～100 g，由南華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)531；（3）實(shí)驗(yàn)試劑：氧化損傷及生化指標(biāo)測(cè)定試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所；黃酮苷由西安天行健天然生物制品有限公司生產(chǎn)。（4）實(shí)驗(yàn)儀器：美國(guó)康仁M560型自動(dòng)生化分析儀，上海第三分析器廠722型分光光度計(jì)，中外合資上海求精生化試劑儀器有限公司可調(diào)微量加樣器等。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與染毒：SD大鼠50只，體質(zhì)量180～200 g，由南華大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。動(dòng)物合格證號(hào)531。隨機(jī)分成5個(gè)組，每組10只，雌雄各半。設(shè)空白對(duì)照組（蒸餾水）；第1組：低劑量染毒組（0.5 μg/kg.bw）；第 2 組：高劑量染毒組（1.5 μg/kg.bw）；第3組：低劑量染毒+黃酮苷組；第4組：高劑量染毒+黃酮苷組。按劑量給大鼠腹腔注射染毒，每天1次，連續(xù)1周。黃酮苷按100 mg/kg用量腹腔注射，染毒后即刻注射1次，10 h后再注射1次。觀察動(dòng)物進(jìn)食、飲水、活動(dòng)、毛發(fā)、大小便和常見臨床癥狀，動(dòng)物的體質(zhì)量和食物消耗量每周測(cè)定1次。

1.2.2 檢測(cè)指標(biāo)：（1）血液生化指標(biāo)：實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，股動(dòng)脈采血：在摸到明顯搏動(dòng)處，按常規(guī)消毒，左手固定搏動(dòng)處，右手持注射器，針頭呈60°角刺入，血液自動(dòng)進(jìn)入注射器內(nèi)。用自動(dòng)生化分析儀測(cè)定天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、尿素氮（BUN）；（2）臟器系數(shù)：大體解剖，肉眼觀察各組織器官的變化。然后測(cè)量臟器系數(shù)。臟器系數(shù)測(cè)量方法是：稱量各實(shí)驗(yàn)大鼠肝、心、腎的濕重，按以下算式進(jìn)行計(jì)算。臟器系數(shù)＝［臟器濕重（g）/體質(zhì)量（g）］×100；（3）氧化損傷檢測(cè)：從每組10只動(dòng)物中分別隨機(jī)抽取5只動(dòng)物，每只動(dòng)物各取肝、心、腎組織0.1 g，放入燒杯，加入10 mL Tris-蔗糖緩沖液，勻漿后備用。血液肝、心、腎勻漿中MDA含量與SOD活性按相應(yīng)試劑盒操作程序測(cè)定。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行分析。F檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般性指標(biāo)

實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，染毒初期各組動(dòng)物進(jìn)食、飲水、活動(dòng)、毛發(fā)、大小便與呼吸情況等方面均無異常發(fā)現(xiàn)。染毒后期，高劑量組部分動(dòng)物被毛雜亂，失去光澤。出現(xiàn)萎靡、行為活動(dòng)明顯減少等現(xiàn)象。高劑量組動(dòng)物肝臟臟器系數(shù)明顯增大（P<0.05）。黃酮苷組肝臟臟器系數(shù)變化顯著（P<0.05）。賽洛西賓毒素染毒組動(dòng)物體質(zhì)量增長(zhǎng)率與空白對(duì)照比較未見明顯差別（P>0.05）。

2.2 生化指標(biāo)

與空白對(duì)照組比較，高劑量組血清ALT、AST活性明顯增加（P<0.05）；注射黃酮苷組 AST、ALT活性變化不明顯（P>0.05）。見表1。

2.3 氧化損傷指標(biāo)

與空白對(duì)照組比較，高劑量組丙二醛（MDA）含量明顯升高（P<0.05）；超氧化物歧化酶（SOD）活性明顯降低（P<0.05）；注射黃酮苷組MDA、SOD變化不明顯（P>0.05）。高劑量組動(dòng)物肝臟臟器系數(shù)明顯增大（P<0.05）。見表 2～4。

表1 賽洛西賓毒對(duì)血液指標(biāo)ALT、AST、BU N的影響（±s）Tab.1 The influence of psilocyb in on index of ALT，AST and BUN in blood（±s）

表1 賽洛西賓毒對(duì)血液指標(biāo)ALT、AST、BU N的影響（±s）Tab.1 The influence of psilocyb in on index of ALT，AST and BUN in blood（±s）

1）compared with the control group，P<0.05.

Group n ALT（U/L） AST（U/L） BUN（mmol/L）Blank control group 10 36.52±8.17 110.36±25.33 6.08±1.22 Low dose group 10 39.85±10.20 115.07±27.46 6.03±1.51 High dose group 10 48.26±12.191） 136.81±39.411） 5.86±0.77 Low dose+flavone glycosides group 10 38.94±9.17 112.57±26.19 6.21±1.63 High dose+flavone glycosides group 10 39.68±13.42 118.43±32.56 6.37±1.21

表2 賽洛西賓毒對(duì)肝臟、腎臟、心臟M D A含量的影響（±s）Tab.2 The effect of MDA conten to fliver，kidney and heart induced by Psilocybins（±s）

表2 賽洛西賓毒對(duì)肝臟、腎臟、心臟M D A含量的影響（±s）Tab.2 The effect of MDA conten to fliver，kidney and heart induced by Psilocybins（±s）

1）compared with the control group，P<0.05.

Group n Liver Kiendy Heart（nmol/mgprot） （nmol/mgprot） （nmol/mL）Blank control group 10 6.02±1.05 4.46±0.36 3.14±0.98 Low dose group 10 6.22±0.31 4.61±0.32 3.24±0.65 High dose group 10 7.37±0.161） 5.37±0.311） 5.87±0.191）Low dose+flavone glycosides group 10 5.99±0.16 4.58±0.21 3.74±1.53 High dose+flavone glycosides group 10 6.16±0.47 4.53±0.42 3.38±1.04

表3 賽洛西賓毒對(duì)肝臟、腎臟、心臟中SO D活性的影響（±s）Tab.3 The effect of SOD activity of liver，kidney and heart induced by Psilocybins（±s）

表3 賽洛西賓毒對(duì)肝臟、腎臟、心臟中SO D活性的影響（±s）Tab.3 The effect of SOD activity of liver，kidney and heart induced by Psilocybins（±s）

1）compared with the control group，P<0.05.

Group n Liver Kiendy Heart（nmol/mgprot） （nmol/mgprot） （nmol/mL）Blank control group 10 30.86±4.33 102.03±3.31 362.94±69.62 Low dose group 10 37.43±1.67 112.36±3.12 342.01±55.13 High dose group 10 29.48±3.041） 91.76±2.581） 312.34±30.431）Low dose+flavone glycosides group 10 30.68±4.43 99.84±4.07 365.12±22.14 High dose+flavone glycosides group 10 30.41±5.31 100.43±2.27 355.76±12.11

表4 賽洛西賓對(duì)動(dòng)物臟器系數(shù)的影響（±s）Tab.4 The inf luence of psilocyb in on the organ index of the animal（±s）

表4 賽洛西賓對(duì)動(dòng)物臟器系數(shù)的影響（±s）Tab.4 The inf luence of psilocyb in on the organ index of the animal（±s）

1）compared with the control group，P<0.05.

Group n liver Kiendy Heart Blank control group 10 3.10±0.79 0.78±0.16 0.38±0.10 Low dose group 10 2.98±0.54 0.75±0.17 0.35±0.05 High dose group 10 3.41±0.751） 0.76±0.51 0.37±0.09 Low dose+flavone glycosides group 10 3.06±0.56 0.72±0.14 0.36±0.03 High dose+flavone glycosides group 10 2.96±0.43 0.71±0.20 0.36±0.04

2.4 肝臟損傷的病理結(jié)果

裸蓋菇素染毒一周后，高劑量組大鼠肝臟中央靜脈及相應(yīng)肝竇擴(kuò)張、充血、肝索壞死、溶解，高劑量+黃酮苷組大鼠肝臟匯管區(qū)內(nèi)小灶性炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；低劑量組大鼠肝匯管區(qū)輕度淤血，低劑量染毒+黃酮苷組大鼠肝竇基本正常。病理解剖結(jié)果說明黃酮苷在裸蓋菇素引起的氧化損傷中有一定的抗損傷效果。見圖1～4。

3 討論

賽洛西賓中毒后所產(chǎn)生的臨床癥狀與其它神經(jīng)性毒劑中毒有許多相似之處。在臨床上不易區(qū)分，且在藥物使用很長(zhǎng)時(shí)間后，藥效常出現(xiàn)意想不到的重現(xiàn)，極易造成誤診。探討賽洛西賓的氧化損傷作用，尋找賽洛西賓的效應(yīng)生物標(biāo)志物，觀察黃酮苷抗損傷作用的效果，對(duì)臨床診療救治賽洛西賓中毒具有指導(dǎo)意義。

血清轉(zhuǎn)氨酶變化是反映肝細(xì)胞損害的重要指標(biāo)之一，丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）主要存在于肝臟細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞損害或死亡時(shí)，逸出肝細(xì)胞膜，進(jìn)入血液循環(huán)而使血清水平升高［4］。賽洛西賓毒素高劑量組血清ALT升高，高劑量組肝臟臟器系數(shù)增大。其毒理作用主要是抑制生物細(xì)胞的RNA聚合酶活性，并能減少肝糖元而導(dǎo)致肝細(xì)胞迅速壞死［5］。與病理解剖結(jié)果一致。天冬氨酸（AST）在心肌細(xì)胞中含量最多。當(dāng)心肌細(xì)胞受損時(shí)，游離型的AST釋放入血［6］。因此，血清天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性升高提示心肌受損。

近年來研究發(fā)現(xiàn)氧化損傷是許多環(huán)境化學(xué)毒物引起機(jī)體危害的機(jī)制之一［7］。超氧化物歧化酶（SOD）是生物機(jī)體抗氧化系統(tǒng)中的重要酶類，它具有歧化超氧陰離子生成H2O2和O2的能力，其化學(xué)本質(zhì)是一種蛋白質(zhì)，含有金屬輔基及其活性成分，易受外來化學(xué)毒物對(duì)機(jī)體的攻擊而受到損傷，故該酶活性降低亦可以反映外來化學(xué)毒物對(duì)機(jī)體的氧化損傷作用。MDA是直接反映體內(nèi)脂質(zhì)過氧化水平的物質(zhì)，自由基攻擊生物膜的多不飽和脂肪酸可引起脂質(zhì)過氧化形成MDA，如果產(chǎn)生自由基增多，對(duì)機(jī)體細(xì)胞攻擊的程度增加，MDA也將增多。因此，血清MDA含量增加，直接提示機(jī)體氧化受損［8］。本次實(shí)驗(yàn)表明，賽洛西賓毒素中毒后，血清ALT活性、AST活性、BUN活性、SOD活性MDA含量明顯變化，ALT是肝臟功能指標(biāo)，AST是心肌功能指標(biāo)，BUN是腎臟功能指標(biāo)，SOD和MDA是氧化損傷指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示賽洛西賓毒素可引起肝、腎、心等多臟器氧化損傷，而黃酮苷可減輕這種氧化損傷的損害程度。黃酮苷具有多種生物活性，尤其是具有較高的抗氧化活性，是一種重要的植物抗毒素，根據(jù)我們的前期研究黃酮苷的抗氧化機(jī)理可能是通過形成非活潑基團(tuán)的方式降解脂過氧化物，從而起到降低游離基的作用，其減輕賽洛西賓氧化損傷的作用機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

［1］姜效義.傳染病基礎(chǔ)與臨床［M］.北京：北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院出版社，2009，135-148.

［2］陳作紅，張志光.蘑菇毒素及其中毒治療［J］.實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2003，10（2）：260-262.

［3］彭欣莉，鄭鴻雁.萱草黃酮抗氧化和降血脂作用研究［J］.食品工業(yè)科技，2009（12）：13-25.

［4］王貴強(qiáng).肝臟酶生化檢測(cè)的臨床評(píng)價(jià)［J］.中國(guó)實(shí)用內(nèi)科雜志，2002，22（1）：53-56.

［5］Kumar O，Sugendran K，Vijayaraghavan R.Oxidative stress associated hepatic and renal toxicity induced by ricin in mice［J］.Toxicin，2003，41（3）：333-338.

［6］Huang YL，Chrn CY，Shen JY，et al.Lipid peroxidation in workers exposed to hexavalent chromium ［J］.Toxicol Environ Health A，1999，26；56（4）：235-247.

［7］黃紅焰，李玉白.萱草活性成分黃酮干對(duì)糖尿病大鼠抗動(dòng)脈粥樣硬化活性的研究，湖南環(huán)境生物職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào)［J］，2010，16（4）：26-28.

［8］楊俊林，沈恂.生物系統(tǒng)中活潑中間體與脂質(zhì)過氧化［J］.化學(xué)通報(bào)，1997，（6）：5.