玉米SSR引物和甘蔗EST－SSR引物在芒屬中的通用性研究

盧玉飛，蔣建雄，易自力

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙410128）

芒屬（Miscanthus）（禾本科Poaceae）是一類C4高大禾草。因其具有適宜作為新一代非糧食能源植物開發(fā)利用的潛力而備受關(guān)注［1－4］。按 Chen和 Renvoize［5］的分類體系，中國的芒屬植物包含芒（Miscanthus sinensis）、五節(jié)芒（M.floridulus）、荻（M.sacchariflorus）、南荻（M.lutarioriparius）、尼泊爾芒（M.nepalensis）、雙藥芒（M.nudipes）和紅山茅（M.paniculatus）等7個(gè)種。盡管我國的芒屬植物資源豐富，但對(duì)其遺傳多樣性的了解并不多。

微衛(wèi)星，或言之簡單序列重復(fù)（simple sequence repeats，SSRs）以一種由短的堿基基序構(gòu)成的長陣列形式廣泛分布于真核生物基因組內(nèi)，長1～6bp（base pairs，bp）［6，7］。根據(jù)開發(fā)SSR標(biāo)記所依據(jù)的序列的不同性質(zhì)，SSR標(biāo)記可分為基因組SSR（genomic SSR，gSSR）和表達(dá)序列標(biāo)簽SSR（expressed sequence tags SSR，ESTSSR）［8］。EST是通過對(duì)cDNA文庫中隨機(jī)挑取的克隆進(jìn)行大規(guī)模測序所獲得的cDNA的5′或3′端序列，長度一般為150～500bp［8］。EST－SSR是指EST序列中包含的SSR，因來源于編碼DNA而與基因表達(dá)有關(guān)［9］。作為功能基因的一部分，EST－SSR的側(cè)翼區(qū)往往受到功能性約束而使得其歧化速率慢，所以該側(cè)翼區(qū)序列在物種間很保守。已有研究表明，這2種SSR標(biāo)記在物種及其近緣種間，甚至在該物種與某些遠(yuǎn)緣種之間都具有比較高的通用性［7，10－12］。

由于通過文庫篩選來開發(fā)SSR引物的成本高昂，并且因?yàn)橥ㄟ^公共數(shù)據(jù)庫搜索來獲得適用序列來開發(fā)芒屬SSR引物的機(jī)會(huì)也小，因此根據(jù)SSR側(cè)翼區(qū)序列保守性的特點(diǎn)，從現(xiàn)有近緣種的SSR引物中篩選獲取可用于芒屬植物擴(kuò)增的SSR引物是一個(gè)現(xiàn)實(shí)選擇［10］。Hernández等［10］考察了76對(duì)玉米（Zea mays）SSR引物在2份芒屬雜交種中的擴(kuò)增情況，并接著使用了11份材料開展多樣性研究，結(jié)果表明玉米的微衛(wèi)星引物在芒屬中的通用性很高。鐘智林等［13］比較了30對(duì)玉米SSR引物在15份芒屬材料中的擴(kuò)增情況，結(jié)果表明玉米SSR引物適用于芒屬植物遺傳多樣性分析。Hung等［14］的研究則表明來自芒的9個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在五節(jié)芒中能實(shí)現(xiàn)種間擴(kuò)增。馬洪崢等［15］利用尼泊爾芒和雙藥芒的6份材料，篩選得到14對(duì)能產(chǎn)生穩(wěn)定擴(kuò)增的SSR引物，并進(jìn)而評(píng)價(jià)認(rèn)為所獲得的這14個(gè)SSR位點(diǎn)在雙藥芒組遺傳學(xué)研究中的適用性強(qiáng)。Zhou等［16］從芒中開發(fā)了14個(gè)SSR位點(diǎn)，其中12個(gè)在五節(jié)芒、荻、南荻中能實(shí)現(xiàn)種間擴(kuò)增。Ho等［17］的研究則表明源自M.sinensis fo.glaber的轉(zhuǎn)錄區(qū)的12個(gè)多態(tài)性微衛(wèi)星位點(diǎn)能在芒的所有變種及五節(jié)芒中實(shí)現(xiàn)類群間擴(kuò)增。

本研究以我國芒屬植物的全部7個(gè)種為材料，對(duì)382對(duì)玉米SSR引物和100對(duì)甘蔗（Saccharum officinarum）EST－SSR引物的通用性進(jìn)行研究，尋找適用于芒屬相關(guān)遺傳學(xué)研究的SSR引物，并在此基礎(chǔ)上初步探討中國芒屬種質(zhì)資源的遺傳多樣性，為開展相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

實(shí)驗(yàn)材料采自湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)芒屬種質(zhì)資源圃。80份芒屬材料以及作為外類群的4份甘蔗屬（Saccharum）材料的詳細(xì)信息見表1。類群名稱按Chen和Renvoize［5］的分類體系。

1.2 引物

382對(duì)玉米SSR引物為Sigma－Aldrich公司產(chǎn)品（St.Louis，MO USA）；100對(duì)甘蔗EST－SSR引物序列由美國Illinois大學(xué)Erik Sacks博士提供，由北京奧科生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 基因組DNA提取 每份材料從一個(gè)單株里選取生長狀況良好的新鮮健康嫩葉，總DNA提取方法參照CTAB法［18］并稍加改良。所有DNA母液于－70℃保存。

1.3.2 引物篩選 引物篩選分2個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行：前期篩選以獲得初步認(rèn)為有效的引物、應(yīng)用初步有效的引物對(duì)上述84份材料進(jìn)行擴(kuò)增。在前期引物篩選（即初篩）環(huán)節(jié)，每次擴(kuò)增電泳同時(shí)檢測若干對(duì)引物，從芒屬的每個(gè)類群及每個(gè)外類群中各抽取1～3份材料來使用。擴(kuò)增反應(yīng)體系為15μL，含2μL（約50ng）模板DNA、0.02 mmol／L 引物、2.5mmol／L Mg2＋、0.2mmol／L dNTPs、0.5UTaq DNA polymerase（廣州東盛生物技術(shù)有限公司）、1.5μL 10×PCR buffer。擴(kuò)增反應(yīng)在PCR儀 （Biometra，Germany）上完成。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性30s，56～60℃退火30s，72℃延伸1min，循環(huán)數(shù)35；72℃保持7min。根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果和已有經(jīng)驗(yàn)，完全無帶或僅有細(xì)帶或弱帶的引物都舍棄，認(rèn)為該引物無效。其中，2008年11－12月完成玉米SSR引物的前期篩選，這當(dāng)中使用的部分供試材料不在上述84份材料之列，篩選時(shí)使用的退火溫度通常為58℃，少量引物使用60℃；甘蔗EST－SSR引物的前期篩選是于2010年1－2月使用上述84份材料中的部分材料來完成的，篩選時(shí)所有引物使用的退火溫度均為56℃。用于每次擴(kuò)增的材料都同時(shí)包含了中國芒屬植物的至少大部分種類。

然后，進(jìn)一步應(yīng)用初步認(rèn)為有效的引物對(duì)上述84份材料進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)體系和程序同前期篩選所應(yīng)用的，但已根據(jù)初篩的擴(kuò)增情況來適當(dāng)調(diào)整了退火溫度。擴(kuò)增產(chǎn)物通過12%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，AgNO3染色檢測。選擇擴(kuò)增條帶清晰且有多態(tài)性的引物來使用，舍棄擴(kuò)增效果不佳或條帶過于復(fù)雜而無法準(zhǔn)確判讀的引物。每一對(duì)確定有效的引物在優(yōu)化好退火溫度后，都將保持相同條件再重復(fù)一遍擴(kuò)增和電泳以檢驗(yàn)擴(kuò)增條帶的穩(wěn)定性。根據(jù)在同一電泳遷移位置上穩(wěn)定、清晰的擴(kuò)增條帶的有／無，記為1／0矩陣。為確保讀帶的誤差盡可能小，帶型過于復(fù)雜而無法準(zhǔn)確判讀的擴(kuò)增條帶都舍棄不讀。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理 計(jì)算不同引物的多態(tài)性條帶百分率（percentage of polymorphic bands，PPB）。采用 NTSYSpc－2.10e［19］軟件計(jì)算遺傳相似度（genetic similarity，GS），并按非加權(quán)類平均法（unweighted pair group method with arithmetic averaging，UPGMA）進(jìn)行聚類。

表1 84份供試材料Table 1 84accessions of plant materials

續(xù)表1 Continued

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選

從382對(duì)玉米SSR引物和100對(duì)甘蔗EST－SSR引物中，初步篩選獲得在供試類群中至少都能產(chǎn)生較清晰主帶的引物分別有92對(duì)（24.08%）和29對(duì)（29.00%），初步認(rèn)為這些引物是有效引物。利用這些引物對(duì)上述84份材料統(tǒng)一進(jìn)行PCR擴(kuò)增，條帶較清晰且有多態(tài)性的分別為54對(duì)（14.14%）、19對(duì)（19.00%）。其中一些引物因擴(kuò)增條帶不清晰或者因?yàn)槠渲心承l帶過于復(fù)雜以致無法在所有供試材料中準(zhǔn)確判讀等因素而被放棄使用，剩余39對(duì)（10.21%）玉米SSR引物和13對(duì)（13.00%）甘蔗EST－SSR引物，條帶清晰穩(wěn)定且能準(zhǔn)確無誤判讀，而用于進(jìn)一步的遺傳分析。

用篩選獲得的這52對(duì)引物對(duì)上述84份材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果共得到250條帶，平均每對(duì)引物獲得4.81條，每對(duì)引物擴(kuò)增條帶數(shù)為2～9條。部分引物的擴(kuò)增圖譜如圖1和圖2所示。其中在芒屬中總共得到220條帶，絕大多數(shù)條帶大小在100～200bp，平均每對(duì)引物獲得4.23條；這當(dāng)中多態(tài)性條帶206條（93.64%），平均每對(duì)引物3.96條。其中，在玉米SSR引物和甘蔗EST－SSR引物中各有1對(duì)引物，即分別為p－umc1170和BQ537250a，它們?cè)诿俨牧现斜憩F(xiàn)為單態(tài)性。

圖1 玉米SSR引物p－mmc0132的擴(kuò)增圖譜Fig.1 Amplification products from the locus of p－mmc0132from maize SSR

圖2 甘蔗EST－SSR引物BQ478949a的擴(kuò)增圖譜Fig.2 Amplification products from the locus of BQ478949afrom sugarcane EST－SSR

2.2 特異性條帶

這52對(duì)引物在對(duì)上述80份芒屬供試材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增條帶中出現(xiàn)了一些可能比較有利用價(jià)值的特異性條帶（表2）。在中國芒屬植物中，它們僅為某一或某些類群所擁有，這些類群在本研究中稱為專屬類群。

2.3 玉米SSR引物與甘蔗EST－SSR引物擴(kuò)增效果對(duì)比

這2種引物的擴(kuò)增效率非常相近，但甘蔗EST－SSR引物的多態(tài)性稍強(qiáng)于玉米SSR引物的（表3）。倘若在數(shù)據(jù)分析中去掉在內(nèi)類群材料芒屬中擴(kuò)增結(jié)果無多態(tài)性的p－umc1170和BQ537250a這2對(duì)引物，甘蔗ESTSSR引物的擴(kuò)增效率和多態(tài)性均略優(yōu)于玉米SSR引物的。

2.4 聚類分析

采用NTSYSpc－2.10e軟件計(jì)算得到的遺傳相似系數(shù)（GS）為0.588～0.988。聚類結(jié)果（圖3）表明，在GS＝0.68水平上，中國芒屬植物分為兩大類群：第一類由尼泊爾芒、雙藥芒、紅山茅構(gòu)成，第二類由芒、五節(jié)芒同荻、南荻組成；在GS＝0.82上，第二類又分成了由芒與五節(jié)芒構(gòu)成的一支和由荻與南荻構(gòu)成的另一支；在GS＝0.88上，芒與五節(jié)芒分開，各自成為一個(gè)分支。這些分支以及由荻和南荻構(gòu)成的分支又各自形成了很多次級(jí)分支。

表2 39對(duì)玉米SSR引物和13對(duì)甘蔗EST－SSR引物在芒屬中的擴(kuò)增效果Table 2 Amplification effects of 39maize SSR primer pairs and 13sugarcane EST－SSR primer pairs in Miscanthus

續(xù)表2 Continued

表3 玉米SSR引物與甘蔗EST－SSR引物在芒屬中的擴(kuò)增效果對(duì)比Table 3 Comparison on amplification effects between maize SSR primer pairs and sugarcane EST－SSR primer pairs in Miscanthus

圖3 80份芒屬材料的UPGMA聚類圖Fig.3 UPGMA clustering figure for the 80accessions in Miscanthus

3 討論

3.1 SSR標(biāo)記的通用性

Hernández等［10］的研究表明，76對(duì)玉米的SSR引物里有57對(duì)（75%）引物在芒屬DNA中實(shí)現(xiàn)可重復(fù)擴(kuò)增。使用其中的17對(duì)引物擴(kuò)增芒屬的11份材料，遺傳相似度為0.35～0.92，結(jié)果表明玉米的微衛(wèi)星引物對(duì)芒屬的通用性很高。馬洪崢等［15］的研究則表明，核心芒屬的SSR位點(diǎn)在雙藥芒組中的同源擴(kuò)增比率為52.17%。

本研究中，這382對(duì)玉米SSR引物以及100對(duì)甘蔗EST－SSR引物往往都能產(chǎn)生擴(kuò)增條帶，但一些引物因擴(kuò)增條帶很細(xì)弱或者在全部84份供試材料中只產(chǎn)生一條帶而被剔除。而且為了確保條帶統(tǒng)計(jì)時(shí)的準(zhǔn)確性，條帶過于復(fù)雜而無法準(zhǔn)確判讀的那些引物也被舍棄。經(jīng)過這2次篩選，最后可用的引物不多，這導(dǎo)致了本研究中這2種引物的通用性較低。已有研究表明EST－SSR引物較普通SSR引物的通用性效果更佳［20］。而從本研究結(jié)果來看，總體上甘蔗EST－SSR引物較玉米SSR引物的通用性稍好一點(diǎn)，對(duì)揭示中國芒屬種質(zhì)資源的遺傳多樣性更為有效。這反映了基于源自轉(zhuǎn)錄區(qū)的EST開發(fā)而來的EST－SSR標(biāo)記比傳統(tǒng)SSR標(biāo)記更保守，通用性更強(qiáng)。

3.2 特異性條帶與芒屬資源評(píng)價(jià)

當(dāng)前中國芒屬植物中的4個(gè)主要類群：芒、五節(jié)芒、荻和南荻是最為引人關(guān)注的，因?yàn)樗鼈兩锪看蟆⒎植紡V，應(yīng)用潛力大，尤其是南荻植株高大且冬季枯黃，極具應(yīng)用潛力。本研究揭示的這些特異性條帶將有可能為中國芒屬種質(zhì)資源的評(píng)價(jià)、分子輔助育種提供可靠依據(jù)。比如，本研究表明在上述80份芒屬的供試材料中，引物pmmc0132擴(kuò)增條帶中的170bp這條帶是僅荻與南荻共有的條帶，引物p－umc1542擴(kuò)增條帶中的130bp這條帶是僅芒與五節(jié)芒共有的條帶，引物p－bnlg125擴(kuò)增條帶中的280bp、引物p－umc2036擴(kuò)增條帶中的150bp、引物CA069343b擴(kuò)增條帶中的370bp等這些條帶是僅芒、五節(jié)芒、荻和南荻共有的條帶。這些條帶將為這些類群的雜交種鑒定及種質(zhì)資源評(píng)價(jià)提供幫助。而對(duì)于那些中國芒屬植物7個(gè)種類都共有的帶，可以利用它們來幫助鑒定一些疑似材料是否屬于芒屬。

3.3 芒屬種質(zhì)資源的遺傳多樣性

芒屬種質(zhì)資源及其遺傳多樣性是芒屬能源作物遺傳改良和新品種育種的基礎(chǔ)。對(duì)中國芒屬植物遺傳多樣性的評(píng)價(jià)有利于了解其遺傳背景、促進(jìn)有利基因發(fā)掘、鑒定最優(yōu)親本組合。本研究結(jié)果初步表明中國芒屬植物種質(zhì)資源蘊(yùn)含比較豐富的遺傳多樣性。同時(shí)表明，芒、五節(jié)芒、荻和南荻的相似性較高，相似度為0.780～0.988，說明它們之間的遺傳距離較近，遺傳基礎(chǔ)可能相對(duì)較為狹窄。而尼泊爾芒、雙藥芒、紅山茅同這4個(gè)大家平常都比較容易關(guān)注到的種類的遺傳距離卻較遠(yuǎn)。它們主要分布于西南高山地區(qū)，具有一定程度的耐寒和抗旱特性。建議在選育適宜作為能源作物開發(fā)利用的芒屬新品種時(shí)，親本選配可以適當(dāng)考慮這三者，以拓寬遺傳基礎(chǔ)，發(fā)掘有利基因，促進(jìn)中國芒屬植物的遺傳改良和新品種培育。

致謝：感謝美國Illinois大學(xué)的Erik博士提供了甘蔗EST－SSR引物序列。

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