γ－氨基丁酸A受體及受體基因在大鼠急性腦缺血中的變化

張俊清

包頭醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院神經內一科 包頭 014010

氨基酸類遞質在腦缺血損傷中發(fā)揮了重要作用。其中抑制性氨基酸（IAAs）遞質具有突觸前及突觸后抑制功能，有對抗興奮性氨基酸的毒性的作用，具有腦保護功能。目前研究表明，γ－氨基丁酸（GABA）具有很高的生理活性，與許多神經、精神疾病有關［1］。GABA可阻斷Glu興奮性毒性，抑制細胞膜去極化和Ca2＋內流，具有神經保護作用。GABA的作用是通過與其受體結合來發(fā)揮的，介導GABA作用的受體主要有三種不同類型，即GABAA、GABAB、GABAC受體，其中以GABAA受體分布最為廣泛，GABAA受體屬促離子型受體，是由不同的亞單位構成的CL－通道。GABAA受體為突觸后膜上的受體，在腦缺血中發(fā)揮重要的保護作用，許多研究表明，GABAA受體具有抵抗缺血缺氧，有助于神經元存活和功能重建的作用。GABAA受體主要是由α、β和γ亞基組成。其中α亞基對GABAA受體復合物的組裝及功能可能起主要作用。GABAAR功能障礙與多種神經和精神疾病，如腦缺血、癲癇、焦慮、抑郁、疼痛等有關［2］。對GABAA型受體及GABAARα1 mRNA的研究，目前多集中在癲癇、抑郁癥［2－4］等方面，在腦缺血損傷中比較少。該項研究對大鼠腦缺血不同時期腦組織中GABAA受體及GABAARα1 mRNA進行檢測，來觀察γ－氨基丁酸A型受體及受體基因在腦缺血損傷中的動態(tài)變化規(guī)律及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 研究對象 健康雄性大白鼠45只，重量為300 g左右。將動物隨機分組，分別為：正常對照組，腦缺血1 h、6 h、24 h、3 d組（手術組）和假手術組，每組5只。

1.2 方法 （1）動物模型制作：采用改良的右側大腦中動脈線栓法（MCAO）。（2）免疫組化法檢測：GABAAR采用鏈酶親和素－生物素－過氧化物酶復合物法染色（SABC法）。（3）GABAARα1 mRNA的檢測采用原位雜交法。（4）觀察項目和統(tǒng)計學處理：在高倍顯微鏡視野下計數(shù)各組腦組織大腦皮質GABAAR及GABAARα1 mRNA陽性神經元數(shù)及觀察其陽性神經元表達的改變。采用形態(tài)分析系統(tǒng)進行圖像分析，每張切片隨機選取10個高倍視野，測量陽性神經元數(shù)目。采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計處理，各組數(shù)據用均數(shù)±標準差（±s）表示，所用統(tǒng)計學方法用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 組織形態(tài)學改變 神經元形態(tài)學在光鏡下觀察，正常對照組和假手術組無異常，陽性細胞胞漿著色呈棕黃色；手術組部分神經元結構出現(xiàn)了壞死前樣改變，包括細胞核濃縮、胞漿著色變淡、細胞結構不清，損傷重的組織內可見液化壞死灶，灶內神經元殘存較少或缺失。

2.2 陽性細胞數(shù)表達情況

2.2.1 GABAAR陽性細胞計數(shù)比較：與對照組相比，各時間點假手術對照組神經元陽性細胞數(shù)均無明顯改變（P＞0.05）；與假手術組相比較，缺血組神經元陽性細胞數(shù)于腦缺血后1 h即有降低，6 h降至最低，故GABAAR表達于腦缺血后1 h即有明顯降低（P＜0.05），6 h降至最低。見表1。

表1 各組GABAAR陽性細胞數(shù)的變化 （個／視野）

2.2.2 GABAARα1 mRNA陽性細胞計數(shù)比較：各時間點假手術對照組與正常對照組相比，神經元陽性細胞數(shù)的表達無明顯改變（P＞0.05），但與正常對照組及假手術對照組比，腦缺血24 h大腦皮質GABAARα1 mRNA的陽性神經元數(shù)目減少，3 d降至更低（P＜0.05），見表2。

表2 各組GABAARα1 mRNA陽性細胞數(shù)的變化 （個／視野）

3 討論

腦缺血時，由于能量合成不足及攝取障礙，導致缺血區(qū)周圍興奮性氨基酸聚集，引起一系列細胞毒性反應，最終導致神經元損傷，即興奮性毒性作用［8］，它在腦缺血的病理生理機制中起重要作用，GABA對腦缺血有顯著的神經保護作用［9］，GABAAR介導的生物效應在腦缺血損傷中發(fā)揮著重大作用。實驗在大鼠腦缺血模型的基礎上，觀察了缺血自然病程中GABAAR及其基因的變化規(guī)律。缺血后不同時間，GABAAR及受體基因弱陽性神經元為缺血損傷重的神經元。該研究提示了GABAAR及受體基因參與了腦缺血損傷的不同過程。研究表明，手術操作不影響受體及其基因的表達。GABAAR在腦缺血1 h即有所下降，6 h時更明顯著，這也說明GABAAR隨著缺血時間的延長，損傷在進一步加重。與以前的研究結果對照，即血液和腦脊液中的GABA在腦缺血損傷中呈先升高后降低的改變，我們可以推測在腦缺血時，GABAAR數(shù)量的改變可能與腦缺血損傷時細胞外液中GABA快速增加，負反饋抑制腦內GABAAR表達的原因，也可能是由于受體內移引起的。另外，有研究證實，選擇性NMDA受體激動劑或拮抗劑也可調節(jié)GABAAR功能和亞單位的表達，因而推測腦缺血時細胞外液中高濃度的谷氨酸激動NMDA受體可能也參與GABAAR結構的變化［6］?？紤]遲發(fā)性GABAAR含量的減少，與腦損傷時神經細胞的壞死有關。

Kharlamov 等［7］研 究 顯 示，缺 血 性 腦 損 傷 后，GABAARα1基因在缺血后7 d下降明顯，30 d有所恢復，說明缺血損傷后，其代償機制具有復雜的時間依從性，GABAARα1基因在梗死后下調，可能由于基因轉錄水平下降或者是基因穩(wěn)定性下降導致。我們的研究結果是：腦缺血24 h時，GABAARα1基因含量即開始下調，3d時明顯降低，推測，GABAARα1基因含量的變化與缺血后腦損傷有一定關系。與以往的研究結論相比，受體基因含量降低的時間段不同，推測可能與所采用的研究方法以及模型的制作不同相關。我們的試驗在缺血大鼠模型基礎上，運用了先進的原位雜交技術，進一步證明了腦缺血后腦組織中GABAARα1基因含量的下降，提示了缺血損傷后GABAARα1基因轉錄受阻或其穩(wěn)定性下降。

從以上研究結果來看，GABAAR及其受體基因在腦缺血過程中具有保護作用，因此，對其進行進一步研究有助于缺血性腦血管病的治療，渴望成為缺血性腦血管病治療的新突破。

［1］鄭紅發(fā)，黃亞輝，劉霞林，等.γ－氨基丁酸的藥理作用［J］.茶葉通訊，2004，4：14－17.

［2］立志，徐進宜，吳曉明，等.γ－氨基丁酸受體及相關藥物研究進展［J］.中國醫(yī)療前沿，2007，2（4）：2－8.

［3］Brambilla P，Perez J，Barale F，et al.GABAergic dysfunction in mooddisorders［J］.Mol Psychiatry，2003，8：721－737.

［4］Tunnicliff G，Malatynska E.Central GABAergic systems and depressive illness［J］.Neurochem Res，2003，28：965－976.

［5］Zul Merali，Lisheng Du，Pavel Hrdina，et al.Dysregulation in the suicide brain：mRNA expression of corticotropin－releasing hor mone receptors and GABAA receptor subunits in frontal cortical brain region［J］.Jour nal of Neuroscience，2004，24（6）：1 478－1 485.

［6］Douglas BM，Jason EK，Leslie LD，et al.Chronic blockade of N－met hyl－D－aspartate receptors altersγ－a minoburytic acidtype.A receptor peptide expression and function in the rat［J］.J Neur ochem，2000，74：1 522.

［7］Kharlamov EA，Do wney KL，Jukkola PI.Expression of GABA A receptorα1 subunit mRNA and protein in rat neocortex follo wing photothro mbotic infarction［J］.Neuroscience，2008，19：29－38.

［8］黃曉磊，王樹禮，夏作理 .谷氨酸、NMDA受體與缺血性腦損傷關系研究進展［J］.中國微循環(huán)，2006，10（1）：69－72.

［9］Gilby KL，Sydserff SG，Robertsona HA.Differential neur oprotec－tive effectsfor three GABA－potentiating compounds in a model of hypoxia－ischemia［J］.Brain Res，2005，103（5）：196－205.