中國華南、華中、東北和西北地區(qū)馬動脈炎病毒（EAV）感染馬血清流行病學(xué)調(diào)查

李紅梅 ，侯玉杰 ，，時成龍 ， ，郭 巍 ，胡 蘭 ，趙立平 ，相文華

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 哈爾濱獸醫(yī)研究所，獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室/馬病研究中心，黑龍江哈爾濱 150001；2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧沈陽 110161）

馬病毒性動脈炎（equine viral arteritis，EVA）是由馬動脈炎病毒（equine arteritis virus，EAV）引起的馬屬動物呼吸和生殖系統(tǒng)病毒性傳染病。該病在馬屬動物之間通過呼吸道或生殖器官傳播。其臨床特征是病馬發(fā)熱，步態(tài)僵直，軀干及眼周圍水腫，出現(xiàn)粘液-膿性鼻炎，外生殖道水腫，妊娠馬流產(chǎn)[1]。

目前，在EAV血清抗體檢測上，主要有間接免疫熒光（IFA）、免疫過氧化物酶單層試驗（IPMA）、中和試驗（SN）和多種酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA），其中 ELISA 是最為常用的方法[1-2，6，9]。

中國未有檢測EAV的診斷試劑，在國際貿(mào)易上主要采用國外診斷試劑盒進(jìn)行檢驗檢疫，至于在役用馬檢測或監(jiān)測上，我國未見有報道。為此，本試驗建立以純化EAV全病毒為抗原EAV-IgG間接ELISA方法，與西班牙INGEZIM-ARTERITIS試劑盒進(jìn)行比對試驗，以求建立我國的EAV的診斷方法。

1 材料與方法

1.1 樣本 383份馬血清，其中華中賽馬41份，西北役用馬106份，華南賽馬127份和東北役用馬109份。抽檢馬為臨床健康，無EAV疫苗免疫歷史的馬，其自然狀況信息見表3、表4。血清樣本制備，采用靜脈采血，37 ℃孵育1 h，4 ℃過夜，收集血清。

1.2 檢測試劑 EAV-IgG間接ELISA試驗（本試驗建立）和西班牙INGENASA公司的INGEZIM-ARTERITIS試劑盒，EAV標(biāo)準(zhǔn)陽性、陰性血清均由本實驗室保存。

1.3 主要試劑 可拆卸酶標(biāo)板，購自加拿大JET公司；Anti-horse IgG購自Sigma公司。

1.4 EAV-IgG間接ELISA試驗

1.4.1 病毒株 EAV Bucyrus株（云南熱帶和亞熱帶動物病毒病實驗室張念祖教授惠贈）。

1.4.2 抗原制備 EAV Bucyrus株接種于已長成單層的RK-13細(xì)胞，吸附30 min后用含2%血清的MEM維持液于37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)。48 h后，當(dāng)出現(xiàn)75%以上細(xì)胞病變（CPE）時收獲病毒，反復(fù)凍融3次后收集細(xì)胞液4 000 r/min 粗離 30 min收集上清，至透析袋加入PEG6000濃縮至50~60 mL，130 000 g超離3 h 、棄上清，收集沉淀，蔗糖梯度離心，130 000 g超離 3 h（20%、40%、60%）收集夾層，脫糖130 000 g超離 3 h（所有離心均在4 ℃下）。BCA法測定病毒蛋白含量。

1.4.3 應(yīng)用自制EAV-IgG間接ELISA方法檢測血清樣本 操作步驟：將待檢血清樣品1:100稀釋后加入以0.1 ug/孔病毒包被的酶標(biāo)板內(nèi)（1 ug/mL，100 uL/孔），37 ℃孵育1 h后，洗板3次（3 min/次），加二抗37 ℃孵育40 min~1 h（100 uL/孔），洗板3次（3 min/次），底物顯色液作用15 min后（100 uL/孔），加入2 mL H2SO4終止反應(yīng)（50 uL/孔）。490 nm條件下讀數(shù)。判定標(biāo)準(zhǔn)：OD值若大于規(guī)定的陰性對照OD值的2倍，且被檢血清的OD值在0.2以上者，即為陽性。

1.5 進(jìn)口西班牙INGENASA公司的INGEZIM-ARTERITIS試劑盒檢測2009年中國華南、華中、西北和東北賽馬和役用馬的血清樣本，按試劑盒中說明操作。

2 結(jié)果

2.1 自制EAV-IgG間接ELISA試驗結(jié)果（表1）。

表1 利用自制EAV-IgG間接ELISA試驗檢測2009年我國部分地區(qū)EAV抗體分布

應(yīng)用自制EAV-IgG間接ELISA試劑盒檢測2009年中國華南、華中、西北和東北EAV抗體分布。從華南、華中、東北和西北4個地區(qū)共收集馬血清樣本383份。陽性樣本總數(shù)為50份。其中華南賽馬血清樣本數(shù)為127份，陽性數(shù)為33份；華中賽馬血清樣本數(shù)為41份，陽性數(shù)為0；西北役用馬血清樣本數(shù)為106份，陽性數(shù)為8；東北役用馬血清樣本數(shù)為109份，陽性數(shù)為9（表1）。上述結(jié)果證實華南賽馬、東北和西北地區(qū)役用馬感染EAV，華中賽馬沒有感染EAV，華南賽馬陽性數(shù)比西北和東北役用馬高約3倍。

2.2 西班牙INGEZIM-ARTERITIS試劑盒檢測結(jié)果（表2 ）。

表2 西班牙INGEZIM-ARTERITIS試劑盒檢測2009年我國部分地區(qū)EAV抗體分布

應(yīng)用西班牙商品化診斷試劑盒檢測2009年我國華南、華中、西北和東北EAV抗體分布。陽性樣本總數(shù)為40。其中，華南賽馬血清樣本陽性數(shù)為34；華中賽馬血清樣本陽性數(shù)為0；西北役用馬陽性數(shù)為2；東北役用馬陽性數(shù)為4（表2）。上述結(jié)果證實華南賽馬、東北和西北地區(qū)役用馬感染EAV，華中賽馬沒有感染EAV。華南賽馬陽性數(shù)比西北和東北役用馬高約17倍和8倍。

2.3 兩種試劑盒比對結(jié)果

本試驗自制EAV-IgG間接ELISA試劑盒與西班牙INGEZIM-ARTERITIS試劑盒對中國華南、華中、西北和東北地區(qū)賽馬和役用馬血清樣本檢測的比對結(jié)果（表3，4）。

表 3 自制試劑盒與西班牙INGEZIM-ARTERITIS試劑盒對華中和華南地區(qū)賽馬血清樣本檢測的比對結(jié)果

表 4 自制試劑盒與西班牙INGEZIM-ARTERITIS試劑盒對西北和東北地區(qū)賽馬血清樣本檢測的比對結(jié)果

自制與西班牙商品化試劑盒檢測華南和華中地區(qū)賽馬的比對結(jié)果相符合。華南地區(qū)賽馬EAV抗體陽性率為26%（26.77%），華中地區(qū)賽馬EAV抗體陽性率為0（0）。說明兩者一致證實華南賽馬有感染EAV，華中地區(qū)賽馬沒有感染EAV（表3）。自制與商品化試劑盒檢測東北和西北地區(qū)賽馬的比對結(jié)果不完全相符。東北地區(qū)役用馬EAV抗體陽性率為8.26%（3.67%），西北地區(qū)役用馬陽性率為7.55%（1.89%）。東北和西北地區(qū)役用馬陽性血清樣本結(jié)果比進(jìn)口商品化試劑盒檢測結(jié)果分別高2.25倍和4倍，可能有假陽性結(jié)果存在。上述結(jié)果表明，東北和西北地區(qū)役用馬也有感染EAV（表3），其感染率明顯低于華南地區(qū)賽馬（表3，4）。

兩種試劑盒檢測結(jié)果一致證實我國部分地區(qū)賽馬和役用馬感染EAV。華南地區(qū)賽馬陽性血清樣本數(shù)（率）在4個地區(qū)中最高，東北和西北地區(qū)役用馬陽性血清樣本數(shù)（率）居中，華中地區(qū)EAV抗體陽性血清樣本數(shù)（率）為0（表3，4）。華南地區(qū)賽馬EAV抗體陽性率明顯高于東北和西北地區(qū)役用馬。華南賽馬、東北和西北役用馬均不同程度感染了EAV，華中地區(qū)賽馬沒有感染EAV。

3 討論

本試驗結(jié)果證實，我國華南地區(qū)賽馬、東北和西北地區(qū)賽馬和役用馬感染EAV。賽馬和役用馬對EAV易感性強弱或許與其品種和來源有關(guān)[15]。華南地區(qū)賽馬為歐洲溫血純種馬，進(jìn)口自EAV流行相對普遍的歐洲[3，5，7-8]，本品種馬較其他品種馬對EAV更為易感[12，14]。華中、東北和西北地區(qū)役用馬為本地品種和雜交品種（本地品種與進(jìn)口蘇聯(lián)的蘇高血馬品種雜交）引進(jìn)自新疆和內(nèi)蒙古（通遼）。目前，在通遼地區(qū)沒有監(jiān)測到EAV陽性抗體。西北和東北地區(qū)役用馬EAV抗體陽性率相近，明顯低于華南賽馬，可能與進(jìn)口自蘇聯(lián)的蘇高血馬品種有關(guān)。而華中地區(qū)賽馬沒有感染EAV，可能與其引進(jìn)自內(nèi)蒙古（通遼）有關(guān)。地區(qū)間引進(jìn)馬品種和來源不同決定不同地區(qū)間EAV分布不同。華南地區(qū)進(jìn)口歐洲、我國香港和澳門地區(qū)的賽馬，華中、西北和東北地區(qū)引進(jìn)我國新疆和內(nèi)蒙古的馬。

兩種試劑盒檢測EAV的比對結(jié)果證實我國部分地區(qū)賽馬和役用馬感染EAV，華南地區(qū)賽馬EAV感染率最高，東北和西北地區(qū)役用馬次之，華中地區(qū)賽馬沒有感染EAV。

自制試劑盒適用于EAV血清流行病學(xué)調(diào)查。

本試驗結(jié)果顯示，自制試劑盒檢測結(jié)果有一定假陽性，這就要求我們進(jìn)一步的試驗中需要改進(jìn)方式，保證自制試劑盒檢測結(jié)果。

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