用Nested-PCR診斷雞彎曲菌病的研究

張 康 ，龔振華 ，李 蕾 ，王洪偉 ，李玉清 ，張麗娟 ，王麗萍，莊青葉，于建敏，李金平，劉國慶

（1.中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，山東青島 266032；2.青島易邦生物股份有限公司，山東青島 266032；3.諸城市畜牧獸醫(yī)管理局，山東諸城 262200；4.膠南市興牧科技服務中心，山東膠南 266400）

雞彎曲菌病又稱為雞弧菌性肝炎，主要由空腸彎曲菌感染引起的幼雞或成年雞傳染病。本病以肝出血壞死性肝炎伴發(fā)脂肪浸潤，主要呈慢性經過為特征，影響雞的生產性能，可以給養(yǎng)雞業(yè)造成較大的經濟損失。傳統(tǒng)的細菌學分離方法是檢測雞彎曲菌病的主要方法[1]，但因該菌培養(yǎng)需要微厭氧培養(yǎng)系統(tǒng)、營養(yǎng)條件苛刻、增菌分離及生化鑒定所需時間長，使得該方法在實際操作中顯得非常繁瑣與不便。臨床實踐中，有時需要采用空腸彎曲菌快速檢測方法進行臨床診斷。近年來，PCR檢測方法以其特異性強、靈敏度高和快速簡便等優(yōu)點，已經在雞彎曲菌病的檢測中得到了廣泛的應用[2-5]。我們采用Nested-PCR方法，對某雞場發(fā)生的空腸彎曲菌感染雞進行了快速診斷研究，現(xiàn)將結果報告如下。

1 材料

1.1 PCR對照樣品

陽性對照樣品：空腸彎曲菌（ATCC33560）由中國動物衛(wèi)生與流行病學中心保存。

陰性對照樣品：市場上購買的健康雞肝組織。

1.2 引物

采用高正琴等[6]報道的2對針對彎曲菌fl a A區(qū)的 Nested-PCR 的 引 物，F(xiàn)1：5'-GGAGGATCCATGGGA TTTCGTATTAAC-3'；R1：5'-TTTGGATTCCTACTGT AGTAATCTTAA-3'。F1+R1 擴 增 長 度 為 1 719 bp。F2：5'-ATGAAAGAAAACTATGGCCG CTTGTCT-3'； R2：5'-AGTCTACATCACGGATTTG CGATTCTG-3'，F(xiàn)2+R2擴增長度為640 bp。

1.3 其他試劑

1.3.1 生化試劑 Taq酶、buffer、dNTPs、DNA Mar k er（均為大連寶生物工程公司）。

1.3.2 樣品保存液 商品化DNA保存液（北京康為世紀生物科技有限公司）。

1.3.3 核酸純化試劑盒 微量DNA快速純化試劑盒（VWI產品）。

1.4 檢測樣品

從某發(fā)病雞場臨床采集的雞肝臟、脾臟、盲腸和泄殖腔糞便。

2 方法

2.1 樣品的采集

取發(fā)病雞進行組織解剖，取病變肝臟、脾臟、盲腸、泄殖腔糞便各1 g左右，分別快速剪碎，置于10 mL DNA保存液，4 ℃ 保存。

2.2 樣品 DNA 的提取

按微量DNA快速純化試劑盒操作說明書進行，主要是取組織樣品經蛋白酶K消化，置于DNA 結合柱，經離心沖洗，加洗脫液沖洗，收集純化的DNA樣品，以備下一步使用。

2.3 Nested-PCR

參考高正琴等[6]方法，第一次PCR反應用純化的組織樣品DNA作為模板，用F1及R1引物進行PCR反應，擴增理論設計長度為1 719 bp的DNA大片段；第二次PCR反應進一步取第一次PCR擴增產物作為模板，用F2及R2引物進行Nested-PCR反應，擴增理論設計長度為640 bp的小片段。

3 結果

3.1 病雞的臨床表現(xiàn)

雞場發(fā)病率為5%，病雞表現(xiàn)精神沉郁，食欲減少，病初拉稀，有飲水欲，肛門周圍污染糞便。腹部增大，雞冠蒼白，出現(xiàn)急性死亡現(xiàn)象。多數病雞轉為慢性，表現(xiàn)精神萎頓，可見鱗片狀皮屑、逐漸消瘦、飼料消耗減低等。

3.2 剖檢病理變化

病死雞尸體脫水、消瘦，后部羽毛污染；肝被膜下或實質內有大小不等、數目不一的血泡腫，肝臟腫大、邊沿鈍圓、瘀血，有出血點和壞死點，肝質地硬化易碎，呈網格狀碎塊；脾臟腫大，有壞死斑點；膽囊腫大，色澤呈黃綠色，膽汁充盈、黏稠；心包積液，呈透明的橙黃色，心肌松軟無力，心肌有黃色壞死灶；腎腫大褪色；脾臟極度腫大變圓，呈斑駁狀外觀；腺胃松弛無力，乳頭偏平，肌胃和腺胃及空腸黏膜有不同程度出血、瘀血，直腸部位出血及卡他性腸炎。

3.3 PCR結果

本實驗中的組織樣品，及對照樣品用Nested-PCR 檢測后，可見到如下實驗結果。

陽性對照樣品，空腸彎曲菌（ATCC33560）經Nested-PCR檢測后，第一次PCR和第二次PCR反應分別擴增出一條長度為1 719 bp和640 bp的特異性DNA片段，符合實驗設計要求。陰性對照樣品經Nested-PCR檢測后未出現(xiàn)特異性DNA條帶，說明實驗結果成立。

病雞組織樣品：病雞組織樣品肝臟、脾臟、盲腸、泄殖腔糞便等四種組織樣品經Nested-PCR檢測后，第一次PCR和第二次PCR反應分別擴增出一條長度為1 719 bp和640bp的特異性DNA片段，符合實驗設計要求（圖1、2），說明病雞存在空腸彎曲菌感染。

4 討論

4.1 空腸彎曲菌是一種容易引起感染的疾病，通常由于飼養(yǎng)條件和管理方式存在不足，而導致雞感染發(fā)病，尤其是內臟感染，引起雞生產性能降低、發(fā)育遲鈍、飼料報酬低，造成養(yǎng)雞場的經濟損失。過去的資料表明，空腸彎曲菌的發(fā)病率為1%~2%，本研究中發(fā)現(xiàn)，該病雞場的發(fā)病率達到5%，病雞肝臟、腎臟、脾臟等實質器官出現(xiàn)明顯的出血、腫大等病理變化，導致養(yǎng)雞場的經濟損失較為嚴重，提示雞空腸彎曲菌對雞的致病性有可能加強，應引起重視。

4.2 傳統(tǒng)的檢測空腸彎曲菌的方法是通過細菌培養(yǎng)，再進行生化鑒定，需要一周以上的診斷時間，且細菌培養(yǎng)條件苛刻，對實驗條件具有較高的要求。故傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)鑒定方法只適用于條件較好的實驗室進行，不適宜推廣。本研究采用Nested-PCR 對臨床采集的空腸彎曲菌感染雞樣品進行檢測，檢測的發(fā)病雞樣品經第一次PCR反應，均擴增了長度為1 719 bp的特異的DNA條帶。進一步取第一次PCR反應產物最為模板，用Nested-PCR擴增了長度為640 bp的特異DNA條帶，從而確保了該PCR診斷空腸彎曲菌感染的特異性和靈敏性。該PCR實驗結果清晰，操作簡便，于24小時內即可獲得檢測結果。建議該Nested-PCR方法推廣使用。

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[3] 王振國，劉金華，羅燕菲，等. 應用PCR技術檢測空腸彎曲菌及結腸彎曲菌的研究[J].中國家禽，2005，9（1）：133-135.

[4] Neubauer C，Hess M.Detection and identification of foodborne pathogens of the genera Campylobacter，Arcobacter and Helicobacter by multiplex PCR in poultry and poultry products[J].J Vet Med B Infect Dis Vet Public Health，2006，53（8）：376-381.

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[6] 高正琴，張強，邢進，等. 空腸彎曲菌套式PCR快速檢測方法的建立與初步應用[J].中國比較醫(yī)學雜志，2006，16（12）：727-730.