家蠶桿狀病毒表達系統(tǒng)研究進展

壽 鑫，應(yīng)慧慧，李 擎，于 威,2，張耀洲,2

(1.浙江理工大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，杭州 310018；2.浙江省家蠶生物反應(yīng)器和生物醫(yī)藥重點實驗室，杭州 310018)

家蠶桿狀病毒表達系統(tǒng)研究進展

壽 鑫1，應(yīng)慧慧1，李 擎1，于 威1,2，張耀洲1,2

(1.浙江理工大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，杭州 310018；2.浙江省家蠶生物反應(yīng)器和生物醫(yī)藥重點實驗室，杭州 310018)

近年來家蠶桿狀病毒表達系統(tǒng)在應(yīng)用和優(yōu)化等方面研究有了新進展。家蠶桿狀病毒表達系統(tǒng)利用攜帶外源目的蛋白基因的重組桿狀病毒對家蠶及其細胞系的高效感染能力，在感染后的家蠶體內(nèi)或培養(yǎng)細胞中大量表達目的蛋白。家蠶作為一種外源蛋白表達載體，具有與哺乳動物細胞類似的翻譯后修飾過程，其與核型多角體病毒的動態(tài)相互作用也一直是研究的熱點。由于該系統(tǒng)潛在的巨大優(yōu)勢，為生產(chǎn)人類急需的蛋白質(zhì)藥物、基因工程疫苗和基因工程殺蟲劑等提供了新的途徑。

家蠶；桿狀病毒表達系統(tǒng)；新進展

桿狀病毒(Baculovirus)是一種具有囊膜的雙鏈環(huán)狀DNA病毒，其基因組大小介于80～180 kb之間。桿狀病毒主要感染無脊椎動物，特別是鱗翅目昆蟲，包括膜翅目、雙翅目、脈翅目、蚤目、纓尾目、毛翅目等7個目的昆蟲。桿狀病毒屬于桿狀病毒科(Baculoviridae)，可分為兩個病毒屬：核型多角體病毒屬(Nucleopolyhedrovirus, NPV)和顆粒體病毒屬(Granulovirus, GV)。

家蠶飼養(yǎng)在中國歷史悠久，具有飼養(yǎng)方便、成本低廉的特點，昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)具有高效表達、安全性好、真核修飾、可容納外源基因大等優(yōu)勢，因此，利用桿狀病毒在家蠶內(nèi)高效表達外源蛋白具有產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用前景和優(yōu)勢。本文從家蠶桿狀病毒表達系統(tǒng)的應(yīng)用和優(yōu)化來簡述近年來家蠶桿狀病毒表達系統(tǒng)的最新研究進展。

1 桿狀病毒表達系統(tǒng)的發(fā)展

Maeda[1]于1985年利用家蠶核型多角體病毒(Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus, BmNPV)作為載體表達了人β-干擾素，但是其構(gòu)建重組病毒的方法存在重組病毒篩選困難、耗時長等問題。Luckow[2]于1993年構(gòu)建了可以在大腸桿菌中復(fù)制并對昆蟲細胞仍具有的侵染能力的桿狀病毒穿梭載體(Baculovirus shuttle vector, Bacmid)，大大縮短了重組病毒構(gòu)建所需時間。這種技術(shù)根據(jù)細菌轉(zhuǎn)座子原理，利用細菌轉(zhuǎn)座子將供體質(zhì)粒上的表達盒轉(zhuǎn)移至Bacmid基因組上的attTn7位點，從而獲得了重組病毒基因組。同時在重組病毒基因組添加了多種抗性基因及LacZ缺失標記，利于重組病毒的篩選及鑒定。

Motohashi[3]于2005年利用相似方法構(gòu)建了BmNPV bacmid和E.coli DH10B轉(zhuǎn)化細胞，建立了基于家蠶的Bac-to-Bac表達系統(tǒng)。目前已開發(fā)數(shù)種桿狀病毒表達技術(shù)，有數(shù)百種重組蛋白利用家蠶桿狀病毒表達系統(tǒng)在家蠶中成功表達。

2 外源基因在家蠶中的表達

家蠶桿狀病毒表達系統(tǒng)表達的外源基因來源廣泛，其中大部分來自于真核生物，也有一些基因來自于細菌等微生物。家蠶桿狀病毒表達系統(tǒng)作為一種真核細胞表達系統(tǒng)，可對表達的蛋白進行修飾如磷酸化、?；?、糖基化等，其高級結(jié)構(gòu)與天然相似，通過設(shè)計信號肽分子，能夠增加膜蛋白或分泌型蛋白的表達[4]。

到目前為止，多種外源蛋白基因利用家蠶桿狀病毒系統(tǒng)在家蠶中獲得了高效表達，廣泛涉及醫(yī)用藥物蛋白、疫苗生產(chǎn)等領(lǐng)域。如：類胰島素樣生長因子(IGF-II)[5]、小鼠白細胞介素3(IL-3)[6]、人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(HGM-CSF)[7]等基因。同時在家蠶細胞中表達了乙型肝炎表面抗原(HBsAG)疫苗[8]、口蹄疫亞單位疫苗[9]等。

2.1 外源基因的表達方式

目前，外源基因引入家蠶核型多角體病毒載體可分為插入融合表達和插入破壞原始基因兩種。常用的外源基因插入位點一般為病毒粒子的蛋白衣殼基因，包括polh基因、p10基因、gp64基因等。GP64是家蠶核型多角體病毒的一種囊膜糖蛋白，當外源蛋白與囊膜蛋白融合表達時，表達的外源蛋白展示在病毒粒子表面，可對外源蛋白進行蛋白質(zhì)相互作用研究或作為特異性抗原免疫動物產(chǎn)生免疫保護。

2.2 外源基因的表達水平

不同的外源基因利用家蠶桿狀病毒表達系統(tǒng)在家蠶幼蟲或細胞內(nèi)的表達量有較大的差異。Sasaki等[10]利用桿狀病毒表達系統(tǒng)在家蠶中表達人免疫細胞表明受體(KIR2DL1)，使用鎳柱親和層析從家蠶體液中純化目的蛋白，其產(chǎn)率達到0.2 mg/幼蟲。Zhou等[11]利用桿狀病毒表達系統(tǒng)在家蠶中表達重組內(nèi)切β-葡聚糖酶，其表達量在家蠶幼蟲中達到了386 mg/幼蟲。因此，如何提高外源基因在家蠶中的表達水平是一個關(guān)鍵問題。

3 高效表達系統(tǒng)的構(gòu)建

3.1 桿狀病毒表達載體的選擇

隨著技術(shù)的發(fā)展，越來越多的面對不同需求的桿狀病毒表達載體已被開發(fā)出來。真核細胞表達的大多數(shù)蛋白質(zhì)都是多亞基聚合體，在細胞內(nèi)執(zhí)行著重要的功能。但是研究這些多亞基蛋白的結(jié)構(gòu)和功能依賴于通過重組表達技術(shù)獲得大量的構(gòu)象正確的蛋白質(zhì)。MultiBac是一種桿狀病毒表達載體系統(tǒng)，目前已被用于真核多亞基蛋白復(fù)合物的生產(chǎn)。MultiBac系統(tǒng)是在Bac-to-Bac的基礎(chǔ)上通過改造轉(zhuǎn)移載體(Transfer vector)和Bacmid，利用Tn7轉(zhuǎn)座受體位點將轉(zhuǎn)移載體上的目的基因轉(zhuǎn)入病毒基因組上，獲得重組病毒[12]。Yao等[13]利用三種供體載體和DAP營養(yǎng)缺陷型大腸桿菌受體，構(gòu)建了能同時表達輪狀病毒vp2、vp6、vp7基因的重組BmNPV，在家蠶幼蟲中實現(xiàn)了輪狀樣病毒顆粒的組裝。這種方法為在真核細胞中高效表達多蛋白復(fù)合體提供了可能。

細菌輔助交配遺傳整合型克隆方法(Matingassisted genetically integrated cloning, Magic)是一種體內(nèi)高效克隆目的基因的方法，通過細菌接合、體內(nèi)特異性位點限制性剪切和同源重組技術(shù)使目的DNA片段從供體質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到受體質(zhì)粒，獲得重組Bacmid分子[14]。Yao等[15]將承載了目的DNA的pCT dual供體質(zhì)粒的菌株和含有經(jīng)過修飾的Bacmid的受體菌株混合，在體內(nèi)的限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶作用下，利用同源重組獲得重組Bacmid DNA，將Bacmid DNA/CaPO4混合物注射入家蠶幼蟲體內(nèi)獲得重組病毒。這種方法可將構(gòu)建重組Bacmid DNA時間縮短到三天，且可利用磷酸鈣法轉(zhuǎn)染細胞，降低了生產(chǎn)成本。

3.2 啟動子的選擇

啟動子一般分為極早期啟動子、早期啟動子、晚期啟動子，以及極晚期啟動子。桿狀病毒載體一般使用polh啟動子或p10啟動子，這些強啟動子屬于極晚期啟動子，可以在感染晚期大量高效地表達，但同時也會引起蛋白聚集。polh基因是病毒復(fù)制的非必需基因，編碼多角體蛋白，插入失活后可以產(chǎn)生明顯的表型變化，可作為一種重組病毒的篩選標記。P10蛋白與多角體蛋白一起參與包裹病毒粒子和多角體形成。由于p10基因缺失時不能產(chǎn)生可識別的表型差異，可引入LacZ作為篩選標記篩選重組病毒。

根據(jù)目前的研究，BES中多角體啟動子控制下外源基因的表達水平通常遠不如多角體蛋白的表達水平。因此，在多角體基因序列后面插入外源基因，融合表達可使外源蛋白的表達量增加。Lee等[16]將豬瘟病毒CSFV的包膜蛋白E2與核型多角體病毒的多角體蛋白融合表達，在家蠶血淋巴和家蠶幼體中表達量分別達到0.68 mg/mL和0.53 mg/幼蟲，免疫試驗和病毒中和試驗表明，融合蛋白具有免疫原性和顯著的病毒中和活性，可用于大規(guī)模生產(chǎn)的豬瘟病毒E2抗原。

為了減少蛋白的聚集，可以選用在感染時較早表達的、核衣殼蛋基因啟動子，如vp39啟動子。核衣殼蛋白基因vp39是一個桿狀病毒在晚期表達的必需基因，其表達產(chǎn)物vp39蛋白是組成病毒核衣殼的主要成分。但是vp39啟動子在減少蛋白降解的同時也會降低蛋白的表達量[17]。

3.3 宿主的選擇

一般來說，家蠶幼體表達重組蛋白的水平要高于細胞。另外，蠶蛹也可以被用來作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)蛋白質(zhì)。Ishikiriyama等[18]對比了半胱氨酸蛋白酶和幾丁質(zhì)酶缺陷型的BmNPV bacmid與未修飾的bacmid在蠶蛹中表達scFv的差異，發(fā)現(xiàn)差異很小。這可能是因為半胱氨酸蛋白酶在蠶蛹中表達量比較少，因此，利用蠶蛹來生產(chǎn)半胱氨酸蛋白酶敏感型蛋白或許是個不錯的選擇。研究表明，家蠶幼體具有豐富的血淋巴而適合于分泌型蛋白的表達，蠶蛹則更適合表達膜蛋白和內(nèi)在蛋白[17]。

由于絕大多數(shù)重組桿狀病毒都采用替換多角體基因(polh)，導(dǎo)致病毒無法形成包涵體顆粒，給接種家蠶帶來了一定的困難，因此建立一種在家蠶體內(nèi)簡單、快速生產(chǎn)重組蛋白的方法顯得尤為重要。Lee等[19]將家蠶核型多角體病毒基因組、轉(zhuǎn)移載體和脂質(zhì)體共同注射到5齡家蠶中，從血淋巴中獲得了重組病毒。再將含有重組病毒的血淋巴接種到5齡家蠶內(nèi)，檢測發(fā)現(xiàn)外源蛋白在家蠶體內(nèi)高效表達。

Wang等[20]發(fā)現(xiàn)熒光增白劑可以提高缺少了多角體基因的重組BmNPV對家蠶的經(jīng)口感染率，他們將重組病毒粒子與熒光增白劑VBL混合添加入家蠶人工飼料，喂食家蠶后發(fā)現(xiàn)最大感染率達到90 %，并且與對照組相比，試驗組家蠶蛋白酶含量和腸液pH值均減小，病毒感染率的提高或由蟲體消化系統(tǒng)的異常生理變化導(dǎo)致。

3.4 桿狀病毒基因組的改造

在家蠶細胞中表達的蛋白容易被降解，其原因與半胱氨酸蛋白酶和幾丁質(zhì)酶有關(guān)。幾丁質(zhì)酶是一類具有生物催化活性的水解蛋白酶，可降解昆蟲體內(nèi)幾丁質(zhì)，使蟲體液化，激活了半胱氨酸蛋白酶的釋放，從而使表達蛋白被降解[21-22]。Park等[23]發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了BmNPV-CP?bacmid的家蠶與對照相比血淋巴中蛋白酶活性減少了85 %。目前已利用缺失半胱氨酸蛋白酶和幾丁質(zhì)酶的家蠶核型多角體病毒高效表達了人IgG1[24]、纖維素酶[25]等。因此，通過修飾桿狀病毒基因組，將導(dǎo)致重組蛋白降解的蛋白酶基因敲除，從而減少重組蛋白被分解，就可以提高目的基因的表達水平。

4 糖基化修飾

蛋白質(zhì)糖基化修飾是一種重要的翻譯后修飾，參與受體激活、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等諸多重要的生物進程。蛋白質(zhì)的糖基化，特別是N-連接糖基化主要發(fā)生在膜蛋白、分泌蛋白等上，具有重要的生物學(xué)意義。Katsuma等[26]利用定點突變技術(shù)使得從BmN細胞中表達的成纖維細胞生長因子(FGF)缺少N-葡聚糖結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)目的蛋白被完全抑制分泌進入培養(yǎng)基。這表明N-葡聚糖結(jié)構(gòu)在桿狀病毒編碼蛋白分泌過程中具有重要作用。

但是家蠶和人的糖基化修飾方式具有明顯的不同，昆蟲細胞表達的糖蛋白是簡單的寡甘露糖N-糖鏈構(gòu)型，而哺乳動物的糖蛋白是具有唾液酸末端的雜合型N-糖鏈構(gòu)型。這種差異與昆蟲細胞內(nèi)存在一種特殊的N-糖基加工的β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶有關(guān)[27]。因此，對昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)的糖基化修飾途徑進行改造，將更有利于人源化糖蛋白的合成。

Dojima等[28]研究發(fā)現(xiàn)，分子伴侶的存在可以增加人分泌型IgG1蛋白在家蠶幼蟲內(nèi)的表達量，且其 N-葡聚糖的結(jié)構(gòu)沒有改變。這表明雖然分子伴侶可輔助蛋白的翻譯后修飾過程，但其 N-糖基化修飾是由高爾基體控制的。因此，如果通過共表達N-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶、半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和唾液酸轉(zhuǎn)移酶能夠改進糖基化途徑， 將有助于人源化抗體的生產(chǎn)[28]。

5 核型多角體病毒與宿主細胞的相互作用

桿狀病毒與宿主細胞的相互作用是一種自然進化和相互適應(yīng)的過程，包括宿主對桿狀病毒的作用和桿狀病毒對宿主的影響。目前，在病毒或家蠶的基因發(fā)現(xiàn)、功能研究上較為熱門，而對兩者在分子水平上的相互作用研究較少。

桿狀病毒的基因表達具有時序性，在病毒侵染的初始階段，早期基因的表達可幫助病毒建立感染和選擇性的作用于宿主的特異基因，以利于控制宿主基因表達和子代生產(chǎn)。晚期轉(zhuǎn)錄時相主要為病毒粒子DNA的復(fù)制和結(jié)構(gòu)基因表達。正如大腸桿菌會丟失轉(zhuǎn)入的質(zhì)粒一樣，宿主細胞對病毒的侵染會出現(xiàn)抵制行為，如免疫反應(yīng)、凋亡、RNA干擾等策略。

Sagisaka等[29]發(fā)現(xiàn)經(jīng)BmNPV侵染家蠶細胞12 h后，利用寡核苷酸微點陣檢測宿主基因的轉(zhuǎn)錄情況，宿主基因中有35個出現(xiàn)了明顯的上調(diào)，17個基因出現(xiàn)下調(diào)現(xiàn)象；利用定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(qRT-PCR)檢測家蠶細胞中mRNA表達水平發(fā)現(xiàn)，13個基因有顯著的上調(diào)、7個基因出現(xiàn)了下調(diào)現(xiàn)象，但是大多數(shù)基因的表達水平并沒有發(fā)生較大變化。說明桿狀病毒的侵染會對宿主細胞的基因表達產(chǎn)生影響，進而影響宿主細胞的正常生理活動。

泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(Ubiquitin-proteasome pathway)主要參與體內(nèi)蛋白質(zhì)的識別和降解過程，在家蠶核型多角體病毒逃避宿主細胞的免疫監(jiān)視、病毒粒子的釋放具有重要作用。Xue等[30]檢測發(fā)現(xiàn)在病毒感染過程中泛素-蛋白酶體通路相關(guān)基因出現(xiàn)上調(diào)現(xiàn)象，并且病毒表達蛋白與多種宿主蛋白發(fā)生了相互作用，其中的5種病毒表達蛋白參與了基因的轉(zhuǎn)錄過程，暗示泛素-蛋白酶體通路與病毒侵染過程相關(guān)。Katsuma等[31]利用特異性蛋白酶抑制劑MG-132處理用BmNPV侵染的BmN-4細胞，發(fā)現(xiàn)病毒粒子出芽和多角體蛋白合成減少，暗示蛋白酶體降解病毒自身蛋白或者宿主細胞蛋白對于感染早期多角體基因的高效表達是必須的。另外，在BmNPV中敲除病毒泛素基因(v-ubi)后，病毒侵染不能形成出芽型病毒和合成多角體蛋白，進一步說明泛素-蛋白酶體系統(tǒng)在病毒侵染過程中的重要性。

6 家蠶桿狀病毒表達系統(tǒng)的展望

家蠶作為一種特殊的經(jīng)濟昆蟲，與其他表達載體相比更具優(yōu)越性。利用家蠶表達外源重組蛋白具有成本低廉、操作方便、生產(chǎn)高效和適合產(chǎn)業(yè)規(guī)?；a(chǎn)的優(yōu)點，家蠶桿狀病毒表達系統(tǒng)在農(nóng)業(yè)、基礎(chǔ)分子生物學(xué)，以及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有極其重要的應(yīng)用價值。

盡管桿狀病毒表達系統(tǒng)有著一系列的優(yōu)點，但也存在不足。首先，用外源基因替代多角體蛋白后，目的蛋白的表達水平差異較大，如何提高表達量，建立一個高效的、穩(wěn)定的合適表達載體仍是一個重要的研究內(nèi)容。其次，蛋白糖基化修飾方式與哺乳動物細胞存在一定差異，不能滿足人源化蛋白表達的要求。并且由于外源基因是通過最終殺死細胞的病毒載體導(dǎo)入宿主細胞的，所以桿狀病毒表達系統(tǒng)不能提供穩(wěn)定的細胞株。

目前，家蠶和桿狀病毒的基因發(fā)現(xiàn)和單個基因的功能研究已有較多報道，但是對于家蠶和桿狀病毒間的動態(tài)相互作用卻研究較少。因此，對家蠶和桿狀病毒進行深入的功能基因組學(xué)研究，不斷改造和優(yōu)化這一表達系統(tǒng)，來生產(chǎn)高附加值的藥用蛋白和疫苗，將具有廣闊的應(yīng)用前景和極大的競爭優(yōu)勢。

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Progress of researches on baculovirus expression system of bombyx mori

SHOU Xin1, YING Hui-hui1, LI Qing1, YU Wei1,2, ZHAGN Yao-zhou1,2
(1.College of Life Science, Zhejiang Sci-Tech University, Hangzhou 310018, China; 2.Zhejiang Provincial Key Laboratory of Silkworm Bioreactor and Biomedicine, Hangzhou 310018, China)

Based on application and optimization of baculovirus expression system of bombyx mori, this thesis summarizes the progress of latest researches on baculovirus expression system of bombyx mori. The expression system of bombyx mori baculovirus uses the high-efficiency infectivity of recombinant rhabdovirus carrying exogenous objective protein gene production on its cell lines to express a large number of objective proteins in infected bombyx mori or cultivated cells. As an expression vector of exogenous protein, bombyx mori has post-translational modifications like the mammalian cells and the dynamic interaction with Bombyx mori nucleopolyhedrovirus has been a hot research field all the time. As the system has potential huge advantages, it provides new approaches for protein medicine, genetic engineering vaccine and genetic engineering insecticide which people need urgently.

Bombyx mori; Baculovirus expression system; New progress

S881.24

A

1001-7003(2012)09-0018-05

2012-06-07

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃“863”項目(2011AA10 0603)；浙江省自然科學(xué)基金項目(Y3090339)；浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新計劃項目(2011R406028)

壽鑫(1990－ )，男，2009級生物技術(shù)專業(yè)本科生。通訊作者：于威，副教授，碩導(dǎo)，yuwei@zstu.edu.cn。