耐藥突變選擇窗與抗菌藥物防耐藥突變濃度的研究進展

劉 淼 劉海鳳 鄭風勁 審校

1（四川大學 基礎(chǔ)醫(yī)學與法醫(yī)學院，成都 610041）

2（新鄉(xiāng)醫(yī)學院 第三附屬醫(yī)院，新鄉(xiāng) 453003）

目前臨床上大量病人反復(fù)使用抗菌藥物所產(chǎn)生的選擇性壓力［1］，使細菌中的突變壓群逐漸發(fā)展成為優(yōu)勢菌群，導致細菌發(fā)生不同水平的耐藥，以致于這種耐藥大規(guī)模的傳播，造成人類健康的嚴重威脅。美國學者XilinZhao［2，3］等首先提出了防細菌耐藥突變體選擇濃度（mutant prevention concentration，MPC），突變選擇窗（mutant selection window，MSW）的新假說和新理論，為臨床抗菌藥物給藥方案提供了新思路。

1 抗菌藥物的MPC

1.1 MPC的概念

MPC 是指防止單次耐藥突變菌株被選擇性富集擴增所需的最低抗菌藥物濃度。這一概念最早是由美國國立衛(wèi)生研究院的XilinZhao 研究小組于1999年提出的，用于評價抗菌藥物的抗菌活性并反映其抑制細菌耐藥的能力。

細菌發(fā)生耐藥突變，并在菌群中得到選擇性優(yōu)勢生長，是細菌產(chǎn)生耐藥的必需條件。據(jù)研究［4］，細菌出現(xiàn)耐藥必須具備兩個條件：（1）出現(xiàn)耐藥突變菌株；（2）該耐藥突變菌株在菌群中的到選擇性優(yōu)勢增菌（也稱富集擴增）。通常情況下，細菌在繁殖過程中會因為自發(fā)的遺傳變異或耐藥基因在細菌間的水平轉(zhuǎn)移等原因而產(chǎn)生耐藥突變菌，但這種突變菌株的出現(xiàn)頻率較低［5］，一般需要菌群的菌落數(shù)目達到107時，才有可能出現(xiàn)1 個耐藥突變菌株。細菌數(shù)量達到1014時，才可能出現(xiàn)同時發(fā)生兩次耐藥突變的菌株。臨床實際中，人體感染部位可達到1010CFU，但不可能達到1014CFU，因此將沒有雙重突變菌株供選擇，MPC 的理論就是在此基礎(chǔ)上提出，試圖通過防止最不敏感、一步耐藥突變菌株被選擇性富集擴增，從而限制細菌耐藥的進一步發(fā)展。

1.2 MPC的測定方法

MPC的測定方法最早是由Dong［6］等建立的。研究發(fā)現(xiàn)，隨著瓊脂平板中氟喹諾酮（FQ）藥物濃度的增加，平板中生存的結(jié)核分支桿菌和金黃色葡萄球菌恢復(fù)增長的菌落數(shù)出現(xiàn)兩次明顯下降。第一次下降發(fā)生在MIC 時，歸因于抑制了野生型藥物敏感性細菌的生長，隨著藥物濃度增加，恢復(fù)增長的菌落數(shù)逐漸減少并維持在一個相對穩(wěn)定的水平（平臺期）；隨著藥物濃度的進一步增長，直至某一限度時，瓊脂板上沒有了菌落的生長，即達到了抑制單步突變耐藥菌生長的濃度（MPC），在這一過程中出現(xiàn)了菌落數(shù)第二次的明顯下降。

標準的測定使用104～105CFU 的細菌，由于人體感染部位的細菌數(shù)量很少能超過1010CFU，且從1010CFU細菌中能敏感地發(fā)現(xiàn)耐藥突變菌（103），同時超過1010CFU 在操作起來具有一定困難，因此規(guī)定MPC測定時使用數(shù)量為1010CFU的細菌［7］。

1.3 MPC的適用范圍

目前Zhao［8］的觀點普遍為大家認同：MPC 是一個活性測定，所以MPC 概念適用于廣泛的遺傳耐藥問題，而不僅僅是雙靶位藥物氟喹諾酮類（FQ）耐藥問題。除FQ 外，研究者還檢測了紅霉素、青霉素、四環(huán)素、妥布霉素、利萘唑酮和泰利霉素等抗菌藥對金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、大腸桿菌、流感嗜血桿菌、結(jié)核分支桿菌及包皮垢分枝桿菌等細菌的MPC。其菌落恢復(fù)生長曲線均可見隨著藥物濃度升高有兩次明顯的下降，只是平臺的寬度各不相同。因此，MPC不僅僅適用于殺菌藥物，而且對抑菌藥物也同樣適用。

2 抗菌藥物的MSW

2.1 MSW 概念

細菌突變耐藥株在最低抑菌濃度（MIC）到防突變濃度（MPC）之間會被選擇出來，此為突變選擇窗。低于MIC，因為敏感株細菌和突變株細菌都不被抑制，故突變株細菌不被選擇實現(xiàn)；高于MPC，因細菌同時兼有兩種耐藥機制幾率非常?。?～10］，故突變株細菌已被殺滅，。當藥物濃度大部分時間處于MSW 內(nèi)時，耐藥突變菌株被選擇性富集擴增。該理論與傳統(tǒng)理論的區(qū)別在于傳統(tǒng)理論認為在抗菌藥物濃度低于MPC 時，耐藥突變菌株易被誘導產(chǎn)生，從而導致細菌耐藥，忽略了藥物濃度落在MSW內(nèi)時，導致的耐藥突變菌株的選擇性富集。低于MIC的治療濃度不會導致耐藥突變菌株的選擇性富集，因它可使整個病原菌群增強，從而相對地增加了耐藥突變菌株數(shù)量，而這些耐藥突變菌株在以后的抗菌藥物治療中將被選擇性富集擴增。

2.2 MSW 的理論依據(jù)

1990年Baquero［11］最早提出抗菌藥物存在一個最易選擇出耐藥突變體的危險濃度區(qū)域，但沒有進一步實驗證實。1999年Dong［6］等通過氟喹諾同類藥物對結(jié)核分枝桿菌和金黃色葡萄球菌作用的研究定義了最小抑菌濃度MIC 和防耐藥突變濃度（MPC）的范圍為MSW。而后又有Blonduau 和Hansen等測定氟喹諾酮藥物對肺炎鏈球菌的MIC，MPC，通過與氟喹諾酮藥物的藥代動力學參數(shù)的比較印證MSW 理論。

目前臨床上已測出MPC 的細菌包括肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單孢菌、結(jié)核分枝桿菌等，研究結(jié)果表明目前臨床上應(yīng)用的藥物治療量落在了MSW 內(nèi)，在解釋了目前臨床廣泛、嚴重耐藥問題的原因［12］的同時印證了MSW 理論。

2.3 MSW 的適用范圍

和MPC一樣，MSW 概念適用于廣泛的遺傳耐藥問題，而不僅僅是氟喹諾酮類（FQ）藥物；MSW概念關(guān)心的不是具體外排機制、靶位改變或是水解酶去阻遏引起的耐藥，而是細菌是否被選擇性富集。因此，MSW 概念適用于突變積累過程的任何一步。再者，因引入了MPC 作為抗菌藥物活性測定，且殺菌活性不是抑制耐藥突變菌株擴增的必要條件，所以MSW 概念不要求MPC 與敏感菌的MIC緊密相關(guān)，也不要求MPC 與藥物殺菌活性相關(guān)，因此MSW 也適用于非殺菌性藥物。

3 基于MSW 理論的治療策略

3.1 縮小MSW

縮小MSW 的方法有兩個：（1）縮短血漿（或組織、器官）藥物濃度在MSW 中的時間。原則上，首次使藥物快速達峰濃度而通過MSW，并使其余的治療時間保持在MPC 濃度之上而最大限度的縮短突變選擇的時間。（2）減少MPC 和MIC 的差距：MS W 的寬窄可以通過選擇指數(shù)（SI）即MP C／MI C 比值大小來評價，選擇指數(shù)越小，MPC 與MIC差距越小，反應(yīng)該藥物具有越強的限制耐藥突變株選擇的能力，為臨床提供了一項新的療效評定標準。C－8－甲氧基FQ 較C－8－氫FQ 有較強的殺滅突變菌株活性，因而具有較低的MPC。而對于大腸埃希菌，C－8－甲氧基可提高FQ 對野生型敏感菌的進一步縮小選擇窗。

3.2 藥物聯(lián)合應(yīng)用關(guān)閉MSW［13］

對大多數(shù)藥物來說，要獲得血漿或組織液藥物濃度超過MPC 是很困難的，因為一般該濃度將引起患者嚴重的毒副反應(yīng)。當兩種不同作用機制的抗菌藥物聯(lián)合應(yīng)用并同時處于各自的MIC 之上時，細菌需要同時發(fā)生兩種耐藥突變才能生長。因此不同作用機制的藥物聯(lián)合應(yīng)用提供了一種關(guān)閉MSW的途徑，即使這些藥物各自都有非常高的MPC，但仍有多種情況致使MSW 開放：（1）兩種藥物的藥代動力圖不完全重疊而使MSW 開放：兩種藥物的濃度在不同的時間內(nèi)大于各自的MIC；（2）由于藥物濃度的波動而使MSW 開放：一種藥物濃度暫時性低于其MIC，而另一種藥物仍在其MIC之上；（3）藥物的MIC 提高或組織／血漿藥物濃度波動而使MSW 開放；（4）由于一種耐藥突變而導致細菌多藥耐藥：如外排系統(tǒng)的突變可導致對多種不同類型的抗菌藥物同時耐藥。因此，當幾種不同作用機制的藥物有類似的藥代動力學時，通過劑量和處方管理使幾種藥物在治療過程中一直保持在各自的MIC之上才能達到理想的治療效果。陳愉、張智潔等研究證明單藥治療易導致耐藥突變菌株的富集生長，可通過聯(lián)合用藥方式限制細菌耐藥的發(fā)生［14］。

4 MPC，MSW 理論對新藥研發(fā)的指導意義

目前細菌耐藥已進入了多藥耐藥階段，克服耐藥將是開發(fā)新藥的新要求。從耐藥突變菌被選擇角度看，因為提高MIC 可以縮窄MSW，殺菌劑在MSW 內(nèi)殺滅大量敏感菌，可能比抑菌劑更容易選擇出耐藥突變菌所以MIC 較低的抗菌藥和殺菌劑都不是最符合要求的。從MPC，MSW 理論可知，最有效的抗生素應(yīng)該是可以阻斷或殺滅耐藥突變菌的藥物，研究發(fā)現(xiàn)［15］，將C－8甲氧基加入環(huán)丙沙星，可使后者的MPC 及選擇指數(shù)顯著下降，可見改變藥物結(jié)構(gòu)可以縮窄MSW，這對改造現(xiàn)有抗菌藥提高其抗耐藥菌活性，延長抗菌藥的使用壽命具有現(xiàn)實意義。通過測定生長在不同溫度和氧張力下大腸桿菌，對不同F(xiàn)Q 藥物的MIC，MPC，并根據(jù)MPC，t1／2計算出假定選擇周期，發(fā)現(xiàn)新近研制的半衰期長的抗菌藥，盡管服用方便，但藥物濃度在MSW 內(nèi)的時間較長，有利于細菌對FQ 耐藥突變的發(fā)生，因此研制半衰期長的新藥還需慎重考慮MSW［16］。

研究還發(fā)現(xiàn)，萬古霉素與磷霉素聯(lián)合縮小MRSA 耐藥突變窗的能力強于萬古霉素與利福平的聯(lián)合方案，而磷霉素MSW 較利福平平臺期窄得多，因此，各單藥的MSW 越窄，聯(lián)合使用后MPC 降低的幅度越大［17］，對指導臨床聯(lián)合用藥具有深遠意義。

MPC，MSW 理論增加了限制耐藥的新目標。因此，MPC低、MSW 窄，能安全地使血清藥物濃度超過MPC，并保持一定時間的藥物成為新開發(fā)的最理想抗菌藥；也可通過調(diào)整用藥劑量［18］，尋找不同結(jié)構(gòu)和作用機制藥物，使其藥動學匹配等方法，通過對生物利用度、生物有效性、組織分布等研究而指導開發(fā)兩藥或多藥聯(lián)合治療成為研究重點。MPC，MSW 策略的提出，改變了以往研發(fā)抗菌藥的理念，必將對開發(fā)新藥、重構(gòu)用藥方案及PK／PD 評價理論，以解決臨床耐藥難題產(chǎn)生深遠的影響。

5 結(jié)語

隨著MPC研究的深入，這一理論日益受到實驗室與臨床的重視，并逐漸被接受。如果通過動物體內(nèi)實驗及人體實驗?zāi)軌蝌炞CMPC及MSW 理論，將會徹底改變目前的用藥方案及藥效學評價理論，同時也為解決臨床耐藥難題提供一種新的思路和方法。

［1］李朝霞，劉又寧.細菌耐藥突變選擇窗理論與抗菌藥物合理應(yīng)用［J］.中國藥學雜志，2006，41（16），1201－1205.

［2］Zhao X.Restricting the selection ofantibiotic－resistant mutant：ageneral strategy drived from fluoroquinolones studies［J］.Clin infect Dis，2001，33：S147－156.

［3］Drlica K.A strategy for fighting antibiotic resistance［J］.ASM News，2001，67：27－33.

［4］Zhao X，Drlica K.Restricting the selection of antibiotic resistants：a general strategy derived from fluoroquinolones studies［J］.Clin Infect Dis，2001，33（suppl）：147－156.

［5］Zhao X，Drlica K.Restricting the selection of antibiotic resistant mutant bacteria：measurement and potential use of the mutant selection window［J］.J Infect Dis，2002，185：561－565.

［6］Dong Y，Zhao X，Donmagal AJ，et al.Effect of fluoroquinolone concentration on selection of resistant mutants of mycobacterium－bovis BCG and staphylococcus aureus［J］.Antimicrob Agents Chem－other，1999，43（7）：1756－1758.

［7］Metzler K，Hansen GM，Hedlin P，et al.Comparison of minimal inhibitory and mutant prevention drug concentrations of 4 fluoroquinolones against clinical isolates of methicillin susceptible and resistant.Staphylococcus aureus［J］.Int J Anticicrob Agents，2004，24：161－167.

［8］Zhao X.Clarification of MPC and the mutant selection window concept［J］.Antimicrob Chemother，2003，52：731.

［9］Zhao X，Drlica K.Restricting the selection of antibiotic－resistant mutant bacteria：Ageneral strategy derived from fluoroquinolone studies［J］.Clin Infect Dis，2001，33（Suppl3）：S147.

［10］Allen GP，Kaatz W，Rybak MJ.Activities of mutant prevention concentration－targeted moxifloxacin and levofloxacin against Streptococcus pneumoniae in an in vitro pharmacodynamic model［J］.Antimicrob Agents Chemother，2003，47（8）：2606－2614.

［11］Baquero F.Resistance to quinolones in gram－negative microorganisms：－mechanisms and prevention［J］.Eur Urol，1990，17（suppl 1）：3－12.

［12］梁蓓蓓，安毛毛，蔡蕓，等.防耐藥突變體選擇濃度和耐藥突變選擇窗理論的研究進展［J］.中國藥物應(yīng)用與監(jiān)測，2008，5（4）：39－41.

［13］Drlica K.A strategy for fighting antibiotic resistance［J］.ASM News，2001；67：27－33.

［14］陳愉，張智潔，孫繼梅，等.四種氟喹諾酮類藥物對嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌防耐藥變異濃度的測定［J］.中國抗生素雜志，2006，3（14）：216－219.

［15］Lu T，Zhao X，Li X，et al.Effect of chloramphenicol，erythromycin，moxifloxacin，penicillin and tetracycline concentration on the recovery of resistant mutants of mycobacterium smegmatis and staphylococcus aureus［J］.Antimicrob Chemother，2003，52（1）：61－64.

［16］Linde HJ，Lehn N.Mutant prevention concentration of nalidixic acid，ciprofloxacin，clinafloxacin，levofloxacin，norfloxacin，ofloxacin，sparfloxacin or trovafloxacin for Escherichia coli under different growth conditions［J］.Antimicrob Chemother，2004，53（2）：252－257.

［17］梅清，喻婷，朱玉林，等.萬古霉素單用及聯(lián)合利福平或磷霉素對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌防耐藥突變濃度的研究［J］.中國藥理學通報，2011.27（7）：944－947.

［18］李艷.阿奇霉素對肺炎球菌的防耐藥突變濃度研究［J］.中國中醫(yī)藥現(xiàn)代遠程教育：2010（17）：262.