骨保護(hù)素的研究進(jìn)展

郭 元，諶倫杰 綜述，駱旭東 審校

（遵義醫(yī)學(xué)院，貴州 遵義563000）

骨保護(hù)素（osteoprotegerin，OPG）又稱護(hù)骨素、骨保護(hù)蛋白、破骨細(xì)胞生成抑制因子，是由Simonet等和日本研究人員同期發(fā)現(xiàn)的腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）受體超家族的新成員。OPG通過與核因子κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factorκB ligand，RANKL）競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合來阻斷RANKL與核因子κB受體活化因子（receptor activator of NF－κB，RANK）的結(jié)合來抑制破骨細(xì)胞（osteoclast，OC）的分化成熟并誘導(dǎo)OC的凋亡。OPG在骨形成和骨吸收的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)過程中起著重要作用，現(xiàn)將骨保護(hù)素的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 骨保護(hù)的發(fā)現(xiàn)與命名

骨保護(hù)素是1997年由Simonet等在對(duì)大鼠小腸cDNA分析測(cè)序時(shí)偶然發(fā)現(xiàn)的一種可溶性分泌型糖蛋白，是腫瘤壞死因子受體超家族的新成員，因其能抑制OC的分化、成熟、誘導(dǎo)OC的凋亡和增加骨密度，故被命名為OPG[1]。同年，日本研究人員從人成纖維細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)了破骨細(xì)胞生成抑制因子（osteoclastogenesis inhibitory factor，OCIF）。后來，其他學(xué)者發(fā)現(xiàn)了腫瘤壞死因子受體相關(guān)分子－1（TNFR－related molecule－1，TR－1）和濾泡樹突狀細(xì)胞受體－1（FDCR－1），后經(jīng)證實(shí) OPG、OCIF、TR－1和FDCR－1為同一組基因編碼的同一種物質(zhì)[2]。為了便于研究和交流，2000年美國(guó)骨礦研究協(xié)會(huì)（The American Society for Bone and Mineral Research，ASBMR）將這一物質(zhì)正式命名為OPG[3]。

2 骨保護(hù)素的結(jié)構(gòu)、分布

骨保護(hù)素（OPG）是一種可溶性分泌型糖蛋白，具有TNF受體超家族特征性的N端富含半胱氨酸區(qū)域。OPG分子由7個(gè)功能區(qū)（D1－D7），N端的D1－D4區(qū)與腫瘤壞死因子受體超家族的其他蛋白質(zhì)的細(xì)胞外區(qū)相似，參與配體的結(jié)合，與抑制OC的作用直接相關(guān)；靠近C端的D5、D6為死亡結(jié)構(gòu)域同源區(qū)，介導(dǎo)細(xì)胞毒性；D7具有一個(gè)肝素結(jié)合位點(diǎn)和一個(gè)半胱氨酸殘基，是同源二聚體的二硫鍵形成所必需的[4]。OPG基因編碼一段含有401個(gè)氨基酸殘基的前體蛋白質(zhì)，N末端21個(gè)氨基酸殘基裂解后成為成熟OPG。OPG蛋白結(jié)構(gòu)主要分為3部分：N端高度保守半胱氨酸富集域（cysteine rich domain，CRD）、C端肝磷脂結(jié)合位點(diǎn)以及中間2個(gè)死亡域同源區(qū)（death domain homologous，DDH）。三維結(jié)構(gòu)顯示CRD之間通過鏈內(nèi)及鏈間二硫鍵連接在一起，形成特殊配體結(jié)合域。CRD是OPG與配體結(jié)合主要作用域，OPG以110kD的同型二聚體的形式分泌至胞外，Cys185之前部分是OPG主要的功能域，執(zhí)行抑制OC的功能[5]。

OPG的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物共4種，長(zhǎng)度分別為2.4、4.2、6.5、3.0kb。其中2.4kb的mRNA為主要的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。OPG mRNA在人體多種組織和細(xì)胞系廣泛表達(dá)，在肺、心臟、腎、肝、胃腸、腦、脊髓、甲狀腺和骨表達(dá)最多，其中動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中表明以腎臟含量最多[6]，而造血系細(xì)胞及淋巴結(jié)中的含量相對(duì)較低，外周血淋巴細(xì)胞中則無表達(dá)。采用原位雜交方法證實(shí)：OPG高度表達(dá)于胎鼠發(fā)育骨組織的軟骨原基周圍。

3 OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)的生物學(xué)作用及其作用機(jī)制

3.1 OPG的生物學(xué)作用

OPG對(duì)骨的作用主要表現(xiàn)在OPG對(duì)OC的作用上即抑制OC的分化、活化成熟和誘導(dǎo)OC的凋亡。OPG作為假受體可以與RANK競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合RANKL，從而阻斷了OC的分化、活化成熟，來抑制OC的骨吸收功能。OC的活化作用主要是在RANK/RANKL結(jié)合后由TNF受體相關(guān)活化因子（TNF receptor－associated factors，TRAF）來使其活化，而OPG與RANKL結(jié)合后抑制了RANKL對(duì)TRAF6的激活作用，從而對(duì)OC的活化起到抑制作用[7]。OPG還能影響OC的存活，通過減少OC的數(shù)量來減少骨吸收。據(jù)有關(guān)實(shí)驗(yàn)表明在OC的培養(yǎng)過程中加入OPG能夠明顯減少OC的數(shù)量[8]，許勇等實(shí)驗(yàn)表明OPG基因敲除小鼠發(fā)生了高轉(zhuǎn)化型骨質(zhì)疏松[9]，這說明OPG在由OC所導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防和治療中發(fā)揮著極其重要的作用。

3.2 RANKL的生物學(xué)作用

人的RANKL是由40～45kD大的細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞膜黏附部分和分子量為30kD的從全長(zhǎng)裂解下來的可溶性部分組成，是含有317個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)[10]。它是一種缺乏信號(hào)肽的Ⅱ型跨膜蛋白。RANKL的mRNA在骨骼、骨髓以及淋巴組織中有較高的表達(dá)，其主要作用為刺激破骨細(xì)胞的分化和活化，抑制OC的凋亡。Denosumab是針對(duì)RANKL的單克隆抗體，通過與RANKL特異性結(jié)合來阻斷其與RANK結(jié)合，阻斷對(duì)OC的活化，減少骨吸收，增加骨量[11]。在Mcclung MR等的Ⅲ期臨床試驗(yàn)中，Denosumab顯著的提高了絕經(jīng)后低骨量婦女的各個(gè)部位的骨密度，并更有效地降低骨轉(zhuǎn)換率[12]。

3.3 RANK的生物學(xué)作用

人的RANK是具有616個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，其中有28個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽，在N末端有一個(gè)細(xì)胞外基團(tuán)，有一個(gè)含21個(gè)氨基酸殘基的穿細(xì)胞膜基團(tuán)和一個(gè)383個(gè)氨基酸殘基的細(xì)胞內(nèi)C末端基團(tuán)[13]。RANK的mRNA在骨髓來源的OC前體和體內(nèi)的成熟OC中高度表達(dá)，主要包括OC前體細(xì)胞、T、B淋巴細(xì)胞，樹突狀細(xì)胞和成骨細(xì)胞（osteoblast，OB）。RANK在OC前體細(xì)胞和OB、基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞一細(xì)胞依賴式接觸時(shí)識(shí)別并結(jié)合RANKL，在OC分化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用。RANK基因敲除鼠缺乏OC，會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重石骨癥[14]。

3.4 OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)的作用機(jī)制

正常的成熟骨的代謝主要以骨重建的形式進(jìn)行，在骨重建的過程中OB和OC對(duì)骨的作用處于一種動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。在破骨細(xì)胞的分化、成熟的過程中，OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)發(fā)揮著極其重要的作用。當(dāng)刺激因素作用于OB/基質(zhì)細(xì)胞（stromal cell，SC），誘導(dǎo)其膜上表達(dá)RANKL分子，通過與OC前體細(xì)胞膜上RANK直接結(jié)合，將信號(hào)傳入前體細(xì)胞，通過激活核因子κB和c－Fos，JNK，c－Src以及絲氨酸－蘇氨酸激酶Akt/PKB途徑引起級(jí)聯(lián)瀑布反應(yīng)，使OC分化成熟；而OPG則由OB/SC旁分泌發(fā)揮作用，競(jìng)爭(zhēng)性與RANKL結(jié)合，封閉RANKL與RANK的結(jié)合，將抑制OC的分化、成熟。RANKL是可直接誘導(dǎo)OC分化的細(xì)胞因子并且可以提高NF－κB和c－Jun氨基末端蛋白激酶（JNK）的活性，其他細(xì)胞因子或激素都是直接或間接地通過RANKL與RANK或OPG的相互作用來影響OC分化與成熟的[15－17]。JNK、蛋白激酶C途徑與OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)的激活有關(guān)，但OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)的分泌、激活的確切機(jī)制目前尚未完全明確。

4 影響骨OPG表達(dá)的調(diào)控因素

OPG在體內(nèi)的表達(dá)受多種因素的調(diào)控，如1，25－（OH）2－D3、TGF－α、NO、TGF－β、IL－1β、17β－雌二醇（17β－E2）、IL－18、瘦素、及BMP－2血小板衍生生成因子（PDGF）、Ca2＋、雌激素、腎上腺素、甲狀旁腺激素（PTH）、前列腺素E2（PGE2）、ER拮抗物1CII182780、糖皮質(zhì)激素等。實(shí)驗(yàn)表明，PTH長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)刺激導(dǎo)致了OC的活動(dòng)加強(qiáng)，使骨吸收作用增加，導(dǎo)致骨量減少[17]。在體外培養(yǎng)條件下，雌激素可使OB株分泌的OPG增加3～4倍[19]。體內(nèi)的Ca2＋濃度可影響OPG的表達(dá)量。利用1，25（OH）2－D3影響Ca2＋離子通道的活動(dòng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生高濃度Ca2＋可使OPG的表達(dá)量顯著減少[20]。腎上腺素可抑制OB和骨髓基質(zhì)細(xì)胞中OPG達(dá)量，這種抑制效果24小時(shí)之后解除[21]。NO通過在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控OPG和RANKL的表達(dá)可顯著提高OPG的表達(dá)水平、降低RANKL的表達(dá)量，同時(shí)改變OPG/RANKL的比率，并促進(jìn)OB的合成。此外，NO還可抑制PTH和VitD誘導(dǎo)的OC的發(fā)生和分化[18]。

5 骨保護(hù)素與臨床疾病

5.1 骨保護(hù)素與骨質(zhì)疏松癥

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）是一種以骨量降低和骨組織微結(jié)構(gòu)破壞為特征，導(dǎo)致骨脆性增加和易于骨折的代謝性骨病。按病因分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩類。繼發(fā)性O(shè)P的原發(fā)病因明確，常由內(nèi)分泌代謝疾?。卓骸⒓着钥?、庫(kù)欣綜合征、1型糖尿病等）或全身性疾病引起。Ⅰ型原發(fā)性O(shè)P即絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松發(fā)生于絕經(jīng)后女性。Ⅱ型原發(fā)性O(shè)P即老年性O(shè)P見于老年人。

5.1.1 骨保護(hù)素與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥 骨質(zhì)疏松癥的主要發(fā)病機(jī)制是機(jī)體的骨重建失衡。人體骨骼是動(dòng)態(tài)的不斷變化的組織，循環(huán)重復(fù)著骨重建，正常情況下骨吸收與骨形成保持動(dòng)態(tài)平衡，絕經(jīng)后雌激素水平下降，IL－1（interleukine－1，IL－1）、IL－6（interleukine－6，IL－6）、TNF－α的基因表達(dá)增加，TGF－β合成減少，促進(jìn)OC的增殖、分化、融合，抑制其凋亡，使骨吸收增加，骨代謝偶聯(lián)失衡，從而導(dǎo)致了骨質(zhì)疏松[15]。Shimizu－lshiura等[23]給予去卵巢小鼠骨保護(hù)素，發(fā)現(xiàn)給藥組小鼠骨小梁明顯增加，而未給予骨保護(hù)素的去卵巢小鼠的骨小梁減少。張紅菊等[24]研究表明雌激素對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者的骨密度有明顯改善，可能是通過上調(diào)血清OPG，從而抑制RANKL水平來發(fā)揮作用。雌激素可以下調(diào)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者外周血單核細(xì)胞中OPG mRNA的表達(dá)，并使血清OPG水平降低，而且OPG mRNA的變化與骨密度的變化相關(guān)[25]。Bekker等[26]報(bào)道重組的OPG（Fc－OPG融合分子）可以抑制絕經(jīng)后婦女的骨吸收過程，可以治療絕經(jīng)后婦女的骨質(zhì)疏松。體外試驗(yàn)中雌激素可增加OPG的表達(dá)，但在對(duì)絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松與血清OPG/RANKL水平關(guān)系的研究中，多個(gè)實(shí)驗(yàn)顯示出矛盾的結(jié)果[27]。

5.1.2 骨保護(hù)素與老年性骨質(zhì)疏松癥 老年性骨質(zhì)疏松是一種與年齡有關(guān)的骨質(zhì)疏松，骨重建功能減退是老年骨質(zhì)疏松癥發(fā)病的主要原因，成骨細(xì)胞的功能與活性缺陷導(dǎo)致了骨形成不足和骨丟失。老年性骨質(zhì)疏松屬于低轉(zhuǎn)化型，導(dǎo)致其骨丟失的重要原因之一就是OPG mRNA表達(dá)量減少和RANKL mRNA的表達(dá)增加[28]。

5.2 骨保護(hù)素與免疫性骨關(guān)節(jié)損害

OPGL是聯(lián)系免疫系統(tǒng)和骨代謝的主要橋梁，OPGL通過與RANK結(jié)合來對(duì)免疫系統(tǒng)與骨代謝進(jìn)行調(diào)節(jié)。在免疫性骨關(guān)節(jié)損害過程中，全身和局部OPGL的表達(dá)均增加。Gravallese等[29]的研究表明，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)腔內(nèi)，除局部浸潤(rùn)的激活T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生OPGL外，滑液細(xì)胞也大量表達(dá)OPGL。樊秋貴等[30]研究表明RA患者血清、滑膜液中OPG水平降低，RANKL、RANK、IL－1和PGE2水平升高。推測(cè)上述細(xì)胞因子參與RA發(fā)病過程。牛紅青等[31]研究表明RA患者血清OPG水平明顯增高，并且與患者的年齡、功能狀態(tài)相關(guān)，與疾病活動(dòng)無明顯相關(guān)關(guān)系；血清OPG水平與自身抗體RF、抗－CCP抗體、ANA相關(guān)，OPG參與了RA疾病的發(fā)生發(fā)展過程?？拙S萍等[32]研究表明強(qiáng)直性脊柱炎（AS）患者比健康對(duì)照組更易出現(xiàn)骨質(zhì)疏松和骨量減少，AS患者的骨吸收增強(qiáng)，血清OPG水平增高，其增高原因可能是機(jī)體對(duì)抗過度骨吸收的保護(hù)性反應(yīng)。

5.3 骨保護(hù)素與人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后的假體松動(dòng)

人工關(guān)節(jié)置換作為治療骨關(guān)節(jié)疾病主要方法，然而關(guān)節(jié)置換術(shù)后發(fā)生的假體松動(dòng)嚴(yán)重影響了關(guān)節(jié)置換的長(zhǎng)期療效。隨著對(duì)人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后假體松動(dòng)研究的深入，其致病因素也從單純的假體與骨界面嵌合欠佳、假體安裝位置和假體質(zhì)量等轉(zhuǎn)移到了生物學(xué)反應(yīng)上來。現(xiàn)代研究表明，破骨細(xì)胞性骨溶解在人工關(guān)節(jié)假體松動(dòng)中有著重要作用。在長(zhǎng)期磨損過程中，假體周圍不斷產(chǎn)生大量的磨損顆粒并引發(fā)生物反應(yīng)導(dǎo)致假體周圍骨溶解。在骨溶解的過程中伴發(fā)著假膜的形成，假膜在磨損顆粒的刺激下產(chǎn)生大量PGE2、IL－1β、IL－6、TNF－α等細(xì)胞因子并刺激破骨細(xì)胞的骨吸收作用，最終導(dǎo)致人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后的假體松動(dòng)。

5.4 骨保護(hù)素與骨硬化癥

骨硬化癥是一種以O(shè)C形成和骨吸收減弱為特征的多基因遺傳性疾病。OPG轉(zhuǎn)基因鼠、RANKL基因敲除鼠均表現(xiàn)嚴(yán)重的骨硬化，提示骨硬化癥可能與OPG和/或RANKL有關(guān)[33]。

5.5 骨保護(hù)素與骨科腫瘤和腫瘤骨轉(zhuǎn)移

目前認(rèn)為腫瘤轉(zhuǎn)移引起的溶骨性破壞是由于腫瘤細(xì)胞直接或間接激活OC的分化及成熟造成[34]。Giuliani等[35]體外研究發(fā)現(xiàn)，骨髓瘤細(xì)胞的骨髓浸潤(rùn)區(qū)OPG抗體染色率顯著降低，且在骨髓瘤細(xì)胞中探測(cè)不到OPG和OPG mRNA。曹旭等[36]研究發(fā)現(xiàn)漿細(xì)胞骨髓瘤中RANKL表達(dá)明顯高于正常骨髓，OPG表達(dá)明顯低于正常骨髓。趙雪志等[37]研究發(fā)現(xiàn)前列腺癌患者的血清OPG明顯高于前列腺增生患者。張帆等[38]研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞致骨轉(zhuǎn)移能力與其OPG表達(dá)水平密切相關(guān)，抑制OPG表達(dá)可以降低乳腺癌細(xì)胞致骨轉(zhuǎn)移的能力。殷金蘭等[39]發(fā)現(xiàn)肺癌患者血清OPG水平顯著高于對(duì)照組，肺癌骨轉(zhuǎn)移組高于肺癌骨未轉(zhuǎn)移組。血清OPG水平可作為肺癌患者鑒別診斷的有效指標(biāo)。

5.6 骨保護(hù)素與心血管疾病

OPG可在內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生，通過自分泌和旁分泌作用對(duì)血管起保護(hù)作用。OPG通過以下幾個(gè)方面來對(duì)抗動(dòng)脈鈣化和預(yù)防腦血管疾病的發(fā)生。其一、OPG是通過提高內(nèi)皮存活來防止炎癥細(xì)胞因子的血管損害作用的[40]；其二、OPG作為內(nèi)皮細(xì)胞的一種抗凋亡因子，在正常的血管壁及早期動(dòng)脈粥樣硬化的部位有免疫活性[41]；最后OPG還可以抑制破骨細(xì)胞的活性來抑制骨吸收降低血清Ca2＋水平，拮抗動(dòng)脈硬化的發(fā)生、降低心腦血管疾病的發(fā)生。表明OPG在心血管疾病的發(fā)病機(jī)制中有重要的作用。郭盛錦通過臨床研究表明血漿OPG濃度是心肌梗死后早期心血管事件的預(yù)測(cè)因子，并可評(píng)價(jià)心肌梗死不同治療方法的效果[42]。

6 重組人骨保護(hù)素（rhOPG）基因工程藥物的國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀

目前國(guó)外研發(fā)的重組骨保護(hù)素融合蛋白（rhOPG－Fc）藥物處于臨床前研究，是利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞CHO細(xì)胞表達(dá)并純化，與OPG相比，具有更高的穩(wěn)定性，而且在體內(nèi)的半衰期更長(zhǎng)[43]，但其生產(chǎn)過程復(fù)雜且成本較高。2003年劉繼中等報(bào)道了在小鼠成肌細(xì)胞C2C12中穩(wěn)定地共表達(dá)了人骨形成蛋白－2和骨保護(hù)素[44]。孟凡星等[45]報(bào)道了人骨保護(hù)素（OPG）基因在非洲綠猴腎COS7細(xì)胞內(nèi)初步瞬時(shí)表達(dá)，但細(xì)胞獲得DNA后暫時(shí)表達(dá)基因后數(shù)天到數(shù)周，最終消失。并且轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞后的幾天內(nèi)OPG呈基礎(chǔ)表達(dá)，OPG的表達(dá)水平并未達(dá)到COS7細(xì)胞的經(jīng)典表達(dá)水平（1～10μg·mL－1）DNA在細(xì)胞內(nèi)被降解。2009～2011年，劉俊麗等相繼報(bào)道了重組人骨保護(hù)素片段OPG與人血清白蛋白在畢赤酵母中的融合表達(dá)，但所獲得的蛋白在畢赤酵母培養(yǎng)過程中出現(xiàn)降解現(xiàn)象，蛋白的穩(wěn)定性較差[46－47]。

7 小結(jié)與展望

骨保護(hù)素通過影響OC的分化、成熟和凋亡在骨形成和骨吸收中發(fā)揮著主要作用，并且在其他疾病的發(fā)病、預(yù)防和治療中發(fā)揮著重要作用。但目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于重組人骨保護(hù)素藥物的開發(fā)研究均處于實(shí)驗(yàn)研究階段，并無成熟產(chǎn)品上市。隨著對(duì)OPG的深入研究和分子生物學(xué)的發(fā)展，理想的OPG藥物可能會(huì)研發(fā)出來。

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