視網(wǎng)膜光化學(xué)損傷機(jī)制的研究進(jìn)展

郭 星 綜述 梅 妍 審校

（昆明醫(yī)科大學(xué)，云南省第一人民醫(yī)院眼科，昆明 650032）

視網(wǎng)膜光損傷的概念早在柏拉圖時(shí)代就提出，直到1966 年Noell等才開(kāi)始實(shí)驗(yàn)室研究［1］。近年來(lái)，隨著眼科光學(xué)診療器械和顯微手術(shù)應(yīng)用的增多，各種器械光源所致視網(wǎng)膜損傷等問(wèn)題越來(lái)越引起人們的重視。臨床上一些常見(jiàn)的視網(wǎng)膜變性疾病如年齡相關(guān)性黃斑變性（ARMD）、視網(wǎng)膜色素變性（RP）等與視網(wǎng)膜光損傷有相似的病理過(guò)程，因此視網(wǎng)膜光損傷及其損傷防御機(jī)制的研究是近年眼科領(lǐng)域的一個(gè)重要研究課題。

視網(wǎng)膜光損傷的表現(xiàn)主要累及視網(wǎng)膜的光感受器細(xì)胞和色素上皮細(xì)胞。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［2－4］，光照后6h就已經(jīng)出現(xiàn)眼內(nèi)外節(jié)結(jié)構(gòu)紊亂及淡染區(qū)，隨后由于光感受器細(xì)胞的壞死而導(dǎo)致外核層、色素上皮細(xì)胞層細(xì)胞數(shù)減少，厚度變薄。光照后7d，由于壞死細(xì)胞大部分被吸收，外核層損傷加重，表現(xiàn)為細(xì)胞排列紊亂，部分消失及空泡出現(xiàn)，核層進(jìn)一步變薄，僅留3～5層。

Wenzel等實(shí)驗(yàn)證明高強(qiáng)度的光照可引起視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞的凋亡，加快年齡相關(guān)性黃斑變性、遺傳性視網(wǎng)膜色素變性等相關(guān)疾病的進(jìn)展［5］。Gavrieli等采用TUNEL技術(shù)可特異性在細(xì)胞水平原位顯示凋亡細(xì)胞斷裂的DNA 鏈，從而可在光鏡下識(shí)別凋亡細(xì)胞［6］。研究者通過(guò)對(duì)光照后視網(wǎng)膜細(xì)胞DNA 的抽取，凝膠電泳后，發(fā)現(xiàn)存在180bp的DNA片段，說(shuō)明光損傷時(shí)啟動(dòng)了視網(wǎng)膜細(xì)胞的凋亡［7］。近年國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者進(jìn)行了大量的研究，但關(guān)于視網(wǎng)膜光損傷的機(jī)制尚不十分清楚。比較一致的觀點(diǎn)是：視網(wǎng)膜光損傷有三種類型，即熱損傷、機(jī)械損傷和光化學(xué)損傷［8－9］，其中光化學(xué)損傷是視網(wǎng)膜光損傷中最主要、最普遍的一種損傷?，F(xiàn)就其機(jī)制做一綜述。

1 自由基機(jī)制和氧化損傷

正常情況下，視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞、桿狀細(xì)胞、錐體細(xì)胞處在一個(gè)高張氧環(huán)境中，而且感光細(xì)胞外節(jié)盤膜中含有高水平的長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸－二十二碳六烯酸，其對(duì)感光細(xì)胞具有保護(hù)作用，但對(duì)過(guò)氧化反應(yīng)很敏感。在視網(wǎng)膜退行性變及老年性黃斑變性發(fā)病過(guò)程中，慢性持續(xù)的光損傷會(huì)使眼內(nèi)自由基的濃度增加，并且打破了原有的生理平衡［10］。研究表明適當(dāng)頻率的光子和氧分子在視網(wǎng)膜外層的結(jié)合可促發(fā)光動(dòng)力反應(yīng)，產(chǎn)生單線態(tài)氧、過(guò)氧化氫及羥基自由基等一系列自由基，這些自由基除對(duì)蛋白質(zhì)及核酸造成損傷外，還能作用于感光細(xì)胞－色素上皮復(fù)合體的盤膜以及線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的多價(jià)不飽和脂肪酸，使其發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)，從而導(dǎo)致感光細(xì)胞外段解體、內(nèi)節(jié)線粒體腫脹變性，呼吸鏈生理功能也隨之降低。此外，脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物中的醛類化合物也有細(xì)胞毒性，如丙二醛可作為交聯(lián)劑與蛋白質(zhì)、核酸等含氮化合物反應(yīng)，之發(fā)生交聯(lián)而喪失功能［11］。

2 鈣離子的作用

Li等在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，如果在光照前同時(shí)給予自由基清除劑二甲基硫脲（DMTU）和鈣離子阻滯劑氟桂利嗪（flunarzine），光照后視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞、感光細(xì)胞的形態(tài)較單用其中一種藥物時(shí)保存得更加完整，且感光細(xì)胞外節(jié)的視紫紅質(zhì)水平也較對(duì)照組為高。因?yàn)閷?shí)驗(yàn)中所用的DMTU 已達(dá)到飽和劑量，故Li等推測(cè)細(xì)胞內(nèi)Ca2＋水平的增高和自由基的形成是導(dǎo)致視網(wǎng)膜光損傷的兩個(gè)不同的機(jī)制［12］。關(guān)于Ca2＋損傷感光細(xì)胞的機(jī)制，目前認(rèn)為其濃度的增高可激活Ca2＋依賴的一些與凋亡有關(guān)的酶，而導(dǎo)致視網(wǎng)膜細(xì)胞發(fā)生凋亡［7］。其次，過(guò)多的Ca2＋還促使黃嘌呤脫氫酶轉(zhuǎn)變成黃嘌呤氧化酶，導(dǎo)致氧自由基的形成，氧自由基引起的脂質(zhì)過(guò)氧化又可造成大量的鈣內(nèi)流，進(jìn)一步加重光損傷的程度。

3 眼部色素與視網(wǎng)膜損傷

黑色素和脂褐素是眼色素膜（脈絡(luò)膜、睫狀體和虹膜）及視網(wǎng)膜色素上皮（RPE）中常見(jiàn)的兩種顆粒狀物質(zhì)。黑色素可吸收大量的可見(jiàn)光，對(duì)眼有一定的保護(hù)作用。此外，黑色素還可結(jié)合具有氧化還原活性的重金屬離子如Fe2＋，螯合狀態(tài)的金屬離子可減少對(duì)色素上皮的損傷［13］。但也有研究表明黑色素在長(zhǎng)期的強(qiáng)光照射下能將氧分子還原成超氧陰離子和過(guò)氧化氫，對(duì)眼產(chǎn)生光毒性反應(yīng)。

脂褐素（1ipofuscin，LF）在色素上皮中的含量?jī)H次于黑色素，它是RPE 細(xì)胞吞噬和消化桿細(xì)胞、錐細(xì)胞外節(jié)的殘留物。脂褐素能產(chǎn)生熒光物質(zhì)，是視網(wǎng)膜中主要的生色團(tuán)，在有氧的條件下，它可激發(fā)細(xì)胞色素C的光還原作用產(chǎn)生單線態(tài)氧、超氧陰離子和過(guò)氧化氫等活性氧來(lái)?yè)p傷組織［14－15］。LF 的光敏反應(yīng)還可導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化，使丙二醛等細(xì)胞毒性物質(zhì)含量增加［14］。因此，LF 作為一個(gè)潛在的光敏分子，增加了視網(wǎng)膜光損傷的危險(xiǎn)性?，F(xiàn)已證實(shí)［15］，LF的不斷累積與年齡相關(guān)性黃斑變性中視網(wǎng)膜色素上皮的破壞有密切關(guān)系。

4 Müller細(xì)胞與神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的作用

實(shí)驗(yàn)表明將腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子－3（NT－3）、睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（CNTF）、神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）等注入玻璃體腔中可明顯延緩遺傳性和光導(dǎo)致的視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的變性壞死，但正常視網(wǎng)膜光感受器上并不存在此類神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體［16］，上述因子的作用機(jī)制被認(rèn)為是通過(guò)Müller細(xì)胞來(lái)發(fā)揮作用［17］。Müller細(xì)胞是存在于內(nèi)核層中的一種視網(wǎng)膜特有的膠質(zhì)細(xì)胞，在視網(wǎng)膜中發(fā)揮支持、營(yíng)養(yǎng)、絕緣和保護(hù)等重要作用。光致視網(wǎng)膜變性可上調(diào)Müller 細(xì)胞表面的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子p75（p75NTR）［18］和酪 氨酸激 酶受體C（Trk C）［19］水平。張純等［20］觀察大鼠視網(wǎng)膜光損傷后Müller細(xì)胞增殖，表明Müller細(xì)胞參與了光損傷性視網(wǎng)膜變性。

5 凋亡在視網(wǎng)膜光損傷中的作用

細(xì)胞凋亡不但參與了視網(wǎng)膜形態(tài)發(fā)生和組織重建［21］，同時(shí)也存在于多種視網(wǎng)膜病理過(guò)程中［22］。有研究表明，在各種遺傳性視網(wǎng)膜色素變性和光致視網(wǎng)膜損傷中，凋亡是感光細(xì)胞和色素上皮細(xì)胞丟失的主要機(jī)制［23］。目前，在視網(wǎng)膜光損傷中可能具有調(diào)控細(xì)胞凋亡作用的基因有以下幾種：

5.1 p53

p53是一種腫瘤抑制基因，它定位于人類染色體17P13.1。其產(chǎn)物p53 蛋白主要功能是感受DNA 或其它形式的細(xì)胞損傷信號(hào)，從而決定細(xì)胞在G1／S期生長(zhǎng)停滯抑或引起凋亡。Marti［24］等將暗適應(yīng)的野生型p53（＋／＋）和基因敲除p53（－／－）小鼠置于8500～15000lux的白光下照射2h 后，兩組動(dòng)物在形態(tài)、組織化學(xué)和視網(wǎng)膜電流圖（ERG）方面得到相同的變化：光鏡下可見(jiàn)到兩者外核層的感光細(xì)胞濃縮深染；TUNEL 染色能檢測(cè)到大量的陽(yáng)性細(xì)胞核存在；凝膠電泳顯示有典型的DNA 梯帶出現(xiàn)，ERG 的a、b、c波幅和振蕩電位亦都明顯下降。而在未受光照的p53（＋／＋）和p53（－／－）對(duì)照組中，兩者感光細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能也不存在顯著性差別。結(jié)果表明p53的缺失并不影響正常的視網(wǎng)膜功能，光導(dǎo)致的感光細(xì)胞凋亡也不依賴于功能性p53的存在。Lansel［25］等在對(duì)正常的和p53缺失的C57BL／6J小鼠實(shí)驗(yàn)中也證實(shí)了上述結(jié)果。

5.2 bcl－2家族

bcl－2是Tsujimoto等從伴有t（14，18）染色體易位的濾泡狀B 細(xì)胞淋巴瘤中發(fā)現(xiàn)的，定位于18q2l，它的表達(dá)可增加細(xì)胞對(duì)多重促凋亡因素的抗性，抑制多種因素造成的神經(jīng)細(xì)胞凋亡［26］。1993年Boise發(fā)現(xiàn)與bcl－2功能相同的bcl－XL基因［7］。Chen［27］等將鼠視蛋白基因5′－ 側(cè)翼區(qū)的啟動(dòng)子序列與人的bcl－2cDNA 融合，構(gòu)建在感光細(xì)胞中可過(guò)度表達(dá)bcl－2的轉(zhuǎn)基因鼠模型，發(fā)現(xiàn)bcl－2不但能阻止由視紫紅質(zhì)及桿體細(xì)胞cGMP 磷酸二脂酶基因缺陷造成的遺傳性視網(wǎng)膜變性，而且還可降低強(qiáng)光照射下感光細(xì)胞凋亡的發(fā)生率。他認(rèn)為感光細(xì)胞中高表達(dá)的bcl－2較正常內(nèi)源水平的bcl－2更能有效地抑制各種視網(wǎng)膜變性中凋亡的發(fā)生。

但也有相反的報(bào)道，Joseph［28］將感光細(xì)胞中表達(dá)有bcl－2及同源蛋白bcl－XL的轉(zhuǎn)基因鼠分別與攜有rd／rd基因突變的小鼠或顯性視紫紅質(zhì)基因突變小鼠雜交，組織學(xué)和ERG 的結(jié)果表明bcl－2和bcl－XL 的過(guò)量表達(dá)并不能阻止上述兩種鼠中感光細(xì)胞的變性，原位末斷標(biāo)記也顯示有凋亡相關(guān)的DNA片段形成。但在強(qiáng)光照射2h 后，bcl－2轉(zhuǎn)基因鼠的視網(wǎng)膜中央?yún)^(qū)域保留有大約4 行感光細(xì)胞，而bcl－XL轉(zhuǎn)基因鼠和同窩正常的未轉(zhuǎn)基因鼠未顯示出對(duì)光的抵抗性，其感光細(xì)胞被全部破壞。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)bcl－2轉(zhuǎn)基因鼠中有視紫紅質(zhì)含量的下降，而這在bcl－XL小鼠中沒(méi)有見(jiàn)到，因此他認(rèn)為bcl－2 和bcl－XL 的大量表達(dá)并不能阻止這兩種基因突變?cè)斐傻母泄饧?xì)胞凋亡，而bcl－2轉(zhuǎn)基因小鼠對(duì)光損傷所具有的抵抗力來(lái)源于視紫紅質(zhì)含量的降低，并非是bcl－2的抗凋亡作用，在遺傳和外界物理因素導(dǎo)致的感光細(xì)胞凋亡中并不存在bcl－2的調(diào)控。

5.3 c－fos

原癌基因c－fos也已發(fā)現(xiàn)有誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用［29］。其編碼的產(chǎn)物c－Fos蛋白是轉(zhuǎn)錄因子活化蛋白－1（AP－1）復(fù)合體中的一員，AP－1參與調(diào)控視網(wǎng)膜中多種基因的表達(dá).最近的研究表明，c－Fos在光誘導(dǎo)的感光細(xì)胞凋亡中有必不可少的作用。Hafezi［23］等將c－fos基因敲除的小鼠c－fos（－／－）和野生型小鼠c－fos（＋／＋）同時(shí)暴露于5000lux的白光下2h后，發(fā)現(xiàn)c－fos（＋／＋）鼠有大量感光細(xì)胞凋亡，而c－fos（－／－）鼠的視網(wǎng)膜不受影響。因?yàn)閏－Fos在調(diào)節(jié)桿細(xì)胞特異性基因表達(dá)的過(guò)程中有重要作用，人們推測(cè)c－fos（－／－）鼠所表現(xiàn)的對(duì)凋亡的抗性可能與c－Fos功能缺失而導(dǎo)致小鼠視網(wǎng)膜感光細(xì)胞吸收光子及光轉(zhuǎn)導(dǎo)能力的下降有關(guān)。但是Kueng Hitz［30］等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)上述這兩種基因型小鼠的桿細(xì)胞有相同的光吸收能力，因此c－fos（－／－）小鼠對(duì)光誘導(dǎo)凋亡的抗性源于在凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)中c－Fos的缺乏，并不是由桿細(xì)胞正常生理功能下降所致.Poon［31］等使用組織化學(xué)法和TUNEL法分別同時(shí)標(biāo)記c－fos和DNA 斷端，結(jié)果顯示c－fos陽(yáng)性核與TUNEL 陽(yáng)性核相對(duì)應(yīng)，進(jìn)一步證明了cfos與光感受器細(xì)胞凋亡的關(guān)系?？偨Y(jié)視網(wǎng)膜光損傷是一多因素導(dǎo)致的病變，其發(fā)生機(jī)制已非常復(fù)雜，目前光學(xué)儀器在眼科的廣泛應(yīng)用，激光手術(shù)和白內(nèi)障摘除人工晶體植入手術(shù)的廣泛開(kāi)展開(kāi)展，醫(yī)源性光損傷越來(lái)越受到人們的重視。隨著視網(wǎng)膜光損傷機(jī)制研究的深入以及光誘導(dǎo)感光細(xì)胞凋亡過(guò)程中分子事件的日益明確，為其防治提供理論基礎(chǔ)，相信必將為臨床治療該類疾病提供更為有效的手段和措施。

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