Caspase家族與固有免疫關(guān)系研究進(jìn)展

余瑩華，徐志猛，曾 昊，倪榮興，李 萍

(中國(guó)藥科大學(xué)天然藥物活性組分與藥效國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210009)

病原體相關(guān)分子模式(PAMPs)和受損或死亡細(xì)胞釋放的損傷相關(guān)分子模式(DAMPs)可激活機(jī)體固有免疫系統(tǒng)，引發(fā)炎癥反應(yīng)。模式識(shí)別受體(PRRs)是機(jī)體固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分，主要在白細(xì)胞的細(xì)胞膜或胞漿中表達(dá)，識(shí)別PAMPs和DAMPs。目前已定義5個(gè)PRR家族，包括TOLL樣受體TLRs、RIG-I樣受體RLRs、C型凝集素受體CLRs、核苷酸結(jié)合寡聚化域樣受體NLRs、黑色素瘤缺乏因子2樣受體ALRs，其中來(lái)自NLRs和ALRs家族的蛋白可形成炎性小體[1]。炎性小體是2002年由Martinon等[2]共同命名的一種介導(dǎo)炎性Caspase激活的高相對(duì)分子質(zhì)量蛋白復(fù)合物。Caspase-1和Caspase-4/5/11可分別通過(guò)經(jīng)典炎性小體和非經(jīng)典炎性小體途徑被激活[2-3]。炎性Caspases另一成員Caspae-12主要定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)[4]，但其免疫調(diào)控機(jī)制仍不明確，有待進(jìn)一步研究。

與炎性Caspases不同，凋亡Caspases主要引發(fā)和執(zhí)行免疫沉默的細(xì)胞程序性死亡-細(xì)胞凋亡。以往研究認(rèn)為凋亡Caspases不參與固有免疫應(yīng)答過(guò)程，但近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)Caspase-8除引發(fā)細(xì)胞凋亡外，在固有免疫的調(diào)控過(guò)程中也不可或缺，既可通過(guò)NF-κB等途徑促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，也可通過(guò)抑制壞死性凋亡等途徑抑制固有免疫應(yīng)答[4-5]。

本文主要總結(jié)該家族近年來(lái)與固有免疫相關(guān)的Caspases-1/4/5/11/12及Caspase-8的研究進(jìn)展，以期為Caspases與固有免疫關(guān)系的進(jìn)一步研究及相關(guān)疾病的臨床治療提供一些參考。

1 Caspase家族的分類(lèi)和結(jié)構(gòu)

根據(jù)Caspases的功能，哺乳動(dòng)物Caspases從廣義上被分為兩類(lèi)：炎性Caspases和凋亡Caspases。炎性Caspases包括Caspase-1、Caspase-4、Caspase-5、Caspase-11和Caspase-12。其中人類(lèi)基因組編碼Caspase-1、Caspase-4、Caspase-5、和Caspase-12，小鼠基因組編碼Caspase-1、Caspase-11、Caspase-12，人源Caspase-4/5和鼠源Caspase-11是同源物。凋亡Caspases主要分為凋亡起始Caspases和凋亡效應(yīng)Caspases。起始Caspases包括Caspase-2、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-10，效應(yīng)Caspases包括Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7。Caspases最初被合成為非活性單體酶原，只有在適當(dāng)?shù)拇碳は虏拍塬@得催化活性，其羧基端蛋白效應(yīng)域由一個(gè)大亞基和一個(gè)小亞基組成。Caspase-1/2/4/5/9/11/12還包含一個(gè)氨基末端Caspase激活和招募結(jié)構(gòu)域(CARD)，Capase-8/10包含兩個(gè)死亡效應(yīng)域(DED)，Caspase-3/6/7則只有一個(gè)較短的前體蛋白結(jié)構(gòu)域。Caspase-12有全長(zhǎng)和縮短兩種亞型，人類(lèi)基因組既可編碼有活性的全長(zhǎng)亞型，也可編碼無(wú)活性的縮短亞型，小鼠和大鼠基因組則只編碼全長(zhǎng)亞型[4,6]。人和小鼠的Caspases的分類(lèi)和結(jié)構(gòu)如表1所示。

Table1 Classification and structure of human and mouse Caspases[4,6]

ClassificationCaspasesGenomiclocationHumanMouseDomainstructureInflammatoryCaspase-111q239A1CARD-L-SCaspase-411q22.2-11q22.3AbsentCARD-L-SCaspase-511q22.2-11q22.3AbsentCARD-L-SCaspase-11Absent9A1CARD-L-SCaspase-1211q22.39A1CARD-L-SCaspase-12?11q22.3AbsentCARD-LInitiatorCaspase-27q34-7q356B2.1CARD-L-SCaspase-91p36.214E1CARD-L-SCaspase-82q33-2q341BDED-DED-L-SCaspase-102q33-2q34AbsentDED-DED-L-SEffectorCaspase-34q348B1.1L-SCaspase-64q253H1L-SCaspase-710q2519D2L-SOtherCaspase-1419p13.110C1L-SCaspase-1616p13.317A3.3L-S

2 Caspase-1與固有免疫關(guān)系研究進(jìn)展

Caspase-1主要通過(guò)經(jīng)典炎性小體途徑被激活[1]。經(jīng)典炎性小體是由NLRs或ALRs、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白ASC、Caspase-1三部分組成的多聚體復(fù)合物，通過(guò)調(diào)控Caspase-1活化介導(dǎo)IL-1β/IL-18的成熟釋放和細(xì)胞焦亡[7-8]。已有研究表明，NLRP1[9]、NLRP2[10]、NLRP3[11]、NLRC4[12-13]、NLRP6[14-15]、NLRP9b[16]、Pyrin[17-18]和AIM2[19]、IFI16[20]等參與體內(nèi)外Caspase-1炎性小體的形成。這些經(jīng)典炎性小體的激活劑及受體結(jié)構(gòu)如表2所示。

Table2 Activators and receptor structure of Caspase-1 inflammasome[1]

ActivatorReceptor StructureBacillusanthracistoxinNLRP1N-PYD-NACHT-LRRs(6)-FIND-CARD-CExtracellularATPNLRP2N-PYD-NACHT-LRRs(8)-CExtracellularATP/crystals/Pore-formingtoxinsNLRP3N-PYD-NACHT-LRRs(9)-CFlagellinNLRC4N-CARD-NACHT-LRRs(12)-CGutmetabolitesandlipoteichoicacidNLRP6N-PYD-NACHT-LRRs(5)-CdsRNA(rotavirus)NLRP9bN-PYD-NACHT-LRRs(7)-CdsDNAAIM2N-PYD-HIN200-CdsDNAIFI16N-PYD-HIN200-HIN200-CC.difficiletoxinsPyrinN-PYD-(B-boxorcoli-coli)-PRY-SPRY-C

2.1 NLRP3炎性小體

NLRP3炎性小體是現(xiàn)階段研究最廣泛的一種經(jīng)典炎癥小體，由NLRP3受體、銜接蛋白ASC、效應(yīng)蛋白Caspase-1組裝而成。其中NLRP3受體由核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域(NOD/NACHT)、亮氨酸重復(fù)序列(LRR)、熱蛋白結(jié)構(gòu)域(PYD)3部分構(gòu)成。該受體中央結(jié)構(gòu)域NACHT含有ATPase活性，對(duì)核酸結(jié)合和自我寡聚化非常重要，LRR作為高度保守的氨基酸序列，主要用于識(shí)別配體[1,21]。銜接蛋白ASC含有PYD和CARD兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，當(dāng)NLRP3受到相應(yīng)刺激被激活時(shí)，ASC通過(guò)PYD結(jié)構(gòu)域與NLRP3同型結(jié)合，同時(shí)通過(guò)CARD結(jié)構(gòu)域招募并活化Caspase-1，完成炎性小體組裝和活化[2]。NLRP3的激活通常需要兩個(gè)過(guò)程：預(yù)處理過(guò)程和活化過(guò)程。預(yù)處理過(guò)程主要通過(guò)TLRs激活NF-κB信號(hào)通路，誘導(dǎo)IL-1β、IL-18等炎性因子及NLRP3炎性小體相關(guān)基因的表達(dá)[22]?；罨^(guò)程包括炎性小體的組裝和Caspase-1的活化，主要由細(xì)胞外ATP、淀粉樣蛋白-β、活性氧、二氧化硅、膽固醇晶體、病原微生物等活化信號(hào)介導(dǎo)[1]。對(duì)NLRP3炎性小體進(jìn)行體內(nèi)外活性鑒定時(shí)，除了證明其相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)外，更重要的是檢測(cè)Caspase-1、IL-1β、IL-18、GSDMD剪切體等代表蛋白酶水解活性的指標(biāo)及顯微鏡下可見(jiàn)的由NLR、ASC、Caspae-1 3部分寡聚化進(jìn)行的炎性小體組裝。

目前比較公認(rèn)的NLRP3的激活機(jī)制主要有3種。(1)鉀離子外流：多種活化信號(hào)激活NLRP3時(shí)均伴隨鉀離子外流，如細(xì)胞外ATP可激活P2X7嘌呤受體，誘導(dǎo)鉀離子通道開(kāi)放，導(dǎo)致胞內(nèi)鉀離子外流[23]。鉀離子外流后，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶NEK7可與亮氨酸重復(fù)序列LRR結(jié)合，從而激活NLRP3炎性小體[24]。(2)線粒體事件：線粒體產(chǎn)生的活性氧可能通過(guò)與硫氧還蛋白相互作用蛋白(TXNIP)結(jié)合激活NLRP3[25]。泄露至胞內(nèi)的線粒體DNA也可通過(guò)核酸轉(zhuǎn)移酶(cGAS)-干擾素刺激基因(STING)途徑激活NLRP3炎癥小體[26]。(3)溶酶體破裂：當(dāng)較大顆粒的尿酸鹽結(jié)晶或草酸鹽結(jié)晶通過(guò)胞吞作用進(jìn)入胞內(nèi)時(shí)，可引起溶酶體破裂，組織蛋白酶釋放到胞質(zhì)中，導(dǎo)致NLRP3炎癥小體活化[1,27]。和識(shí)別限定配體的模式識(shí)別受體不同，NLRP3炎性小體的主要功能是感知細(xì)胞或組織的穩(wěn)態(tài)變化。

2.2 其他NLR炎性小體

2013年，Minkiewicz等[10]發(fā)現(xiàn)人類(lèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞可表達(dá)NLRP2炎性小體，該炎性小體可被ATP激活，誘導(dǎo)Caspase-1和IL-1β剪切。NLRP2可與嘌呤受體P2X7及pannexin 1通道結(jié)合，使用P2X7抑制劑丙苯酸及pannexin 1通道拮抗劑亮藍(lán)G均可抑制ATP誘導(dǎo)的NLRP2炎性小體的激活。此項(xiàng)研究結(jié)果表明NLRP2是中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥應(yīng)答的一個(gè)重要組成部分，也許是中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病炎癥治療的一個(gè)潛在靶標(biāo)。NLRC4主要感知細(xì)菌的鞭毛蛋白(flagellin)和保守型Ⅲ型分泌系統(tǒng)(TTSS)桿組件，正常情況下處于自抑制的靜息狀態(tài)，病原菌成分進(jìn)入胞內(nèi)時(shí)，可被另一類(lèi)NLR蛋白NAIP亞家族蛋白識(shí)別并激活，活化的NLRC4發(fā)生自身寡聚化并招募Caspase-1，形成炎癥小體[12]。革蘭陽(yáng)性菌產(chǎn)生的脂磷壁酸(LTA)可結(jié)合并激活NLRP6炎性小體。與LTA結(jié)合后，NLRP6與ASC形成含有Caspase-11和Caspase-1的復(fù)合物，促進(jìn)IL-1β/IL-18成熟，加重感染[15]。輪狀病毒(Rotavirus)是幼兒患腹瀉及腸胃炎的一個(gè)主要誘導(dǎo)因素，具有很高的傳染性和潛在致命性。NLRP9b在小腸上皮細(xì)胞中特異性表達(dá)并且可抑制輪狀病毒Rotavirus感染。相關(guān)研究表明NLRP9b可通過(guò)解旋酶DHX9識(shí)別一些較短的雙鏈RNA，隨后與ASC和Caspase-1形成炎性小體，殺死被Rotavirus感染的細(xì)胞，阻止進(jìn)一步的感染[16]。與NLR家族其他成員不同，NLRP1含有FIIND結(jié)構(gòu)域，且其可激活C端的CARD結(jié)構(gòu)域。致死因子LF處理NLRP1 后可水解其N(xiāo)端肽段，產(chǎn)生新的N末端。N端水解后的NLRP1蛋白呈現(xiàn)不穩(wěn)定性，可經(jīng)蛋白酶體途徑降解，游離出有活性的C端。這個(gè)活性片段包含CARD結(jié)構(gòu)域和FIIND的UPA亞結(jié)構(gòu)域，UPA-CARD沒(méi)有跟隨其全長(zhǎng)蛋白進(jìn)入蛋白酶體，而是通過(guò)CARD募集Caspase-1，實(shí)現(xiàn)炎癥小體的組裝與活化[28-30]。

2.3 dsDNA感知和pyrin炎性小體

2008年在巨噬細(xì)胞中鑒定了一個(gè)可感知胞質(zhì)DNA的炎性小體-AIM2炎性小體。AIM2由一個(gè)HIN200結(jié)構(gòu)域和一個(gè)PYD結(jié)構(gòu)域組成，可以非序列特異性的方式與雙鏈DNA結(jié)合，隨后招募ASC與Caspase-1，完成炎性小體組裝[19]。細(xì)胞溶質(zhì)細(xì)菌(包括分枝桿菌和圖拉菌)和病毒(如牛痘病毒和巨細(xì)胞病毒)及輻照暴露、化療和HIV天冬氨酸蛋白酶抑制劑治療等誘導(dǎo)的內(nèi)源性dsDNA均可被AIM2感知并激活炎癥小體[1,19]。干擾素誘導(dǎo)蛋白16(IFI16)包含一個(gè)PYD結(jié)構(gòu)域和兩個(gè)HIN200結(jié)構(gòu)域，可感知核內(nèi)的dsDNA。研究表明IFI16與Kaposi肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染的病毒DNA結(jié)合，被激活后形成炎性小體復(fù)合物[20]。2014年，邵峰研究組[17]發(fā)現(xiàn)Pyrin炎性體可以先天免疫感知細(xì)菌的Rho GTPases修飾，且其結(jié)果證實(shí)Pyrin可響應(yīng)艱難梭狀芽胞桿菌的主要毒力因子細(xì)胞毒素TcdB的Rho糖基化，從而介導(dǎo)Caspase-1炎性小體激活。研究人員隨后也證明洋蔥伯克霍爾德菌可通過(guò)使switch-I區(qū)域中的Asn 41脫酰胺化誘導(dǎo)RHOA失活，引發(fā)Pyrin炎性體激活。2016年，Xu等[18]進(jìn)一步證明RhoA可激活絲氨酸/蘇氨酸激酶PKN1和PKN2，活化的PKN1和PKN2與Pyrin結(jié)合并磷酸化Pyrin，磷酸化的Pyrin與14-3-3結(jié)合，14-3-3在這里作為一個(gè)分子開(kāi)關(guān)可抑制Pyrin炎性小體的活化。

3 Caspase-4/5/11與固有免疫關(guān)系研究進(jìn)展

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，Caspase-4/5/11是脂多糖(LPS)的胞內(nèi)受體，主要通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡介導(dǎo)機(jī)體固有免疫應(yīng)答[31]。GSDMD是細(xì)胞焦亡主要調(diào)控因子，被剪切后其氨基末端(GSDMD-NT)可插入細(xì)胞膜中引發(fā)細(xì)胞焦亡。GSDMD-NT對(duì)哺乳動(dòng)物內(nèi)質(zhì)膜小葉的磷脂酰肌醇磷酸鹽、磷脂酸和磷脂酰絲氨酸以及線粒體內(nèi)膜和細(xì)菌細(xì)胞壁中存在的心磷脂具有親和力。這些特性使GSDMD-NT能夠插入細(xì)菌或細(xì)胞膜并在其中產(chǎn)生小孔，從而在不影響細(xì)胞器和其他鄰近細(xì)胞的情況下引發(fā)細(xì)胞焦亡，發(fā)揮抗菌效應(yīng)[1,32]。適度的細(xì)胞焦亡對(duì)機(jī)體有益，但過(guò)度的焦亡應(yīng)答可造成機(jī)體器官損傷及死亡。近期研究表明，谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4(GPX4)可通過(guò)減少磷脂氫過(guò)氧化物負(fù)性調(diào)控GSDMD，從而抑制過(guò)度的細(xì)胞焦亡[31]。

革蘭陰性菌可產(chǎn)生外膜囊泡(OMV)，通過(guò)內(nèi)吞作用將LPS傳遞到宿主細(xì)胞的胞質(zhì)溶膠中[33]。Caspase-4/5/11由CARD、P20、P10三部分組成，其CARD結(jié)構(gòu)域可與胞內(nèi)LPS的脂質(zhì)A部分直接作用，誘導(dǎo)Caspase-4/5/11-LPS復(fù)合物寡聚化，形成有活性的Caspase-4/5/11非經(jīng)典炎性小體?；罨腃aspase-4/5/11非經(jīng)典炎性小體可在天冬氨酸276殘基位點(diǎn)剪切GSDMD，產(chǎn)生GSDMD的N端和C端結(jié)構(gòu)，N端結(jié)構(gòu)寡聚化插入細(xì)胞膜中形成小孔，引發(fā)細(xì)胞焦亡[34-35]。除此之外，活化的Caspase-4/5/11非經(jīng)典炎性小體還可誘導(dǎo)NLRP3的組裝與激活，隨后引發(fā)進(jìn)一步的細(xì)胞焦亡并誘導(dǎo)IL-1β和IL-18的成熟與釋放[36]。有研究發(fā)現(xiàn)，GSDMD的缺失可消除巨噬細(xì)胞中胞內(nèi)LPS誘導(dǎo)的NLRP3的激活，這一現(xiàn)象可能主要由GSDMD孔引發(fā)的鉀離子外流介導(dǎo)[31,36](具體過(guò)程如圖1所示)。2016年Zanoni等[37]發(fā)現(xiàn)樹(shù)突狀細(xì)胞中的氧化磷脂(oxPAPC)可在不介導(dǎo)細(xì)胞焦亡的情況下誘導(dǎo)Caspase-11依賴的IL-1β的釋放。但也有研究表明oxPAPC可競(jìng)爭(zhēng)性地抑制LPS與Caspase-11的結(jié)合及隨后的炎癥反應(yīng)[38]。

Figure1 Mechanism of Caspase-4/5/11-mediated inflammation

4 Capase-8與固有免疫關(guān)系研究進(jìn)展

越來(lái)越多研究表明Caspase-8在固有免疫的調(diào)控過(guò)程中發(fā)揮雙重作用。既可通過(guò)誘導(dǎo)炎性基因的表達(dá)[39]、剪切活化IL-1β[5]、誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡[40-41]等途徑促進(jìn)免疫反應(yīng)進(jìn)程，也可通過(guò)抑制炎性小體的激活[42]、壞死性凋亡[43]等途徑抑制機(jī)體固有免疫反應(yīng)。

4.1 Caspase-8對(duì)炎癥反應(yīng)的促進(jìn)作用

4.1.1 Caspase-8促進(jìn)IL-1β的成熟和釋放 近年來(lái)研究表明，除Caspase-1外，Caspase-8也可通過(guò)其酶活性直接剪切IL-1β前體，促進(jìn)IL-1β的成熟和釋放(如圖2所示)。2008年，Maelfait等[44]首次發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)TLR3和TRL4的一個(gè)共同銜接蛋白TRIF或用Poly(I∶C)和LPS分別刺激TLR3和TLR4均可誘導(dǎo)Caspase-8在ASP117位點(diǎn)直接剪切活化IL-1β。2015年，Moriwaki等[45]證明在LPS處理的BMDCs中，RIPK3對(duì)IL-1β的剪切活化至關(guān)重要，并且需要RIPK1、TRIF和FADD參與。據(jù)報(bào)道，促凋亡的刺激可導(dǎo)致線粒體功能紊亂，誘導(dǎo)第二線粒體衍生的半胱天冬酶激活劑(SMAC)從線粒體釋放。SMAC可抑制凋亡抑制蛋白(IAPs)，在巨噬細(xì)胞中敲除IAPs或使用SMAC類(lèi)似物處理IAPs后，RIPK3可被激活，介導(dǎo)Caspase-8和Caspase-1依賴的IL-1β的活化[4,46]。也有研究發(fā)現(xiàn)，在LPS處理的BMDCs中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑可促進(jìn)Caspase-8介導(dǎo)的IL-1β的剪切成熟[47]。FAS與FAS配體(FasL)的結(jié)合是另外一條介導(dǎo)Caspase-8直接剪切活化IL-1β的途徑。在此途徑中，銜接蛋白FADD招募Caspase-8與Fas結(jié)合，在成熟的IL-1β的產(chǎn)生過(guò)程中發(fā)揮重要作用[48-49]。在某些刺激下，Caspase-8也可通過(guò)組裝生物大分子介導(dǎo)IL-1β的剪切。例如在人類(lèi)樹(shù)突狀細(xì)胞識(shí)別某些真菌和分枝細(xì)菌感染時(shí)，Dectin-1和它的銜接蛋白SYK可促進(jìn)復(fù)合物CARD9-BCL-10-MALT1的形成，這個(gè)復(fù)合物一方面促進(jìn)IL-1β基因轉(zhuǎn)錄，另一方面招募ASC和Caspase-8，形成非經(jīng)典Caspase-8炎性小體，剪切活化IL-1β[50]。此外，也有一些研究表明Caspase-8可通過(guò)激活Caspase-1炎性小體間接產(chǎn)生具有生物活性的IL-1β[51]。

Figure2 Pathways of Caspase-8 directly processing IL-1β

4.1.2 Caspase-8介導(dǎo)炎性基因表達(dá)和細(xì)胞焦亡 Alexandra等[39]發(fā)現(xiàn)Caspase-8可促進(jìn)c-Rel依賴的炎性因子的表達(dá)。在LPS或CpG處理的骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞(BMDM)中，Caspase-8可上調(diào)IκB激酶IKK的磷酸化，使得IκBε亞基被泛素化修飾，隨后被蛋白酶體降解，解除對(duì)c-Rel的同源二聚體的抑制作用。之后Caspase-8可通過(guò)酶活性和支架功能共同促進(jìn)c-Rel核轉(zhuǎn)位，c-Rel入核后，被招募至Caspase-8依賴的基因啟動(dòng)子上，啟動(dòng)IL-1β、IL-1α、IL-12β等炎性基因的轉(zhuǎn)錄。該研究也發(fā)現(xiàn)Caspase-8對(duì)P65的核轉(zhuǎn)位沒(méi)有影響，表明Caspase-8對(duì)NF-κB家族成員的核轉(zhuǎn)位調(diào)控僅限于IκBε。近期也有研究表明，毒力蛋白YopJ通過(guò)抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子激酶1(TAK1)活性活化受體相互作用蛋白激酶RIP1和Caspase-8，活化的Caspase-8可通過(guò)切割GSDMD引發(fā)細(xì)胞焦亡[40-41]。

4.2 Caspase-8對(duì)炎癥反應(yīng)的抑制作用

4.2.1 Caspase-8抑制細(xì)胞壞死性凋亡 細(xì)胞壞死性凋亡(necroptosis)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種程序性細(xì)胞壞死。與凋亡不同，壞死性凋亡的特征是細(xì)胞體積增大、細(xì)胞器腫脹、細(xì)胞膜穿孔、隨后細(xì)胞崩解、釋放內(nèi)容物，引發(fā)先天和適應(yīng)性免疫應(yīng)答。壞死性凋亡依賴于受體相互作用絲氨酸/蘇氨酸激酶RIPK1和RIPK33對(duì)混合譜系激酶域樣蛋白MLKL的激活。在TNFR1配體誘導(dǎo)的壞死性凋亡中，去泛素化的RIPK1與RIPK3的RHIM結(jié)構(gòu)域同型結(jié)合，誘導(dǎo)RIPK3的多聚化與激活，進(jìn)一步激活MLKL。效應(yīng)蛋白MLKL被激活后，轉(zhuǎn)位到細(xì)胞質(zhì)膜上，誘導(dǎo)細(xì)胞破裂及死亡[52]。

已有研究表明，Caspase-8在引發(fā)細(xì)胞凋亡的同時(shí)可抑制壞死性凋亡。與此密切相關(guān)的一個(gè)復(fù)合物由Fas相關(guān)死亡域蛋白(FADD)，Caspase-8和FLICE樣抑制蛋白(cFLIP)組成。cFLIP是決定細(xì)胞命運(yùn)的一個(gè)開(kāi)關(guān)，根據(jù)轉(zhuǎn)錄后mRNA的剪接，以cFLIP long(cFLIPL)和cFLIP short(cFLIPS)兩種形式存在。cFLIPL處于低水平狀態(tài)時(shí)，Caspase-8可自剪切活化，引發(fā)細(xì)胞凋亡。同時(shí)去泛素化的RIPK1通過(guò)FADD的DD結(jié)構(gòu)域與FADD-proCaspase-8-cFLIPL復(fù)合物同型結(jié)合，并進(jìn)一步通過(guò)RHIM結(jié)構(gòu)域與RIPK3結(jié)合，形成新的復(fù)合物。Caspase-8可在多個(gè)位點(diǎn)剪切RIPK1和RIPK3，從而抑制MLKL活化及其介導(dǎo)的壞死性凋亡[43]。

4.2.2 Caspase-8抑制NLRP3炎癥小體及Ⅰ型干擾素信號(hào) 2013年，Kang等[42]報(bào)道Caspase-8對(duì)LPS誘導(dǎo)的NLRP3炎性小體激活及IL-1β產(chǎn)生的負(fù)性調(diào)控作用。與野生型對(duì)照組相比，Caspase-8-/-樹(shù)突狀細(xì)胞可產(chǎn)生更多IL-1β。機(jī)制研究表明，LPS誘導(dǎo)的NLRP3炎性小體的自發(fā)性激活依賴于RIPK1和RIPK3。在Caspase-8-/-樹(shù)突狀細(xì)胞中基因敲除RIPK1及使用RIPK1激酶抑制劑均可抑制LPS誘導(dǎo)的IL-1β。SiRNA沉默MLKL基因后，也可減少LPS誘導(dǎo)的Caspase-8-/-樹(shù)突狀細(xì)胞中IL-1β的產(chǎn)生。這些研究結(jié)果表明Caspase-8可負(fù)性調(diào)控RIPK1-RIPK3-MLKL介導(dǎo)的NLRP3炎性小體的激活。

Andrew等[53]曾研究發(fā)現(xiàn)在小鼠基底表皮形成細(xì)胞中敲除Caspase-8或誘導(dǎo)表達(dá)無(wú)酶活性的Caspase-8均可引發(fā)慢性皮膚炎癥。該研究表明由Caspase-8缺失誘發(fā)的炎癥并不依賴于真皮巨噬細(xì)胞功能、TNF、IL-1β、TOLL樣受體MyD88、TRIF等途徑。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在Caspase-8敲除的角質(zhì)細(xì)胞中，干擾素調(diào)節(jié)因子3(IRF3)和TANK結(jié)合激酶1(TBK1)可持續(xù)磷酸化，誘導(dǎo)表達(dá)更高水平的IFNβ和IFN誘導(dǎo)蛋白，基因敲除IRF3可逆轉(zhuǎn)Caspase-8缺失誘發(fā)的炎癥效應(yīng)。

5 Caspase-12與固有免疫關(guān)系研究

Caspase-12屬于炎性Caspases的一員，在多種組織中均有表達(dá)[4]。2006年，Saleh等[54]報(bào)道Caspase-12是Caspase-1激活的一個(gè)主要負(fù)調(diào)節(jié)因子。作者通過(guò)在HEK293T細(xì)胞中過(guò)表達(dá)Caspase-12，發(fā)現(xiàn)無(wú)論全長(zhǎng)還是無(wú)酶活性的Caspase-12均可抑制Caspase-1的激活和IL-1β/IL-18的分泌。免疫共沉淀結(jié)果發(fā)現(xiàn)Caspase-12可在結(jié)構(gòu)上與Caspase-1發(fā)生直接相互作用，從而抑制Caspase-1蛋白酶活性。另外，他們也證明在LPS/Pam3CSK4/poly(I:C)處理的THP-1細(xì)胞中過(guò)表達(dá)Caspase-12可抑制ATP誘導(dǎo)的IL-1β的分泌。2016年，Walle等[55]研究結(jié)果表明，無(wú)論是Caspae-12缺失的細(xì)胞還是小鼠均未增加Caspase-1的活化。另外IL-1β/IL-18通過(guò)典型和非典型炎癥小體途徑的釋放也沒(méi)有因Caspae-12的缺失有所增強(qiáng)。這兩項(xiàng)結(jié)果相悖的研究表明，Caspase-12對(duì)炎癥的具體調(diào)控作用仍有待進(jìn)一步深入研究。

6 總結(jié)與展望

越來(lái)越多的研究揭示固有免疫相關(guān)的Caspases的活性調(diào)控及炎癥介導(dǎo)機(jī)制。當(dāng)細(xì)胞受到DAMPs和PAMPs等刺激時(shí)，NLRs或ALRs與ASC及Caspase-1組裝形成經(jīng)典炎性小體，激活Caspase-1，剪切活化IL-1β、IL-18和GSDMD，引發(fā)炎癥反應(yīng)和細(xì)胞焦亡。鼠源Caspase-11和人源Caspase-4/5是LPS的胞內(nèi)受體，與LPS結(jié)合后寡聚化激活，引發(fā)GSDMD介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡，另一方面也可通過(guò)激活NLRP3炎性小體促進(jìn)IL-1β/IL-18的分泌。目前Caspase-12與固有免疫的關(guān)系仍未有統(tǒng)一的定論，具體作用機(jī)制亟待進(jìn)一步深入研究。以往認(rèn)為炎性Caspases和凋亡Caspases分別調(diào)控炎癥和凋亡，但近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)這些Caspases也有一些除既定角色之外的功能。如，凋亡Caspase-8除介導(dǎo)細(xì)胞凋亡外，還可在固有免疫調(diào)控過(guò)程中扮演雙重角色，綜合調(diào)控、平衡機(jī)體的免疫應(yīng)答。

盡管目前已有較多關(guān)于Caspase家族成員與固有免疫關(guān)系的研究，但還需更廣泛更深入的探索以全面闡釋二者的關(guān)系。如，(1)凋亡Caspases除Caspase-8外，其他成員與固有免疫的關(guān)系及作用機(jī)制鮮有報(bào)道，有待研究。(2)有研究表明Caspases成員之間存在調(diào)控關(guān)系，如Caspase-11和Caspase-8可介導(dǎo)Caspase-1活化，但具體機(jī)制不明確，有待深入研究。(3)Caspase-12雖屬炎性Caspases成員，但其免疫調(diào)控作用及機(jī)制均不明確，有待進(jìn)一步研究。(4)在心肌梗死、腦卒中等心腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中，因組織缺血缺氧往往伴隨細(xì)胞壞死、壞死性凋亡、細(xì)胞焦亡、細(xì)胞凋亡等與Caspases相關(guān)的多種死亡方式。明確Caspase家族在該類(lèi)疾病中的作用，可為其臨床治療提供更有效的靶標(biāo)和策略。(5)天然產(chǎn)物對(duì)Caspases介導(dǎo)的固有免疫的調(diào)控及機(jī)制研究。