豆豉姜活性成分9,9’-O-二-(E)-阿魏?；?內(nèi)消旋-5,5’-二甲氧基開環(huán)異落葉松樹脂酚（LCA）抗炎作用研究

余璐瑤，賈 丹，沈 慧，孫曉蕾，秦路平,，韓 婷 （.上海師范大學(xué)生命科學(xué)院，上海 0034；.海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室，上海 00433）

炎癥泛指機(jī)體受到創(chuàng)傷或病原體感染等刺激后所產(chǎn)生的生理反應(yīng)，主要表現(xiàn)為疼痛、紅腫、發(fā)熱等[1]。通常情況下，機(jī)體受到創(chuàng)傷等刺激后，所產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)是一種生理性保護(hù)反應(yīng)，有益于機(jī)體損傷的修復(fù)[2-3]，但當(dāng)機(jī)體內(nèi)的抗炎系統(tǒng)過于活躍時，會引起自身免疫系統(tǒng)紊亂，對機(jī)體正常的細(xì)胞及組織進(jìn)行攻擊，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等免疫疾病[4]。目前，臨床上常用的抗炎藥物主要分為甾體類抗炎藥（SAIDs）、非甾體類抗炎藥（NSAIDs）及免疫調(diào)節(jié)藥，但這幾類藥物多具有副作用[5-7]，因此，新型抗炎藥物的研發(fā)具有極高的科研前景和社會價值。豆豉姜是樟科植物山雞椒Litsea cubeba（Lour.）Pers的根及根莖，被傣醫(yī)學(xué)及中醫(yī)作為廣泛的民間方劑，多用于祛風(fēng)散寒、息肝風(fēng)、消腫、治風(fēng)濕痹痛的治療。前期課題組提取分離得到新型的二芐基丁烷型木脂素9,9’-O-二-(E)-阿魏?；?內(nèi)消旋-5,5’-二甲氧基開環(huán)異落葉松樹脂酚（LCA）化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示，并發(fā)現(xiàn)其具有改善類弗氏完全佐劑大鼠關(guān)節(jié)炎模型中炎性癥狀的療效[8]，因此，課題組推測LCA是豆豉姜中具有抗炎活性的天然化合物，故采用小鼠耳腫脹和棉球肉芽腫模型及RAW264.7細(xì)胞實驗，對其抗炎作用進(jìn)行研究。

圖 1 LCA 化學(xué)結(jié)構(gòu)

1 材料

1.1 實驗動物

二甲苯致小鼠耳廓腫脹實驗?zāi)Ｐ停?周齡SPF 級雄性昆明小鼠，體重：（20±2）g；大鼠棉球肉芽腫實驗：4周齡 SPF級雄性 SD大鼠，體重：（120±10）g。動物由海軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供，并飼養(yǎng)于海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院動物房，室溫控制為 24 ℃，12 h 光照+12 h 黑暗，水及食物充足供應(yīng)。RAW264.7（海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室）。

1.2 試劑與器材

LCA（海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系有機(jī)化學(xué)教研室合成及鑒定）；吲哚美辛（海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院）；二甲苯、水合氯醛、羧甲基纖維素鈉CMCNa、對氨基苯磺酸、磷酸、N-α-萘乙二胺（中國醫(yī)藥集團(tuán)）；棉球（中國朝陽公司）；ELISA試劑盒（中國聯(lián)科公司）；iNOS、COX-2、GAPDH抗體及二抗（CST，USA）。分析天平（MettlerToledo，USA）；CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱（Sanyo，Japan）；ELx 800 酶標(biāo)儀（Fisher，US）；凝膠成像儀（Tanon-5200 multi，中國上海）。

2 方法

2.1 動物實驗

2.1.1 動物模型建立及處理

小鼠耳廓腫脹模型建立：將60只5周齡健康雄性昆明鼠安置于動物實驗中心適應(yīng)1周，按體重隨機(jī)分為4組，各10只，組別標(biāo)記為：模型組；LCA 組（20、40 mg/kg）；吲哚美辛組（8 mg/kg）。給藥以灌胃的形式每日一次，模型組則予相同體積的 0.5% CMC-Na連續(xù) 3 d 灌胃，在末次給藥 1 h后，將二甲苯以0.05 ml/只劑量均勻涂布于小鼠右耳廓的雙面，左耳不做處理，連續(xù)刺激45 min后處死小鼠，用打孔器分別于左右耳廓同一位置打下圓形耳片[9]，稱重，用于計算比較耳腫脹程度及耳腫脹抑制率（%）。

大鼠棉球肉芽腫模型建立：將20只4周齡健康雄性SD大鼠安置于動物實驗中心適應(yīng)1周，按體重隨機(jī)分為 4 組：模型組；LCA 組（20、40 mg/kg）；吲哚美辛組（5 mg/kg）。用水合氯醛對大鼠進(jìn)行麻醉，于左右兩邊腋窩下切開一小口，將2個滅菌棉球（20 mg）分別植入小鼠左右腋窩，縫合后第2天給藥。且以灌胃的形式每日一次，模型組則予相同體積的 0.5% CMC-Na 連續(xù) 7 d[10-11]。第 8 天處死大鼠，將腋下棉球及附著的肉芽組織剝離，稱重，用于計算比較干濕重及抑制率。

2.1.2 動物指標(biāo)測定

耳腫脹度=右耳片重量-左耳片重量

耳腫脹抑制率（%）=（模型組平均耳腫脹度-給藥組平均耳腫脹度）/模型組平均耳腫脹度×100%

平均棉球肉芽腫重量=（右側(cè)棉球肉芽腫重量+左側(cè)棉球肉芽腫重量）/2

棉球肉芽腫抑制率（%）=（模型組平均棉球肉芽腫重量-給藥組平均棉球肉芽腫重量）/模型組平均棉球肉芽腫重量×100%

2.2 RAW264.7 細(xì)胞實驗

2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

RAW264.7（小鼠單核巨噬細(xì)胞）用DMEM高糖完全培養(yǎng)基（10% DMEM+90% FBS+1%雙抗）培養(yǎng)于37 ℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中。

2.2.2 細(xì)胞增殖檢測

將RAW264.7細(xì)胞以1×103個/孔接種于96孔板，完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，棄上清液，給予不同濃度的 LCA 培養(yǎng)液（3、1.5、0.75和 0.375 μmol/L），并設(shè)置空白對照組，每組5個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h，采用MTT法測定LCA對小鼠單核巨噬細(xì)胞的增殖作用。

2.2.3 炎癥因子水平測定

將RAW264.7細(xì)胞以1×106個/孔接種于24孔板，24 h 后棄上清液，脂多糖（LPS）組和 LCA 組中加入 1 ml含 2 μg/ml LPS 的完全培養(yǎng)基，刺激 2 h，于空白組和LPS組中加入1 ml完全培養(yǎng)基，給藥組加入各濃度 LCA（1.5、0.75和 0.375 μmol/L）的完全培養(yǎng)基，作用 24 h 后，測 NO 含量：取 100 μl上清液與 100 μl Griess試劑（A 液：對氨基苯磺酸0.1 g，加 5% 磷酸 10ml；B 液：N-α-萘乙二胺 0.01 g，加10ml蒸餾水，等體積混合）混合避光顯色30 min，用酶標(biāo)儀于 540 nm處測各孔吸光度（A）值；測TNF-α：取上清液，根據(jù)ELISA試劑盒說明書步驟測量上清液中炎癥因子TNF-α的含量。

2.2.4 炎癥相關(guān)蛋白表達(dá)檢測

將RAW264.7細(xì)胞以1×106個/孔接種于6孔板，細(xì)胞貼壁后，處理組（LPS組、LCA組）中加入1ml含 2 μg/ml LPS 的完全培養(yǎng)基，刺激 2 h，于空白組和LPS組中加入1 ml完全培養(yǎng)基，給藥組加入各濃度 LCA（1.5、0.75和 0.375 μmol/L）的完全培養(yǎng)基，作用24 h后，細(xì)胞裂解提取蛋白并定量，蛋白變性后SDS-PAGE凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)膜，封閉，依次用 iNOS，COX-2及 GAPDH于 4 ℃孵育過夜，用洗膜液（TBST）清洗3次后，二抗室溫孵育1 h，TBST洗滌后，用化學(xué)發(fā)光試劑盒于凝膠成像儀中顯影拍片。

2.3 統(tǒng)計分析

3 結(jié)果

3.1 LCA 對小鼠耳腫脹的影響

如表1所示，與模型組對比，吲哚美辛（8 mg/kg）可抑制由二甲苯造成的小鼠耳廓腫脹（P＜0.05），抑制率為 29.80%；LCA（40 mg/kg）組顯著抑制小鼠耳廓腫脹度（P＜0.01），抑制率為 37.41%，而 LCA（20 mg/kg）組對小鼠耳廓腫脹度的抑制無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

3.2 LCA 對大鼠棉球肉芽腫的影響

如圖2，模型組大鼠棉球肉芽腫體積較大且顏色鮮紅，吲哚美辛組的棉球肉芽腫體積小且顏色淺，而LCA組的棉球肉芽腫在色澤和大小上均有別于模型組。數(shù)據(jù)分析顯示（表2、表3），與模型組相比，陽性藥組吲哚美辛明顯抑制大鼠的棉球肉芽腫（P＜0.001），且干重、濕重的抑制率分別為48.73%和44.19%；LCA高劑量組也可明顯減少棉球肉芽腫的干重及濕重（P＜0.01），且抑制率達(dá)到23.89%和29.90%。

表 1 LCA 對二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響 (n=10，±s)

表 1 LCA 對二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響 (n=10，±s)

*P＜0.05，**P＜0.01，與模型組比較。

組別 腫脹度（m/mg） 抑制率（%）模型組 3.02±0.63 —LCA組（20 mg/kg） 2.52±0.29 16.56 LCA組（40 mg/kg） 1.89±0.54** 37.41吲哚美辛組（8 mg/kg） 2.12±0.61* 29.80

圖 2 各組大鼠棉球肉芽腫對比

表 2 LCA 對大鼠棉球肉芽腫濕重的影響 (n=5，±s)

表 2 LCA 對大鼠棉球肉芽腫濕重的影響 (n=5，±s)

***P＜0.001，與模型組比較。

組別 棉球肉芽腫濕重（m/mg） 抑制率（%）模型組 300.1±53.26 —LCA組（20 mg/kg） 256.0±36.36 14.70 LCA組（40 mg/kg） 228.4±51.16*** 23.89吲哚美辛組（5 mg/kg） 167.5±15.74*** 44.19

表 3 LCA 對大鼠棉球肉芽腫干重的影響 (n=5，±s)

表 3 LCA 對大鼠棉球肉芽腫干重的影響 (n=5，±s)

**P＜0.01，***P＜0.001，與模型組比較。

組別 棉球肉芽腫干重（m/mg） 抑制率（%）模型組 48.1±10.05 —LCA組（20 mg/kg） 42.32±10.19 12.05 LCA組（40 mg/kg） 33.73±7.10** 29.90吲哚美辛組（5 mg/kg） 24.67±7.39*** 48.73

3.3 LCA對LPS刺激RAW264.7細(xì)胞炎癥因子分泌的影響

如圖3所示，LCA的安全劑量不高于3 μmol/ml，且在0.75和1.5 μmol/ml濃度下顯著降低LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞分泌的NO和TNF-α濃度，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

3.4 LCA 對炎癥相關(guān)的蛋白表達(dá)的影響

如圖4所示，LCA在1.5 μmol/ml濃度下顯著抑制了炎癥相關(guān)蛋白iNOS、COX-2蛋白的表達(dá)（P＜0.001）。

4 討論

據(jù)報道[12]，許多從中藥中提取的活性天然化合物可以達(dá)到抗炎效果，包括黃芩苷、青藤堿和大黃素等，多為甘草次酸酰胺類衍生物。LCA不同于這些抗炎藥物，它具有新穎的二芐基丁烷型結(jié)構(gòu)，本研究從體內(nèi)、體外兩方面對它進(jìn)行較為系統(tǒng)的抗炎藥效評價。

圖 3 LCA對LPS刺激RAW264.7細(xì)胞增殖、NO和TNF-α分泌量的影響(n=5，±s)

圖 4 LCA 對炎癥相關(guān)蛋白表達(dá)的作用 (n=3，±s)

二甲苯誘導(dǎo)的小鼠耳腫脹模型是評價藥物體內(nèi)抗炎活性的急性炎癥模型之一[13]，本實驗?zāi)Ｐ徒M中二甲苯作為致炎劑刺激小鼠耳廓皮膚，促進(jìn)血管舒張、增加血管通透性致使炎性物質(zhì)滲出，耳片重量明顯高于未經(jīng)處理的耳片重量，LCA組能明顯改善小鼠耳部的炎性滲出及腫脹程度，且高濃度組的抑制率高于陽性藥吲哚美辛組（由于吲哚美辛高濃度有強烈的胃腸道反應(yīng)，故根據(jù)臨床用藥劑量換算出實驗動物的劑量，并參考相關(guān)文獻(xiàn)確定用藥量[13]，即8 mg/kg），表明LCA對急性炎癥有顯著作用。在慢性炎癥期，由于巨噬細(xì)胞和纖維母細(xì)胞等增生而形成肉芽組織，棉球肉芽腫實驗可模擬炎癥病理過程中炎性細(xì)胞浸潤和肉芽組織的增生[14]。結(jié)果顯示LCA降低棉球肉芽腫的濕重與干重，表明LCA可以控制慢性炎癥過程中炎性滲出物的轉(zhuǎn)移，同時抑制棉球外側(cè)小血管和結(jié)締組織的增生，證明LCA可以減少慢性炎癥進(jìn)程中肉芽組織的形成。結(jié)合上述兩個動物實驗可知LCA對急性炎癥以及慢性炎癥都具有一定的抑制作用。

炎癥的普遍特征是病灶區(qū)域有大量炎癥細(xì)胞的浸潤，并釋放大量炎癥因子和介質(zhì)，如IL-1、IL-6、TNF-α、前列腺素（PG）、組織胺和 NO等。其中，NO可激活NF-κB信號通路，誘導(dǎo)促炎因子（IL-6、TNF-α等）的分泌，引起機(jī)體組織損傷以及血管擴(kuò)張；TNF-α可刺激細(xì)胞免疫中T細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子，進(jìn)而誘導(dǎo)炎癥的加重和擴(kuò)大。iNOS可介導(dǎo)產(chǎn)生的大量NO并參與炎癥反應(yīng)；COX-2介導(dǎo)產(chǎn)生的前列腺素與慢性炎癥的發(fā)展和持續(xù)有關(guān)，致使白細(xì)胞聚集和浸潤，引起微血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。在本研究中，LPS刺激后，RAW264.7細(xì)胞分泌的NO和TNF-α含量，以及細(xì)胞內(nèi)iNOS和COX-2蛋白水平明顯增高，LCA濃度為1.5 μmol/ml時顯著抑制激活狀態(tài)下NO和TNF-α炎癥介質(zhì)的分泌，同時下調(diào)iNOS及COX-2蛋白的表達(dá)水平。由此進(jìn)一步證實LCA具有抗炎作用。然而，LCA抗炎的具體作用機(jī)制尚不明確，有待今后進(jìn)行更深層次的研究探討。