動(dòng)物DNA分析在法庭科學(xué)中的應(yīng)用

郭宏，李麗，楊辰，徐紅星，王瑋

（蘇州市立醫(yī)院司法鑒定所，江蘇 蘇州215002）

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，DNA鑒定技術(shù)廣泛地應(yīng)用于刑事案件偵查過程中，成為揭露事實(shí)真相和準(zhǔn)確、有效打擊犯罪分子的工具。其實(shí)，除了人類的DNA外，還有一些非人類的DNA同樣值得我們關(guān)注。非人類DNA的范疇除動(dòng)物DNA外還包括植物DNA和微生物DNA，隨著法庭科學(xué)的發(fā)展，目前對(duì)動(dòng)物DNA的關(guān)注越來越多，主要包括動(dòng)物的種屬鑒定和個(gè)體識(shí)別。

1 種屬鑒定

目前在動(dòng)物的種屬鑒定中，通常采用具有種間特異性的線粒體DNA（mtDNA）或核DNA（nDNA）中的基因片段，如細(xì)胞色素b基因（cytochrome b，cytb）、12S rRNA基因、16S rRNA基因以及線粒體D環(huán)區(qū)（D-loop）。與核DNA相比，線粒體DNA具有分子量小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、不與組蛋白結(jié)合而裸露、種屬特異性、進(jìn)化速度快和嚴(yán)格的母性遺傳等特點(diǎn)[1]，最重要的在于其拷貝數(shù)多，可達(dá)數(shù)千到上萬個(gè)，遠(yuǎn)高于核DNA。當(dāng)檢材腐敗變質(zhì)使得核DNA降解嚴(yán)重或檢材如指甲、脫落的毛發(fā)等DNA含量極少時(shí)，仍可通過PCR擴(kuò)增線粒體DNA進(jìn)行檢測(cè)，且較核DNA片段擴(kuò)增更容易[2]。

線粒體Cytb基因是進(jìn)行動(dòng)物種屬鑒定使用頻率最高的基因片段[2]，在許多脊椎動(dòng)物的種屬鑒定上，如鯊魚[3]、蛇[4]、海龜[5]、犀牛[6]、大象[7]和老虎[8]等中均已得到成功的應(yīng)用。在無脊椎動(dòng)物方面近年來也有報(bào)道[9-10]。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，脊椎動(dòng)物線粒體DNA中Cytb基因序列的轉(zhuǎn)換與顛換之比隨相鄰核苷酸A+T含量的增高而增加，無脊椎動(dòng)物Cytb基因序列的核苷酸替換沒有顯著的偏好性[11]。

2 個(gè)體識(shí)別

目前，短串聯(lián)重復(fù)序列STR是個(gè)體識(shí)別中最為常用的遺傳標(biāo)記。現(xiàn)存的STR數(shù)據(jù)庫(kù)中已經(jīng)包含了許多哺乳動(dòng)物的STR基因座信息，特別是家庭馴養(yǎng)動(dòng)物，例如狗[12-15]，貓[16-17]，馬[18-20]，牛[21]和鴿子[22]。針對(duì)野生動(dòng)物，還沒有建立這樣的數(shù)據(jù)庫(kù)。但是已經(jīng)有一些具體的實(shí)例，比如鹿[23]，野豬[24]，老虎[25]，歐洲獾[26]及食肉鳥類，例如黃金鷹（Aquila chrysaetos）和獵鷹類例如獵隼（Falco cherrug）[27-28]，響尾蛇（Crotalus tigris）[29]，需要注意的是這些數(shù)據(jù)的來源都是某特定物種的一個(gè)群，因此這些數(shù)據(jù)可能跟該物種的其它群的序列分析有關(guān)聯(lián)，也可能一點(diǎn)關(guān)聯(lián)都沒有。

3 動(dòng)物DNA在法庭科學(xué)應(yīng)用中的注意事項(xiàng)

3.1 引物的選擇與設(shè)計(jì)

當(dāng)可疑斑跡確定為生物斑跡后，往往要通過測(cè)序來確定其種屬來源，明確是人的還是動(dòng)物的，必要時(shí)還要明確是何種動(dòng)物。引物是決定種屬鑒定特異性的關(guān)鍵技術(shù)指標(biāo)。目前已經(jīng)報(bào)道了一些測(cè)序引物的序列[30-31]，這些引物可以用作不同分類群的通用引物。無論是通用引物還是種屬特異性引物都要詳細(xì)說明其結(jié)合部位。使用通用引物時(shí)，需要注意潛在的混合斑的問題，在一些案子中，動(dòng)物斑跡（小的血滴）滴落在人的衣服上，在適宜的PCR條件下，如果通用引物優(yōu)先擴(kuò)增了人類DNA，那么，可疑動(dòng)物的DNA就有可能得不到擴(kuò)增。對(duì)于線粒體基因組上的位點(diǎn)，引物的結(jié)合位置會(huì)影響最后得到的基因序列是否完整。如果沒有得到完整的線粒體序列，則要提供該序列的登錄號(hào)或者參考序列。對(duì)所得序列進(jìn)行命名時(shí)，使用不同的命名法，容易導(dǎo)致混亂。因此，要盡可能早的統(tǒng)一命名法。目前，由犬科線粒體D-環(huán)序列得來的默認(rèn)的線粒體D-環(huán)序列已經(jīng)比較完整[32]，它可以做為線粒體比對(duì)的一個(gè)模板使用。

針對(duì)STR基因座設(shè)計(jì)的引物通常是從以往的序列數(shù)據(jù)中得到的。而這些序列數(shù)據(jù)的有效性需要驗(yàn)證，尤其是象GenBank之類的公用數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)據(jù)。種內(nèi)實(shí)驗(yàn)與種間實(shí)驗(yàn)是必須要做的。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的整個(gè)過程必須有據(jù)可查，包括實(shí)驗(yàn)的靈敏性、特異性和實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性，以及實(shí)驗(yàn)所用樣本量。此外還必須進(jìn)行交叉反應(yīng)試驗(yàn)，包括近親反應(yīng)和類屬反應(yīng)。對(duì)于交叉反應(yīng)試驗(yàn)，不但要選擇那些近親物種，而且還要選擇那些跟目標(biāo)物種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的其它物種。因?yàn)閾碛邢嗨苹蚪M序列的種群間的差異，以及種內(nèi)變異與種間變異的重疊部分，哪怕是特別小的一部分，這些都可能導(dǎo)致錯(cuò)誤的結(jié)論。有些數(shù)據(jù)，表面上可能支持該生物樣本來源于某一特定種群，但事實(shí)上卻來源于其它的種群。也有可能GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中所提供序列在同一種群內(nèi)不具代表性，這一點(diǎn)在今后的研究當(dāng)中要注意。

由引物結(jié)合部突變而造成的一些有疑議的結(jié)果，需要通過包含一定樣本量的實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證。如果可能的話，要對(duì)引物結(jié)合部進(jìn)行測(cè)序并公布結(jié)果。貓科實(shí)驗(yàn)跟犬科實(shí)驗(yàn)的特異性引物已經(jīng)可以從STR數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行查找（www.cstl.nist.gov/div831/strbase/）。

3.2 親緣關(guān)系

親緣關(guān)系因子是指能夠表明來源于同一種群的兩個(gè)體，擁有相同的遺傳學(xué)祖先即擁有同一等位基因機(jī)會(huì)的因子，已經(jīng)在法醫(yī)遺傳學(xué)人類DNA圖譜的比對(duì)中普遍應(yīng)用，該親緣關(guān)系因子，也稱為FST或者θ，在人群當(dāng)中的范圍是0.01~0.03。該數(shù)值的意義就是能夠估計(jì)不同個(gè)體間擁有同一祖先的度。當(dāng)人群足夠大時(shí)，擁有同一祖先的度是非常小的，但是，在非人類種群中，情況就不同了，特別是在被隔離的小的野生動(dòng)物種群、被馴養(yǎng)的種群、分布局限的種群、或者多配偶的種群。針對(duì)野生動(dòng)物的親緣關(guān)系因子，象鹿、熊和歐洲獾，已經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)道過了，而且這幾個(gè)野生動(dòng)物種群內(nèi)部的生育量也計(jì)算得出[33]。

3.3 二核苷酸重復(fù)序列

在法醫(yī)遺傳學(xué)的人類DNA鑒定實(shí)踐中，由于二核苷酸重復(fù)序列stutter現(xiàn)象以及雜合子的不均衡等因素，不推薦使用二核苷酸重復(fù)序列做為遺傳標(biāo)記。但是在動(dòng)物DNA鑒定中二核苷酸重復(fù)序列已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用了。因此，當(dāng)所檢測(cè)的位點(diǎn)是二核苷酸重復(fù)序列時(shí)，應(yīng)當(dāng)記錄其stutter率，這一點(diǎn)非常重要。每個(gè)位點(diǎn)的雜合度也要公布。

4 總結(jié)

事實(shí)上，在法醫(yī)遺傳學(xué)中，研究對(duì)象為人類DNA或非人類DNA所遵循的法則是一致的。但是，我們要清楚的認(rèn)識(shí)到，雖然我們對(duì)非人類DNA的遺傳學(xué)認(rèn)識(shí)速度非?？?，但還是有限的，非人類DNA分析與人類DNA分析既有相似性又有復(fù)雜性，非人類DNA分析的規(guī)范化還有更長(zhǎng)的路要走。

[1]Brow nWM.Mechanism of Evolution in animal mitochondrial DNA[J].Ann N Y A cad Sci，1981，（61）：119-134.

[2]Saltonstall K，Amato G，Powell J.Mitochondrial DNA variability in Grauers gorillas of KahuziBiega National Park[J].J H ered，1998，（89）：129-135.

[3]D.D.Chapman，D.L.Abercrombie，C.J.Douady，E.K.Pikitch，M.J.Stanhope，M.S.Shivji.A streamlined，biorganelle，multiplex PCR approach to species identification：application to global conservation and trade monitoring of the great white shark，Carcharodon carcharias[J].Conserv.Gen，2003，4（4）：415-425.

[4]K.Lwong，J.Wang，P.P.H.But，P.C.Shaw.Applicationofcytochrome b DNA sequences fortheauthenticationofendangeredsnakespecies[J].ForensicSci.Int，2004，139（1）：49-55.

[5]C.F.Lo，Y.R.Lin，H.C.Chang，J.H.Lin.Identification of turtle shell and its prepara-tions by PCR-DNA sequencing method[J].J.Food Drug Anal，2006，14（2）：153-158.

[6]H.M.Hsieh，L.H.Huang，L.C.Tsai，Y.C.Kuo，H.H.Meng，A.Linacre，J.C.I.Lee.Species identification of rhinoceros horns using the cytochrorne b gene[J].Forensic Sci.Int.，2003，136（1-3）：1-11.

[7]J.Lee，H.M.Hsieh，L.H.Huang，Y.C.Kuo，J.H.Wu，S.C. Chin，A.H.Lee，A.Linacre，L.C.Tsai.IvoryidentificationbyDNAprofilingofcytochrome b gene[J].Int.J.LegalMed，123 2009：123（2）：117-121.

[8]Q.H.Wan，S.G.Fang.Application of species-specific polymerase chain reaction in the forensic identification of tiger species[J].Forensic Sci.Int.，2003，131（1）：75-78.

[9]J.Hulcr，S.E.Miller，G.P.Setliff，K.Darrow，N.D. Mueller，P.D.N.Hebert，G.D.Weiblen.DNA barcoding confirms polyphagy in a generalist moth，Homona mermerodes（Lepidoptera：Tortricidae）[J].Mol.Ecol.Notes，2007，7（4）：549-557.

[10]D.Steinke，T.S.Zemlak，P.D.N.Hebert，Barcoding Nemo：DNA-based identifica-tions for the ornamental fish trade[J]. PLoS One，2009，7（4）：e6300.

[11]劉運(yùn)強(qiáng).家蠶線粒體基因組全序列測(cè)定及分析[D].重慶：西南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2001：1-5.

[12]M Dayton，M.T.Koskinen，B.K.Tom，A.M.Mattila，E. Johnston，J.Halverson，D.Fantin，S.DeNise，B.Budowle，D.G.Smith，S.Kanthaswamy.Developmental validation of short tandem repeat reagent kit for forensic DNA profiling of canine biological material[J].Croatian Med.J，2009，50（3）：268-285.

[13]S.Kanthaswamy，B.K.Tom，A.M.Mattila，E.Johnston，M. Dayton，J.Kinaga，B.J.A.Erickson，J.Halverson，D. Fantin，S.DeNise，A.Kou，V.Malladi，J.Satkoski，B.Budowle，D.G.Smith，M.T.Koskinen，Canine population data generated from a multiplex STR kit for use in forensic casework[J].J.Forensic Sci.，2009，54（4）：829-840.

[14]B.van Asch，C.Alves，L.Gusmao，V.Pereira，F(xiàn).Pereira，A.Amorim，A new autosomal STR nineplex for canine identification and parentage testing[J].Electrophoresis，2009，30（2）：417-423.

[15]B.Berger，C.Eichmann，W.Parson（Eds.）.Forensic Canine STR Analysis，in Nonhuman DNA typing[M].H Coyle，CRC Press，Boca Raton，2008：21-23.

[16]N.Coomber，V.A.David，S.J.O’Brien，M.Menotti-Raymond，Validation of a short tandem repeat multiplex typing system for genetic individualization of domestic cat samples[J].Croatian Med.J.2007，48（4）：547-555.

[17]M.A.Menotti-Raymond，V.A.David，L.L.Wachter，J.M. Butler，S.J.O’Brien.An STIR forensic typing system for genetic individualization of domestic cat （Felis catus）samples[J].J.Forensic Sci.，2005，50（5）：1061-1070.

[18]A.T.Bowling，M.L.EgglestonStott，G.Byrns，R.S.Clark，S. Dileanis.E.Wictum，Validation of microsatellite markers for routine horse parentage testing[J].Animal Gen，1997，28（4）：247-252.

[19]P.Dimsoski.Development of a 17-plex microsatellite polymerase chain reaction kit for genotyping horses[J].Croatian Med.J，2003，44（3）：332-335.

[20]J.W.Chen，C.E.Uboh，L.R.Soma，X.Q.Li，F(xiàn).Y.Guan，Y. W.You，Y.Liu.Identification of racehorse and sample contamination by novel 24-plex STR system[J].Forensic Sci. Int.-Gen.2010，4（3）：158-167.

[21]L.H.P.van de Goor，H.Panneman，W.A.van Haeringen.A proposal for standardi-zation in forensic bovine DNA typing：allele nomenclature of 16 cattle-specific short tandem repeat loci[J].Animal Gen，2009，40（5）：630-636.

[22]J.Chun-Lee，L.C.Tsai，Y.Y.Kuan，W.H.Chien，K.T. Chang，C.H.Wu，A.Linacre，H.M.Hsieh.Racing pigeon identification using STR and chromo-helicase DNA binding gene markers[J].Electrophoresis，2007，28（23）：4274-4281.

[23]P.F.Smith，D.DenDanto，K.T.Smith，D.Palman，I.Kornfield.Allele frequencies for three STR loci RT24，RT09，and BM1225 in northern New England white-tailed deer[J].J. Forensic Sci，2002，47（3）：673-675.

[24]S Caratti，L.Rossi，B.Sona，S.Origila，S.Viara，G.Martano，C.Torre，C.Robino.Analysis of 11 tetrameric STRs in wild boars for forensic purposes[J].Forensic Science International，Genetics，2010，4（5）：339-342.

[25]A.Singh，A.Gaur，K.Shailaja，B.S.Bala，L.Singh.Novel microsatellite （STR）marker for forensic identification of big cats in India[J].Forensic Sci.Int，2004，141（2-3）：143-147.

[26]N.Dawnay，R.Ogden，R.S.Thorpe，L.C.Pope，D.A.Dawson，R.McEwing.A forensic STR profiling system for the Eurasian badger：a framework for developing profiling systems for wildlife species[J].Forensic Sci.Int.-Gen，2008，2（1）：47-53.

[27]N.Dawnay，R.McEwing，R.S.Thorpe，R.Ogden.Preliminary data suggests genetic distinctiveness of gyr and saker falcons[J].Conserv.Gen，2008，3（2）：703-707.

[28]N.Dawnay，R.Ogden，J.H.Wetton，R.S.Thorpe，R. McEwing.Genetic data from 28 STR loci for forensic individual identification and parentage analyses in 6 bird of prey species[J].Forensic Sci.Int.-Gen，2009，3（2）：63-69.

[29]C.S.Goldberg，T.Edwards，M.E.Kaplan，M.Goode，PCR primers for microsatellite loci in the tiger rattlesnake（Crotalus tigris，Viperidae）[J].Mol.Ecol.Notes 2003，3（4）：539-541.

[30]Hsieh HM，Chiang HL，Tsai LC，et al.Cytochrome b gene for species identification of the conservation animals[J].Forensic Sci Int，2001，（122）：7-18.

[31]Parson W，Pegoraro K，Niederstatter H，et al.Species identification by means of the cytochrome b gene[J].Int J legal Med，2000，114（1-2）：23-28.

[32]B.Budowle，P.Garofano，A.Hellman，et al.Recommendations for animal DNA forensic and identity testing[J].Int.J. Legal Med，2005，119（5）：295-302.

[33]K.E.Holsinger，B.S.Weir.Fundamental concepts in genetics. Genetics in geographically structured populations：defining，estimating and interpreting F-ST[J].Nat.Rev.Gen，2009，10（9）：639-650.