蜂膠抗氧化作用研究進(jìn)展

王姍姍 王 捷 楊文超 吳珍紅 繆曉青

（福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)學(xué)院，福州 350002）

蜂膠是蜜蜂從植物芽孢和枝條上采集的樹脂狀分泌物并混入蜜蜂上顎腺分泌液和蜂蠟等而形成的復(fù)雜物質(zhì)。[1]蜂膠含有約300余種復(fù)雜成分，其中包括40～50種黃酮類物質(zhì)及各種萜烯類、有機(jī)酸、醌類、氨基酸、維生素、酶類、多糖和礦物元素等[2]?，F(xiàn)已從蜂膠中分離出黃酮、黃酮醇類化合物就有30多種。另外，蜂膠還含有硒、鋅、鐵、錳、銅、鎂、鈣等多種人體必須的微量元素及多種維生素。

機(jī)體的氧化反應(yīng)中部分氧產(chǎn)生過氧化氫、超氧化陰離子和自由基羥基等活性氧及自由基，過剩的自由基作用細(xì)胞膜及血液中的酯類物質(zhì)，形成脂質(zhì)過氧化物，沉積在細(xì)胞膜上，使膜功能喪失，細(xì)胞活力下降。蜂膠的抗氧化作用的研究越來越引起關(guān)注。蜂膠中含有豐富的黃酮類、甙類、酚類、萜烯類化合物，具有很好的抗氧化性能，是公認(rèn)的天然抗氧化劑，同時(shí)還能顯著提高人體內(nèi)的SOD活性，因而能穩(wěn)定和清除自由基，減少脂質(zhì)過氧化物和脂褐素的生成與沉積，保護(hù)細(xì)胞膜，增強(qiáng)細(xì)胞活力，調(diào)節(jié)器官組織功能，有效延緩衰老，并避免人體患某些癌癥、心臟病等其它與年齡有關(guān)的疾病。因此，服用蜂膠是補(bǔ)充天然抗氧化劑的一種有效途徑。

1 蜂膠的功能作用

蜂膠具有很好的藥用及保健功能，主要有以下幾點(diǎn)：

1.1 蜂膠的護(hù)膚作用

蜂膠和它的主要的多酚成份顯示了高的抗氧化活性，如發(fā)現(xiàn)其具有抑制亞油酸（LA）的脂質(zhì)過氧化的作用。而且，通過測(cè)量防曬系數(shù)，證明這些物質(zhì)對(duì)廣譜對(duì)紫外線A和紫外線B具有光保護(hù)功效，通用指示劑為紫外線B，通過對(duì)UVA / UVB的比率、臨界波長(zhǎng)測(cè)量得出了紫外線吸收性能。蜂膠的醇提物及其成份顯示了很好的抗氧化能力。這兩個(gè)特點(diǎn)的結(jié)合使蜂膠醇提物成為可能的防曬霜商業(yè)配方的活性成份，因?yàn)樗鼈兊姆雷o(hù)和預(yù)防性質(zhì)。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)：威尼托蜂膠和其中的某些成份，因?yàn)橛兄@著的抗氧化性能結(jié)合良好的廣譜UVB和UNA保護(hù)，可以有效地使用于天然防曬霜中[3]。

1.2 抗氧化與保護(hù)心腦血管

蜂膠是公認(rèn)的天然抗氧化劑，其中的蘆丁、桷皮素、維生素E、維生素C及微量元素鋅、硒等物質(zhì)，具有極強(qiáng)的抗氧作用。它能增加機(jī)體自由基的清除能力、阻止自由基的氧化損傷作用[4]。

1.3 增強(qiáng)免疫功能

蜂膠能提高人體的體液免疫和細(xì)胞免疫功能。研究證明，蜂膠能顯著增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬能力和自然殺傷細(xì)胞的活性，能促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生更多的抗體。臨床研究證明，老年人在服用蜂膠提取物后，抗體合成能力和免疫細(xì)胞的吞噬性明顯提高。

1.4 抑菌、抗病毒

蜂膠具有廣譜抗菌作用。蜂膠提取物可使用細(xì)菌溶菌死亡。蜂膠還是天然抗病毒物質(zhì)，對(duì)多種病毒均有較強(qiáng)的抑制作用。

1.5 預(yù)防腫瘤

蜂膠中含有豐富的抗癌物質(zhì)。研究證明，癌癥患者在服用蜂膠后，可縮小癌細(xì)胞且能減輕化療、放療引起的副作用。

1.6 其它作用

蜂膠除了具有上述的保健作用外，還有抗過敏、抗炎、抗疲勞、降血壓、調(diào)節(jié)血脂、改善代謝等作用。

總之，蜂膠對(duì)人體健康十分有益且無毒副作用，蜂膠被譽(yù)為“神奇的小藥庫”、“健康的保護(hù)神”，是21世紀(jì)人類保健的新寵兒。

2 蜂膠的抗氧化作用機(jī)理

蜂膠中的黃酮類化合物、咖啡酸酯類以及其他一些成分是主要的抗氧化物質(zhì)，主要研究結(jié)果如下：

2.1 黃酮類化合物的抗氧化機(jī)理

蜂膠中黃酮類化合物與超氧陰離子反應(yīng)，阻止自由基反應(yīng)的引發(fā)，或與鐵離子螯合阻止羥基自由基的生成，或與脂質(zhì)過氧化基反應(yīng)阻止脂質(zhì)過氧化過[5]。

2.2 蜂膠中咖啡酸酯類的抗氧化作用機(jī)理

咖啡酸苯乙酯（CAPE）是蜂膠提取液中的活性成分之一，能在微摩爾的濃度范圍內(nèi)抑制5-脂加氧酶催化的亞油酸和花生四烯酸的氧化過程。在10μM濃度時(shí)，可完全阻斷人的噬中性粒細(xì)胞反應(yīng)性氧化物的產(chǎn)生和黃嘌呤一黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)[6]。

2.3 蜂膠中其他物質(zhì)的抗氧化作用機(jī)理

Basnetp等從巴西蜂膠的水提取物中分離出一種苯基丙烯酸衍生物的化合物，其抗氧化活性強(qiáng)于維生素C和維生素E。蜂膠水提取物還可以保護(hù)纖維細(xì)胞免受高壓氧的脅迫，使得蜂膠水提取物具有抗炎癥作用。德國(guó)學(xué)者Volpert研究發(fā)現(xiàn)，蜂膠的水提取物對(duì)心肌黃嘌呤和黃嘌呤氧化酶催化的氧化反應(yīng)均有抑制作用，對(duì)吲哚乙酸的過氧化反應(yīng)也有抑制作用，其抗氧化作用可能與所含的單酚和多酚化合物有關(guān)[7]。蜂膠的抗氧化作用不僅僅來源于黃酮類化合物，其它成分也起一定的作用。

3 蜂膠抗氧化活性的測(cè)定方法研究

3.1 循環(huán)伏安法測(cè)定

用循環(huán)伏安法測(cè)定蜂膠提取物的總抗氧化活性。所有提取物溶液和標(biāo)準(zhǔn)化合物都50%甲醇制備。所有溶液在制備好后立即分析，物質(zhì)吸附到電極表面最少時(shí)浸入鉑電極并記錄電極反應(yīng)。濃度范圍為5～50 ug/ml 的抗壞血酸溶液的循環(huán)伏安圖作標(biāo)準(zhǔn)。我們用的蜂膠濃度范圍是20～250 ug/ml。

為了提高精確性，工作電極用0.05 uM的氧化鋁涂膠拋光，每個(gè)循環(huán)后用去離子水超聲清洗。伏安圖中電極波浪曲線下的總電荷(峰區(qū))用曲線擬合的方法估算。這種方法測(cè)得的樣品和對(duì)照物質(zhì)抗氧化活性的電極波浪曲線下的總電荷是相關(guān)的。結(jié)果用mg抗壞血酸當(dāng)量/g干物質(zhì)量表示。從每一圖表或測(cè)量值的電極波浪曲線下的總電荷減去背景信號(hào)的總電荷。

3.2 清除羥自由基能力測(cè)定法

對(duì)羥自由基清除能力的測(cè)定采用Fenton試劑(過氧化氫和硫酸亞鐵)，原理是以過氧化氫為氧化劑以Fe2＋為催化體系，所產(chǎn)生的經(jīng)自由基與結(jié)晶紫作用后使體系吸光度降低，利用吸光度值的變化間接測(cè)定所產(chǎn)生的羥自由基。

3.3 清除氧自由基能力測(cè)定法

清除氧自由基能力的測(cè)定主要利用某些體系如在氧化過程中有超氧陰離子自由基(O2-)的生成，O2-與某些化合物作用，產(chǎn)生有特定吸收波長(zhǎng)的有色物質(zhì)，利用分光光度計(jì)測(cè)定。蜂膠若能清除O2-，則吸光度發(fā)生變化，就能間接判斷蜂膠對(duì)超氧陰離子自由基(O2-)的清除作用。鄰苯三酚在堿性條件下迅速自氧化，自氧化過程中產(chǎn)生O2-，O2-又加速鄰苯三酚自氧化速率，同時(shí)產(chǎn)生有色中間物質(zhì)。有色中間產(chǎn)物的積累在滯后30～45 s與時(shí)間呈線性關(guān)系，一般維持4 min左右，隨后減慢。有色中間產(chǎn)物在325 nm處有強(qiáng)烈的光吸收。由于自氧化的速率依賴于O2-的濃度，消除O2-則抑制自氧化反應(yīng)，阻止中間產(chǎn)物的積累，從而評(píng)價(jià)蜂膠清除O2-的能力。

3.4 β-胡蘿卜素-亞油酸法

β-胡蘿卜素變色是廣泛使用的抗氧化分析方法主要評(píng)價(jià)的是蜂膠在乳化脂質(zhì)體系中的抗氧化能力，因?yàn)棣?胡蘿卜素對(duì)由自由基介導(dǎo)的氧化反應(yīng)極度的敏感。β-胡蘿卜素分子結(jié)構(gòu)中有11個(gè)共扼雙鍵，是一種多烯色素，在470 nm處有吸收峰，它易被氧化而褪去顏色。亞油酸酯的自氧化速度是油酸酪的10～40倍，更容易形成自由基。在反應(yīng)介質(zhì)溶液中，由亞油酸氧化產(chǎn)生的過氧化物能使β-胡蘿卜素褪色，隨時(shí)間的延長(zhǎng)，吸光度值越來越小。β-胡蘿卜素退色的程度與體系中物質(zhì)的抗氧化活性的強(qiáng)弱有關(guān)，抗氧化能力越強(qiáng)，吸光度值下降越慢。在評(píng)價(jià)蜂膠的抗氧化活性中，胡蘿卜素變色法也是常用的方法。

3.5 清除DPPH自由基法

評(píng)價(jià)蜂膠的抗氧化活性常采用清除DPPH自由基方法。DPPH自由基(二苯代苦味肼基自由基)是一種穩(wěn)定的以氮為中心的質(zhì)子自由基，其乙醇溶液呈紫色，在517 nm處有強(qiáng)烈吸收。在有自由基清除劑存在時(shí)，自由基清除劑提供一個(gè)電子與DPPH的孤對(duì)電子配對(duì)，而使其褪色，褪色程度與其接受的電子呈定量關(guān)系，在517 nm處的吸光度變小，其變化程度與自由基清除程度呈線形關(guān)系，即自由基清除劑的清除自由基能力越強(qiáng)，吸光度越小。DPPH自由基已被廣泛用于測(cè)試各種樣品的自由基清除活性。利用清除DPPH自由基方法評(píng)價(jià)抗氧化活性方法簡(jiǎn)單，因而被廣泛用于抗氧化活性篩選。但DPPH方法存在的不足是，DPPH既是氧化劑又是自由基指示劑，當(dāng)被測(cè)物與DPPH紫外吸收有交疊時(shí)，會(huì)影響測(cè)定結(jié)果。此外，DPPH的顏色雖然主要因單電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)消除，但也可以由氫轉(zhuǎn)移反應(yīng)消除。由于空間位阻決定反應(yīng)的傾向，因此小分子化合物由于更接近自由基而擁有相對(duì)較高的抗氧化能力。許多在體內(nèi)與過氧自由基發(fā)生快速反應(yīng)的抗氧化劑可能因空間位阻等原因不易與DPPH自由基反應(yīng)。同時(shí)，該方法的線性范圍也相對(duì)較窄。

3.6 ABTS陽離子脫色法

ABTS[2，2-連氮-雙(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)]陽離子脫色試驗(yàn)是一種廣泛用于評(píng)估各種物質(zhì)抗氧化活性的分光光度分析法。ABTS陽離子自由基的產(chǎn)生是通過ABTS原液與過硫酸鉀在室溫黑暗中反應(yīng)12～16 h而完成的。在供氫抗氧化劑出現(xiàn)的情況下，ABTS陽離子自由基將會(huì)減少。與其它幾種總抗氧化能力體外測(cè)定法相比，ABTS法快速、簡(jiǎn)便，與抗氧化劑的生物活性相關(guān)性強(qiáng)。但ABTS法本質(zhì)上是一種間接方法，是用來檢測(cè)物質(zhì)清除ABTS。這種自由基的能力，與真實(shí)的氧化分解沒有關(guān)系，它只是用TEAC值來表征測(cè)試樣品與經(jīng)氧化得到的ABTS反應(yīng)的能力而非阻斷該氧化過程，TEAC值在概念上類似于阻斷系數(shù)，并不是直接反應(yīng)被檢物質(zhì)的活力，所以要想較全面的判斷一種物質(zhì)的抗氧化能力還要結(jié)合其它的方法。

3.7 FRAP法

鐵還原抗氧化能力測(cè)試(FRAP法)評(píng)價(jià)蜂膠的抗氧化性原理為：Fe3+-三吡啶三吖嗪(TFTZ)可被蜂膠樣品中還原性物質(zhì)還原為二價(jià)鐵形式，呈現(xiàn)出明顯的藍(lán)色，并于593 nm處具有最大光吸收，根據(jù)吸光度的大小計(jì)算蜂膠抗氧化活性的強(qiáng)弱。FRAP反應(yīng)屬于單電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)，測(cè)定樣品離子還原能力與大多數(shù)抗氧化劑介導(dǎo)的自由基熄滅反應(yīng)有很大不同。因此，F(xiàn)RAP方法不能測(cè)定那些通過熄滅自由基(氫轉(zhuǎn)移反應(yīng))起作用的物質(zhì)，尤其是琉基和蛋白。該方法的另一缺陷是很多物質(zhì)發(fā)生氧化還原反應(yīng)的時(shí)間比較長(zhǎng)，所以選擇不同的反應(yīng)時(shí)間終點(diǎn)對(duì)結(jié)果影響很大。

3.8 ORAC法

氧化自由基吸收能力測(cè)定法(0RAC法)是目前抗氧化研究領(lǐng)域中備受關(guān)注的一種新的評(píng)價(jià)方法。該方法以偶氮類化合物AAPH作為過氧自由基來源，Sodium Fluorescein為熒光指示劑，維生素E水溶性類似物Trolox為定量標(biāo)準(zhǔn)，使用熒光微孔板分析儀進(jìn)行分析，可用來測(cè)定樣品清除ROO·、·OH等自由基的能力。該方法的專屬性、線性、精密度、準(zhǔn)確度及重復(fù)性等與其它抗氧化能力分析方法相比具有諸多顯著的優(yōu)點(diǎn)，但是該法的自動(dòng)化程序需要昂貴的全自動(dòng)生化分析儀，而手工操作程序費(fèi)時(shí)費(fèi)力，所以較難在國(guó)內(nèi)一般實(shí)驗(yàn)室推廣應(yīng)用。

4 蜂膠抗氧化活性的影響因素

4.1 蜂膠的種類、采集時(shí)間

蜂膠中各種化合物的含量隨著產(chǎn)地、采集的時(shí)間、樹種等因素的不同而變化。玄紅專等研究了不同產(chǎn)地蜂膠的抗氧化活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：產(chǎn)自阿根廷、澳大利亞、中國(guó)、匈牙利以及新西蘭的蜂膠醇提取液具有很強(qiáng)的抗氧化活性，并且抗氧化活性與其總酚酸類及黃酮類含量相關(guān)，其中主要的抗氧化組分為堪菲醇和咖啡酸苯乙酯[8]。Sforcin et al研究發(fā)現(xiàn)，季節(jié)對(duì)蜂膠的抗微生物活性及免疫特性沒有很大影響。但是在測(cè)定一年中按月收集的巴西蜂膠時(shí)發(fā)現(xiàn)，其抗氧化活性及酚類總含量都有很大不同。這一觀察結(jié)果和伊斯拉實(shí)驗(yàn)室的研究結(jié)果一直，同時(shí)chen也發(fā)表說蜂膠的抗氧化活性和它收集的季節(jié)有關(guān)。此外，以前的報(bào)道表明，季節(jié)對(duì)蜂膠的化學(xué)組成不會(huì)有很大影響，但是會(huì)影響蜂膠化學(xué)成分的量[9]。

Elena Gregoris等對(duì)4個(gè)采自威尼斯不同地形、人口密度地區(qū)的蜂膠樣品，通過分析脂質(zhì)過氧化抑制作用來評(píng)估蜂膠的抗氧化活性，確定蜂膠中決定其抗氧化活性的類黃酮和咖啡酸衍生物等多酚類物質(zhì)，通過Folin-Ciocalteu試劑、酶、DPPH清除、TEAC-like檢測(cè)、蜂膠的圖譜特征測(cè)定驗(yàn)證抗氧化活性和多酚類物質(zhì)之間的關(guān)系，驗(yàn)證每一主要成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)與抗氧化性的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：用脂質(zhì)過氧化抑制作用能力表達(dá)的蜂膠乙醇提取物抗氧化活性很高，其值與相同量的兒茶素類似；研究的酚類物質(zhì)都有較高的抗氧化性，它們的苯環(huán)結(jié)構(gòu)上都有兩個(gè)orto 羥基集團(tuán) (咖啡酸衍生物、槲皮素、兒茶素)。分子中苯環(huán)上僅有一個(gè)羥基集團(tuán)（芹菜素、柚皮素）或兩個(gè)meta 羥基集團(tuán)（松鼠素、白楊素）化合物的抗氧化性較小(脂質(zhì)過氧化抑制作用低于30%)，沒有兩個(gè)orto 羥基集團(tuán)的高良姜素、山奈酚的抗氧化性歸因于羥基連接在苯環(huán)C2-C3共軛雙鍵的C3上[10]。

4.2 蜂膠中黃酮類化合物的分子結(jié)構(gòu)

蜂膠中黃酮類化合物的種類很多，但并不是所有的都具有抗氧化活性，只有分子結(jié)構(gòu)滿足一定的條件時(shí)才能表現(xiàn)出較強(qiáng)的作用，其中最主要的是羥基化程度和羥基的位置，且一般認(rèn)為且一般認(rèn)為B環(huán)中的鄰-二羥基起著主要作用。分子中酚羥基的數(shù)目或位置不同，彼此間的極性也不同，利用這一特性可以選擇適當(dāng)極性的溶劑系統(tǒng)來提取抗氧化活性較高的成分。有研究表明乙醇濃度不同時(shí)對(duì)蜂膠抗氧化組分的提取率是相同的。

4.3 提取方法

蜂膠可以以粗膠、水提取物和醇提取物的形式被使用，有研究者認(rèn)為蜂膠的水提取物比醇提取物抗氧化效果好，且主要是由于其中咖啡酸和咖啡酸苯乙酯的含量高，其抗氧化活性也是由于這些成分能夠清除自由基，因而能阻止體內(nèi)嗜中性白細(xì)胞產(chǎn)生活性氧自由基和限制由超氧陰離子導(dǎo)致的過氧化脂質(zhì)的過量增加[7，11-12]。蜂膠水提取物多用于研究蜂膠對(duì)人體的醫(yī)療作用；作為食品添加劑研究和使用時(shí)多采用蜂膠的醇提取物。吉挺等研究了不同提取方法下蜂膠的抗氧化活性發(fā)現(xiàn)不同提取方法下蜂膠的抗氧化活性存在著差異，而醇提超臨界殘?jiān)哂休^好的抗氧化效果，有望開發(fā)利用[13]。Rajibul Arif Laskar[14]等研究了印度蜂膠的抗氧化活性及其化學(xué)成分發(fā)現(xiàn)：在所有的這些實(shí)驗(yàn)中，水提取物活性明顯高于乙醇提取物，這與先前其他地區(qū)蜂膠的報(bào)道相矛盾。這可能是由于它的高酚含量。因此水提取可能成為蜂膠有機(jī)溶劑萃取的替代品。此外，兩種黃酮、松屬素(1)和高良姜黃素(2)能從乙醇提取物中分離，而且高良姜黃素(2)有很高的DPPH自由基清除活性。因此，印度蜂膠作為一種富含天然抗氧劑的資源，可用于預(yù)防各種與自由基有關(guān)的疾病。

4.4 蜂膠的濃度

在一定范圍內(nèi)，蜂膠的抗氧化活性隨著蜂膠濃度的增加而增強(qiáng)。主要是因?yàn)榉淠z濃度增加時(shí)，抗氧化成分的濃度隨之增加，抗氧化活性在一定程度上得到增強(qiáng)。

4.5 作用的物質(zhì)

蜂膠對(duì)不同物質(zhì)的抗氧化活性存在著差異，蜂膠已廣泛的應(yīng)用于肉類和果蔬產(chǎn)品的保鮮，對(duì)不同的產(chǎn)品有不同的使用量和使用方法。蜂膠可以顯著延長(zhǎng)豬油、油炸核桃仁和色拉醬等高脂肪高營(yíng)養(yǎng)食品的酸敗，明顯延長(zhǎng)脂肪氧化酸敗的誘導(dǎo)期。在豬油上使用時(shí)，其抗氧化效果顯著好于相同量的沒食子酸丙酯；在用蜂膠處理核桃仁時(shí)，其抗氧化效果是相同濃度二丁基羥基甲苯（BHT）的1.8倍。同時(shí),采用先浸泡后油炸的方法比先油炸后浸泡的方法處理核桃仁更能充分發(fā)揮蜂膠的抗氧化作用[15]。

5 結(jié)論與展望

蜂產(chǎn)品具有很好的醫(yī)療與保健作用。蜂蜜在有些地方已作為藥用產(chǎn)品使用，并且有了一些產(chǎn)品如藥蜜。蜂毒也被制成制劑用于風(fēng)濕等疾病的治療。對(duì)于蜂膠的產(chǎn)品也有一定的開發(fā)，如蜂膠口噴劑，用于消炎等作用；還有蜂膠香皂等的產(chǎn)品。蜂膠的抗氧化作用還沒得到很好的開發(fā)，蜂膠作為食品抗氧化劑還有待于開發(fā)，一方面是蜂膠抗氧化劑的成本會(huì)相對(duì)較高，二是蜂膠抗氧化劑的制作工藝還有待開發(fā)，三是蜂膠作為藥用產(chǎn)品的研究還不是很多。我們要充分開發(fā)利用蜂膠的抗氧化性，這對(duì)于醫(yī)療保健、食品、化妝品等行業(yè)具有重要的意義。

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