人源化鼠嵌合肝動(dòng)物模型研究進(jìn)展

李瑞生，李曉娟，沈宏輝，郭立新

(1.解放軍第302醫(yī)院實(shí)驗(yàn)技術(shù)研究保障中心，北京 100039;2.北京大學(xué)首鋼醫(yī)院內(nèi)分泌科，北京 1000144)

人源化鼠嵌合肝動(dòng)物模型研究進(jìn)展

李瑞生1，李曉娟1，沈宏輝1，郭立新2

(1.解放軍第302醫(yī)院實(shí)驗(yàn)技術(shù)研究保障中心，北京 100039;2.北京大學(xué)首鋼醫(yī)院內(nèi)分泌科，北京 1000144)

動(dòng)物模型是人類疾病研究、發(fā)病機(jī)制、藥物研發(fā)的重要工具，對(duì)于困擾人類健康的肝臟疾病還沒有理想的動(dòng)物模型能有效地反映出人類疾病發(fā)病的機(jī)制。建立人源化鼠嵌合肝動(dòng)物模型，對(duì)于研究人類肝臟疾病的發(fā)病機(jī)制、疫苗和藥物的研發(fā)及疾病的診治等方面都具有十分廣闊的應(yīng)用前景。

鼠嵌合肝;肝細(xì)胞移植;干細(xì)胞移植;模型，動(dòng)物

人類動(dòng)物模型是醫(yī)學(xué)研究和藥物研發(fā)的重要支撐條件，尤其對(duì)肝病學(xué)的研究起著非常重要的作用，很多重要的肝病研究成果均來源于建立的各種各樣的動(dòng)物模型。但多數(shù)采用傳統(tǒng)方法復(fù)制的肝病動(dòng)物模型與人類在生理結(jié)構(gòu)、功能結(jié)構(gòu)和病理變化等方面存在許多差異，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果不能完全準(zhǔn)確地推導(dǎo)到人體，這樣就給人類肝病學(xué)的研究帶來許多不便。近年來人們采用人的原代肝細(xì)胞直接移植到模型動(dòng)物體內(nèi)形成人源化鼠嵌合肝動(dòng)物模型，它可以在模型動(dòng)物體內(nèi)來研究人的肝細(xì)胞功能、藥物代謝動(dòng)力學(xué)和嗜肝性病毒分型，并成為臨床前研究由模型動(dòng)物到人類之間的一種重要載體和橋梁［1］。本文就人源化鼠嵌合肝的相關(guān)研究進(jìn)行探討。

1 移植細(xì)胞

1.1 干細(xì)胞

人干細(xì)胞是一類具有無限期自我更新能力，能在體外長期培養(yǎng)、高度未分化的全能干細(xì)胞系。在適當(dāng)條件刺激下可分化為各種類型的細(xì)胞。干細(xì)胞具有自我更新和自我維持能力，具有多分化潛能，具有生理性的更新能力、對(duì)損傷的修復(fù)能力和特定的微環(huán)境等特點(diǎn)［2］。干細(xì)胞的研究在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行能更真實(shí)地反映其表型和分化特點(diǎn)。干細(xì)胞移植要求動(dòng)物具有免疫缺陷或免疫耐受，不易發(fā)生免疫逃逸，已植入的人干細(xì)胞才能在宿主內(nèi)生長或形成嵌合體。

1.2 成熟肝細(xì)胞

成熟肝細(xì)胞移植后可呈克隆樣生長，但必須在肝臟受到中度損傷時(shí)才可以進(jìn)行自身復(fù)制，一般為一到兩個(gè)周期。使用成熟肝細(xì)胞比其他肝細(xì)胞更方便、更容易獲得，如果采用在胚胎期建立免疫耐受鼠進(jìn)行成熟肝細(xì)胞移植，將大大增加其移植成活率。

1.3 胚胎肝細(xì)胞

胚胎期的肝細(xì)胞具有很強(qiáng)的分化增殖能力，能夠抵御損傷，對(duì)許多激素和生長因子的誘導(dǎo)更加敏感［3］。早期、原始的胚胎干細(xì)胞(ES)增殖分化能力則更強(qiáng)于成熟肝細(xì)胞，更適易于進(jìn)行肝細(xì)胞的移植。但胚胎肝細(xì)胞移植的研究大多集中于胚胎肝細(xì)胞移植后的功能表達(dá)，并未對(duì)胚胎肝細(xì)胞脾內(nèi)移植后的增殖變化規(guī)律進(jìn)行系統(tǒng)分析。

1.4 永生化肝細(xì)胞

肝細(xì)胞永生化是指體外培養(yǎng)的肝細(xì)胞經(jīng)過自發(fā)或受外界因素的影響從增殖衰老危機(jī)中逃逸，從而具有無限增殖能力的過程。人肝細(xì)胞雖在體內(nèi)有極強(qiáng)的增殖能力，但在體外培養(yǎng)時(shí)增殖困難。因此肝細(xì)胞自發(fā)永生化的幾率很小，通常要通過基因轉(zhuǎn)染，誘導(dǎo)衰老相關(guān)基因突變等方法來獲得細(xì)胞的“永生性”，以達(dá)到永生化的目的。目前應(yīng)用最多的是SV40 T抗原基因轉(zhuǎn)染的永生化肝細(xì)胞［4］。

1.5 臍血干細(xì)胞

人臍帶血來源豐富、且富含人臍血干細(xì)胞(hUCBSCs)，臍血干細(xì)胞在誘導(dǎo)因子作用下可分化為肝細(xì)胞，用于終末期肝病的治療。臍血干細(xì)胞的含量高于骨髓，在鼠體內(nèi)可以自分泌方式提供自身某些生長因子，促進(jìn)自身增殖分化是比較理想的造血干細(xì)胞來源［5］。

2 受體鼠

選擇適當(dāng)?shù)囊浦布?xì)胞同時(shí)也應(yīng)選擇適易的受體鼠才能形成好的人源化嵌合肝動(dòng)物模型。由于肝細(xì)胞種屬的不同，移植后會(huì)受到受體鼠免疫系統(tǒng)的排斥。因此，應(yīng)選擇具有免疫缺陷或誘導(dǎo)免疫耐受的鼠作為受體鼠。

2.1 免疫缺陷轉(zhuǎn)基因小鼠

尿激酶纖維蛋白溶酶原活化子(uPA)轉(zhuǎn)基因小鼠:該鼠比正常小鼠的凝血時(shí)間長，血漿尿激酶型血漿素原激活劑活動(dòng)度高，因此可致宿主肝細(xì)胞的損傷、肝功能缺陷，最終導(dǎo)致死亡。uPA轉(zhuǎn)基因小鼠與免疫缺陷背景(與SCID或RAG2小鼠雜交)小鼠結(jié)合后可作為人肝細(xì)胞移植的模型。Dandri M等［6］把人肝細(xì)胞移植 uPA/RAG-2轉(zhuǎn)基因鼠脾臟內(nèi)，肝細(xì)胞會(huì)經(jīng)血液流進(jìn)肝臟而形成人源化嵌合肝鼠。而Brass V等［7］是把人肝細(xì)胞移植到SCID-AlbuPA轉(zhuǎn)基因雜交純合子鼠脾臟中(Alb-uPA轉(zhuǎn)基因鼠×聯(lián)合免疫缺陷鼠(Cb-17/SCID/bg)雜交)，建立了人源化嵌合肝鼠。延胡索酰乙酰乙酸水解酶(Fah)基因剔除小鼠由于Fah的缺失，酪氨酸代謝受阻，導(dǎo)致酪氨酸在體內(nèi)蓄積，而造成肝損傷［8］。Fah－/－純合子小鼠存在廣泛而持續(xù)的肝損傷，特別適合于移植細(xì)胞的再殖，是比較理想的肝臟再殖模型。

2.2 誘導(dǎo)免疫耐受大鼠

誘導(dǎo)免疫耐受大鼠的建立，主要在胚胎發(fā)育期通過采用人的胎肝細(xì)胞來誘導(dǎo)胎鼠對(duì)其產(chǎn)生免疫耐受，然后再把人的肝細(xì)胞植入受體鼠肝臟內(nèi)，來建立免疫耐受大鼠動(dòng)物模型［9］。該模型對(duì)多種肝炎致病因子易感，可進(jìn)行已知和未知肝炎致病因子的研究。Ouyang EC 等［10］和蔣黎［11］均采用類似方法建立了大鼠的人鼠嵌合肝動(dòng)物模型，且在大鼠肝臟中檢測(cè)到人肝臟的各種指標(biāo)，還具有人肝臟的生物學(xué)功能，說明該模型能成功復(fù)制。

3 建立人源化鼠嵌合肝的途徑與方法

肝細(xì)胞移植的途徑主要有脾內(nèi)、門靜脈、腹腔內(nèi)、皮下和肌肉等，其效果最佳的是經(jīng)脾內(nèi)和門靜脈內(nèi)移植［12］。主要是由于脾紅髓的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組織有利于細(xì)胞之間的相互作用和門靜脈血營養(yǎng)豐富，使得肝細(xì)胞植入受體鼠后，可表達(dá)Alb、酶及膽汁代謝。其分化、增殖潛能既受自身特性及活性影響，又受到受體鼠肝內(nèi)環(huán)境的影響。

4 建立人源化嵌合肝鼠動(dòng)物模型的關(guān)鍵

實(shí)驗(yàn)證明移植肝細(xì)胞可在人源化嵌合鼠肝中存活，但存活時(shí)間較短，因此，如何來提高肝細(xì)胞的增殖能力及存活時(shí)間，是今后研究人鼠嵌合肝動(dòng)物模型亟待解決的關(guān)鍵問題［13］。

4.1 提高肝細(xì)胞的活性及數(shù)量

移植肝細(xì)胞多采用凍存復(fù)蘇后的細(xì)胞，這就要求在解凍過程中速度要快來保持細(xì)胞的質(zhì)量，為了保證肝細(xì)胞的質(zhì)量，在凍存前可將肝細(xì)胞貼于微載體，目的是為了防止貼壁，這樣可明顯提高肝細(xì)胞凍存復(fù)蘇后的活性和數(shù)量［14］。

4.2 增加接種次數(shù)提高成活率

脾內(nèi)移植的肝細(xì)胞數(shù)量因動(dòng)物種屬不同而存在差異，植入肝細(xì)胞的數(shù)量也非常關(guān)鍵，如移植過多也會(huì)引起肝功能的損害造成肝細(xì)胞活性降低。Rajvanshi P等［15］采用分3次可達(dá)到宿主肝細(xì)胞量15%的肝細(xì)胞植入鼠脾內(nèi)，結(jié)果顯示并沒有影響到移植肝細(xì)胞與受體鼠肝實(shí)質(zhì)的結(jié)合，這樣就大大提高了移植細(xì)胞的成活率。

4.3 誘導(dǎo)移植細(xì)胞增殖

移植細(xì)胞在鼠肝內(nèi)要大量增殖需要抑制宿主細(xì)胞增殖，同時(shí)要增加移植細(xì)胞的生長優(yōu)勢(shì)。由于受體鼠內(nèi)缺乏移植肝細(xì)胞生長所需的各種生長因子及營養(yǎng)激素，使得植入的肝細(xì)胞在體內(nèi)增殖困難。對(duì)移植肝細(xì)胞的增殖，可采用手術(shù)、聯(lián)合細(xì)胞移植、應(yīng)用外源性激素、轉(zhuǎn)基因肝細(xì)胞移植和化學(xué)性肝損傷等外源性刺激來誘導(dǎo)［16］。而再生刺激不僅對(duì)抑制細(xì)胞有加速增殖作用，對(duì)宿主細(xì)胞也具有同樣的作用，因此應(yīng)先使用生物堿、絲裂霉素和放射線等措施來抑制受體鼠肝細(xì)胞的增殖，然后再進(jìn)行外源性刺激，這樣可大大提高移植肝細(xì)胞在體內(nèi)的增殖［17］。

4.4 移植肝細(xì)胞的檢測(cè)與鑒定

移植肝細(xì)胞在受體鼠內(nèi)是否成活可采用免疫組化技術(shù)、Western印跡技術(shù)和RT-PCR檢測(cè)技術(shù)來檢測(cè)受體鼠肝組織中人的肝細(xì)胞角蛋白(CK18)、人Alb和人Alb mRNA，檢測(cè)鼠肝組織基因組人特異性Alu序列。其檢測(cè)結(jié)果完全能反映人肝細(xì)胞在鼠肝組織中的表達(dá)，提示該模型建立的質(zhì)量。鼠肝體內(nèi)發(fā)育成活的移植肝細(xì)胞通常采用定量和標(biāo)記技術(shù)來鑒定。細(xì)胞光度測(cè)量技術(shù)可以鑒定移植肝細(xì)胞的數(shù)量和特性，并在此基礎(chǔ)上分離移植的肝細(xì)胞;而標(biāo)記鑒定技術(shù)主要借助熒光顯微鏡，更直觀更清晰地對(duì)人肝細(xì)胞與受體肝細(xì)胞進(jìn)行分析鑒定［18］。

5 應(yīng)用前景

人鼠嵌合肝動(dòng)物模型的成功建立，不僅可進(jìn)行人類嗜肝病毒、病毒性肝炎等肝病方面的研究，還可用以比較人和嚙齒類動(dòng)物肝細(xì)胞在代謝途徑、速度、代謝產(chǎn)物上的差異，評(píng)估人源化鼠肝的代謝狀況，而且對(duì)肝臟細(xì)胞生物學(xué)理論的研究及重大肝病的臨床診治都具有十分重要的意義。雖然目前人源化鼠嵌合肝細(xì)胞的存活時(shí)間較短，其移植肝細(xì)胞的成活率僅占15%，但是如何改進(jìn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、提高嵌合肝中人肝細(xì)胞的比例、產(chǎn)生足夠?qū)嶒?yàn)用的異種肝內(nèi)人肝細(xì)胞群、完善對(duì)人鼠嵌合肝的檢測(cè)手段和人鼠嵌合肝動(dòng)物模型，最終能夠達(dá)到完全用于人肝細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)重建人肝組織是今后研究的重點(diǎn)，這將對(duì)人類肝病的治療具有非常好的應(yīng)用前景。

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Research Progression of Establishment of Animal model of Tolerant Rats with Chimeric Human Liver

LI Rui-sheng1，LI Xiao-juan1，SHEN Hong-hui1，GUO Li-xin2
(1.Experimental Research Support Center，302 Hospital of PLA，Beijing 100039，China;2.Peking University Shougang Hospital endocrine department，Beijing 100144，China)

Animal model is an important instrument for human diseases research，pathogenesis，medicine research.At present，liver diseases still damage human healthy seriously because there are no proper animal models to effectively reflect procedures of human diseases.Therefore establishment of animal model of tolerant rats with chimeric human liver will have extensive application prospects for pathogenesis of human liver diseases，vaccine and medicine exploitation and treatment of human liver diseases.

Mice chimeric liver;Hepatocyte transplantation;Stem cell transplantation;Model，animal

R332

A

1671-7856(2012)07-0072-03

10.3969.j.issn.1671.7856.2012.007.018

2012-07-06

李瑞生(1969－)，男，副研究員，博士，研究方向:主要從事實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳監(jiān)測(cè)與模型研究，E-mail:lrsheng@sohu.com。

李瑞生。