裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)中常見問題的解析和總結(jié)

趙 勇，伍 靜，毛峰峰，趙善明，張彩琴，白 冰，師長宏

(第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，西安 710032)

裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)中常見問題的解析和總結(jié)

趙 勇，伍 靜，毛峰峰，趙善明，張彩琴，白 冰，師長宏

(第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，西安 710032)

目的 探討裸鼠荷瘤過程中的出現(xiàn)的常見問題，提高裸鼠荷瘤的成功率。方法 通過分析實(shí)驗(yàn)過程中影響裸鼠荷瘤的各種因素，尋求裸鼠荷瘤常見問題的解決方案。結(jié)果 總結(jié)了在裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)中的各種影響因素，并提出了合理的建議。結(jié)論 裸鼠腫瘤模型的制備是研究腫瘤學(xué)、免疫學(xué)、藥品與生物制品的安全性評(píng)價(jià)以及有效性篩選等研究課題的基礎(chǔ)，本文為制備良好的裸小鼠腫瘤模型提供合理的建議。

裸鼠;腫瘤;模型，動(dòng)物

無胸腺裸鼠(outbred nude mice)是當(dāng)今醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究領(lǐng)域中不可缺少的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。特別是在腫瘤學(xué)、免疫學(xué)、藥品與生物制品的安全性評(píng)價(jià)及有效藥品的篩選等實(shí)驗(yàn)方面，有著特殊的價(jià)值。隨著現(xiàn)代免疫學(xué)的發(fā)展，明確指示了胸腺為中樞性免疫器官，并進(jìn)一步揭示了胸腺和胸腺依賴淋巴細(xì)胞(T細(xì)胞)的功能，開創(chuàng)了細(xì)胞免疫的新途徑。而無胸腺裸鼠無疑成為了研究者最受歡迎的實(shí)驗(yàn)材料。

由于裸鼠的免疫缺陷，在一定情況下，不排斥來自異種動(dòng)物的組織移植。因此成為移植人類腫瘤的接受體。根據(jù)T.Fogh等的報(bào)導(dǎo)，已有150株人瘤細(xì)胞和人體原發(fā)癌移植于裸鼠獲得成功，目前已成功將結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、黑色素瘤、淋巴瘤、白血病、腎癌、宮頸癌、軟組織肉瘤和骨肉瘤等移植于裸鼠、獲得了良好生長，并可傳代。若用已建株的人體腫瘤組織培養(yǎng)細(xì)胞作移植材料，接種后的成活率更高。利用裸鼠進(jìn)行腫瘤造模實(shí)驗(yàn)研究是一個(gè)相對(duì)成熟的技術(shù)，但由于諸多的影響因素不被我們所重視，在實(shí)驗(yàn)過程中造成不必要的時(shí)間和材料的浪費(fèi)。所以我們通過分析和總結(jié)裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)中的常見問題，提供一些建議，供大家參考和討論。

1 制備腫瘤模型的意義

腫瘤已成為當(dāng)前威脅人類最嚴(yán)重的常見病之一，每年死于腫瘤的人數(shù)以百萬計(jì)，因此，利用裸鼠建立腫瘤模型，進(jìn)行防治研究，是基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中重要課題。一般來說，裸鼠人類惡性腫瘤抑制具有幾個(gè)典型的特點(diǎn)，首先，被移植腫瘤仍保持原有組織學(xué)構(gòu)成或各種機(jī)能。再則，人癌組織的組織培養(yǎng)物移種于裸鼠時(shí)，能重現(xiàn)已在組織培養(yǎng)中消失的原有的癌結(jié)構(gòu)。同時(shí)，幾乎很少發(fā)現(xiàn)被移植腫瘤的轉(zhuǎn)移。這些特征有利于分析腫瘤的性質(zhì)，例如:裸鼠體內(nèi)免疫缺陷機(jī)制恒定，決定其不需通過去免疫方法處理動(dòng)物;可以控制腫瘤的致癌性，使人體腫瘤移植后良好生長;裸鼠接種成功的腫瘤具有原腫瘤的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，有利于體外培養(yǎng)的瘤細(xì)胞株的鑒定;研究腫瘤在體內(nèi)的生長行為與過程，探討腫瘤與宿主免疫間的相互關(guān)系;體內(nèi)和體外研究互補(bǔ)配合進(jìn)行觀察。利用建立的裸鼠腫瘤模型，進(jìn)行藥物篩選;在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行連續(xù)接種傳代后的腫瘤細(xì)胞，在體外培養(yǎng)中也易于獲得長期生存，可提高培養(yǎng)的成功率等。因此，裸鼠在腫瘤研究中的應(yīng)用，將對(duì)腫瘤基礎(chǔ)研究工作做出新的貢獻(xiàn)。而利用裸鼠制備腫瘤模型是最基礎(chǔ)的環(huán)節(jié)，也直接關(guān)系到后期實(shí)驗(yàn)研究的成敗和進(jìn)度。

2 影響裸鼠荷瘤的因素

2.1 細(xì)胞株的選擇

腫瘤細(xì)胞株的選擇對(duì)裸鼠成瘤具有直接關(guān)系，各類文獻(xiàn)中提到的細(xì)胞株相對(duì)較多，但是一般情況下，并非所有的細(xì)胞株都具有較好的成瘤性［1］。我們認(rèn)為，細(xì)胞株的選擇應(yīng)充分考慮幾個(gè)方面;首先該細(xì)胞株的國際公認(rèn)度，雖然國家食品藥品監(jiān)督管理局(SFDA)的指導(dǎo)原則上表示只要是建株的細(xì)胞株均可以成瘤［2］，但一般情況下，我們盡可能的選用國際上比較公認(rèn)的細(xì)胞株建模。其次，很多細(xì)胞株在文獻(xiàn)中有較多的報(bào)道，但在實(shí)際應(yīng)用中，有許多細(xì)胞株基本都是從體外開始進(jìn)行研究，所以我們需充分考慮細(xì)胞株在動(dòng)物體內(nèi)的生長情況，例如我們常見的A549和 MCF-7，其在體內(nèi)并不是一個(gè)好的研究對(duì)象，其成瘤率低［3］，生長緩慢，且均一性較差，并不適合用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。如果我們?nèi)狈@方面相關(guān)的認(rèn)識(shí)，不僅會(huì)造成實(shí)驗(yàn)材料的浪費(fèi)，還會(huì)耽誤寶貴的時(shí)間。再則，有許多的裸鼠腫瘤模型是用于抗腫瘤藥物的篩選以及相關(guān)研究的，我們通常情況下會(huì)選擇成瘤效果好的細(xì)胞株進(jìn)行造模，但常常忽略了該腫瘤細(xì)胞株本身對(duì)藥物的敏感性，例如常見的Lovo細(xì)胞，國際公認(rèn)度相對(duì)較高，體內(nèi)生長情況也比較理想，但是該細(xì)胞株對(duì)于藥物的敏感性比較差［4］，大部分的常規(guī)化療藥對(duì)其的抑瘤率都會(huì)下降，如果做腫瘤藥物篩選來說，我們需要避免這樣的細(xì)胞株進(jìn)行裸鼠腫瘤模型的制備。

因此，我們建議在利用裸鼠開展腫瘤造模的實(shí)驗(yàn)中，要充分的考慮該細(xì)胞株的體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)特性，進(jìn)而選擇理想的細(xì)胞株開展實(shí)驗(yàn)研究。一般來說，體外實(shí)驗(yàn)可供選擇的細(xì)胞株相對(duì)較多，如果不能充分考慮后期的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，其后期的研究相對(duì)會(huì)很被動(dòng)。所以在選擇細(xì)胞株造模時(shí)，充分考慮研究的方向以及我們需要的靶點(diǎn)就顯得尤為必要。

2.2 裸鼠的狀態(tài)

裸鼠的狀態(tài)和荷瘤有著較為緊密的關(guān)系。首先是裸鼠的年齡，比如4～6周比8周以上容易成瘤，這時(shí)免疫系統(tǒng)不夠強(qiáng)，所以成瘤率相對(duì)較高;此外，如果裸鼠由于試驗(yàn)系統(tǒng)染菌而長毛或感染，成瘤率也會(huì)受到影響。這種表現(xiàn)有較多的因素構(gòu)成，最典型的如牛棒狀桿菌感染裸鼠，該細(xì)菌是一種常見的大棒狀桿菌，免疫功能正常的大小鼠一般不會(huì)長期攜帶，但對(duì)免疫缺陷鼠致病，一旦感染，幾乎是終身性的［5］。主要表現(xiàn)為身體長“白色鱗屑”，該癥狀會(huì)在14～20 d后消失，但是病毒的感染和排毒至少要持續(xù)30 d以上，此時(shí)動(dòng)物表現(xiàn)為體重減輕、攝水量增加、異種移植物生長緩慢、對(duì)化療的敏感性增加等。

此外，鼠肝炎病毒，是裸鼠的致命性傳染病，一旦感染，將會(huì)造成大面積的死亡［6］，只能處死該動(dòng)物房所有的動(dòng)物并用甲醛熏蒸消毒才能有效的控制病毒的蔓延。正常的大小鼠對(duì)鼠肝炎病毒不敏感，經(jīng)常帶毒正常生長，但是裸鼠對(duì)其反應(yīng)及其敏感，一般最基本的傳染源就是來自于普通大小鼠的直接或者間接接觸。因此，裸鼠的飼養(yǎng)必須是獨(dú)立的飼養(yǎng)單元，避免和大小鼠直接或間接接觸。人員的混亂，房間內(nèi)物品、籠具、垃圾等的交叉污染都可能是傳染源，一般感染后3～4周發(fā)病死亡，在此之前，得病動(dòng)物會(huì)出現(xiàn)突然消瘦，弓背等癥狀，然后由少到多出現(xiàn)大批死亡，尸檢會(huì)發(fā)現(xiàn)肝臟明顯病變，布滿白色或黃色的節(jié)結(jié)，而且到后期整個(gè)肝臟都幾乎纖維化，非常典型的癥狀。如果處死已染病但還沒有明顯癥狀的動(dòng)物并尸檢揮發(fā)現(xiàn)肝臟有明顯病變，且癥狀很像肝轉(zhuǎn)移的腫瘤。

裸鼠的飼養(yǎng)要求必須是在SPF環(huán)境條件下，但如果環(huán)境設(shè)施的無菌等項(xiàng)目不達(dá)標(biāo)，裸鼠長期暴露在弱抗原的刺激中，NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞的活性逐步增強(qiáng)，會(huì)導(dǎo)致裸鼠對(duì)腫瘤的非特異性免疫力增強(qiáng)，進(jìn)而影響腫瘤模型的制備。所以，對(duì)裸鼠飼養(yǎng)單位的環(huán)境指標(biāo)控制是保證裸鼠健康狀態(tài)的最基本也是最直接的控制方式。我們建議在SPF條件下配合IVC獨(dú)立通風(fēng)籠具飼養(yǎng)裸鼠，且相關(guān)實(shí)驗(yàn)也在超凈工作臺(tái)開展，不僅對(duì)裸鼠進(jìn)行雙重保障，而且避免裸鼠之間的交叉感染，這種方式將是排除外來生物因素干擾的最直接的方式。

此外，也有人預(yù)先用放射線照射進(jìn)而進(jìn)一步抑制裸鼠的免疫功能再接種的方法，對(duì)此我們不推薦，但在必需時(shí)也是可以嘗試的。

2.3 細(xì)胞狀態(tài)

腫瘤細(xì)胞的接種，要充分考慮到腫瘤細(xì)胞的來源、分化程度、以及活力，生長狀態(tài)，是否在對(duì)數(shù)生長期，有無污染等相關(guān)的因素。一般來說，腫瘤細(xì)胞可以懸浮在相應(yīng)的無血清培養(yǎng)基、PBS、saline中，接種效果依次降低。也有人用matrigel和腫瘤細(xì)胞混勻進(jìn)而造模［7］，我們認(rèn)為并無必要，matrigel是一種促進(jìn)腫瘤形成生長的手段，如果腫瘤生長不是特別困難不建議用它，但是一些比如A549之類的細(xì)胞株，接種后兩個(gè)月還只有600～700mm3的腫瘤，就可以考慮使用matrigel。使用matrigel的時(shí)候要注意低溫操作，因?yàn)槭覝叵?matrigel就有可能固化。一般是在冰浴中操作比較合適。

2.4 細(xì)胞接種量

細(xì)胞的接種量直接關(guān)系的腫瘤的成瘤效果，一般動(dòng)物源性腫瘤接種2～6×106/site即可成瘤，而人源性腫瘤細(xì)胞則需要107級(jí)細(xì)胞才能形成相對(duì)理想的腫瘤［8］。但最好通過查閱文獻(xiàn)來確定接種量。在找不到任何相關(guān)資料的情況下，最高可用到1×107/0.2mL/site，再加大細(xì)胞量就沒有太多的意義。如果細(xì)胞很小，也可以采用1×107/0.1mL/site操作，不至于很粘稠。除此之外，我們?cè)诮臃N之前任需查閱文獻(xiàn)，看他們的構(gòu)建條件是什么樣的，比如培養(yǎng)條件，接種量，接種位置以及裸鼠的性別等。

在我們的實(shí)驗(yàn)中，也經(jīng)常會(huì)發(fā)現(xiàn)有的腫瘤細(xì)胞株接種裸鼠后，其生長速度很快。這種情況下，我們就需要根據(jù)情況調(diào)整一個(gè)合適的濃度，一個(gè)理想的裸鼠腫瘤模型我們認(rèn)為有應(yīng)該具備幾個(gè)特征:其一，接種后10～15 d左右即可開始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，如果造模周期太短，生長速度也會(huì)被加快，腫瘤可能很快就潰爛了，這樣就不得不被迫中止實(shí)驗(yàn)，而用藥卻沒有用到足夠的時(shí)間，藥效還沒有發(fā)揮出來就結(jié)束了，這樣是很不利的。所以一般情況下，應(yīng)該盡量的復(fù)合這個(gè)瘤株本身的生長特性，不應(yīng)該過多地去加以人為的干擾;其二，開始試驗(yàn)時(shí)可以用于試驗(yàn)的動(dòng)物數(shù)不少于60%～70%，而且SD不大于平均值的1/3左右;第三，開始試驗(yàn)3～4周后腫瘤重量大于1 g，并且沒有潰爛。但如果在高數(shù)量級(jí)的腫瘤細(xì)胞都未能成功造模的情況下，就沒有必要堅(jiān)守這種的觀點(diǎn)。

2.5 接種部位

一般情況下，裸鼠腫瘤細(xì)胞株接種首選腋窩中部外側(cè)皮下。接種時(shí)由裸鼠體側(cè)腰部稍靠上的部位進(jìn)針，要保證與接種點(diǎn)的距離小于針頭的長度，向頭部穿行，避免刺破皮膚或者刺破肌肉層，當(dāng)針頭到達(dá)接種位點(diǎn)時(shí)注射，退出針頭，這樣操作的目的并不完全是避免漏液，主要是避免污染，進(jìn)針點(diǎn)還有少量污染的可能性的，針頭在皮下穿行一段后，接種點(diǎn)離進(jìn)針點(diǎn)較遠(yuǎn)，可最大限度減少污染的可能。

在正式實(shí)驗(yàn)研究中，我們建議一只老鼠只能接種一個(gè)位點(diǎn)，因?yàn)橐粋€(gè)裸鼠身上如有多于一個(gè)腫瘤，可能會(huì)相互影響。接種腫瘤細(xì)胞時(shí)，皮膚不用繃得太緊，平展即可，接種的進(jìn)針點(diǎn)盡可能的靠下，針頭在皮下走一段后再注射，速度不易太快。注射前針頭稍微動(dòng)一動(dòng)，明確針頭在皮下，否則可能在皮內(nèi)或者肌肉內(nèi)。

2.6 手術(shù)標(biāo)本的荷瘤

SFDA的臨床前指導(dǎo)原則明確指出要用建株的腫瘤株進(jìn)行試驗(yàn)［2］，所以，如果是藥效學(xué)方面的實(shí)驗(yàn)研究，一般不宜使用手術(shù)標(biāo)本進(jìn)行腫瘤模型的制備。因?yàn)橛檬中g(shù)標(biāo)本的試驗(yàn)可重復(fù)性太差，其保存條件受到限制，一旦保存的腫瘤組織死亡，就很難重復(fù)出以前的試驗(yàn)結(jié)果。國外的文獻(xiàn)上基本沒有用手術(shù)標(biāo)本進(jìn)行建模開展實(shí)驗(yàn)研究的。對(duì)手術(shù)腫瘤標(biāo)本的取材，我們一般選擇腫瘤生長活躍，狀態(tài)良好，結(jié)締組織比較少的地方。對(duì)腫瘤組織的運(yùn)輸主要是保證無菌，其次是冰浴保溫，無菌培養(yǎng)液浸泡，時(shí)間不宜超過1 h。最好在一個(gè)小時(shí)內(nèi)完成動(dòng)物的接種。接種部位一般選擇腹外側(cè)皮下。此外，對(duì)手術(shù)標(biāo)本荷瘤的方法，我們也不能保證取得的標(biāo)本一定能夠順利地成瘤并且用于實(shí)驗(yàn)研究。

2.7 腫瘤的倍增時(shí)間

William等［9］認(rèn)為結(jié)節(jié)的體積變化百分?jǐn)?shù) PVC=100*(V2-V1)/V1，PVC代表前后兩次體積 V1、V2的差值百分比，包括部分容積效應(yīng)、分割指數(shù)、偽影以及結(jié)節(jié)很輕微但是確實(shí)存在的體積變化所造成的影響，對(duì)于首次普查檢測到或偶然查出的結(jié)節(jié)，DTt等于400 d，因?yàn)樗咏L最慢的結(jié)節(jié)的倍增時(shí)間;動(dòng)物腫瘤實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷谋对鰰r(shí)間，應(yīng)該是在瘤體積100～800之間計(jì)算，Aoki等［10］將結(jié)節(jié)倍增時(shí)間的計(jì)算公式表示為:DTt=(ln 2△t)/ln(V2/V1)，V1、V2分別是前后兩次測量的體積，Δt是兩次測量的時(shí)間間隔。通過該公式，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤倍增時(shí)間的計(jì)算，進(jìn)而設(shè)計(jì)和優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方案。

3 討論

人體腫瘤移植于免疫缺陷動(dòng)物，能保持其生物學(xué)特性，用于研究人體腫瘤對(duì)藥物的敏感性有很大幫助。早期的研究工作是將人體腫瘤移植到動(dòng)物缺乏免疫機(jī)能的特殊部位，如雞胚、動(dòng)物的眼前房，倉鼠頰囊內(nèi)等，雖有一定比例的成活率，但因腫瘤生長緩慢又受移入部位包膜的限制，腫塊往往較小，難于傳代，更不能適應(yīng)需要較多瘤源的實(shí)驗(yàn)治療工作。隨著免疫缺陷裸鼠的發(fā)現(xiàn)，為腫瘤學(xué)、免疫學(xué)、藥品與生物制品的安全性評(píng)價(jià)及有效藥品的篩選等實(shí)驗(yàn)方面的研究提供了難得的工具。雖然裸鼠腫瘤模型的制備是一個(gè)相對(duì)簡單的過程，但其中的的一些因素會(huì)直接影響到我們實(shí)驗(yàn)的進(jìn)展，我們通過實(shí)踐總結(jié)了影響裸鼠荷瘤效果的諸多因素，重點(diǎn)分析了接種裸鼠腫瘤細(xì)胞系的選擇;裸鼠的狀態(tài);細(xì)胞的狀態(tài)，接種裸鼠的細(xì)胞量和接種部位等方面對(duì)裸鼠荷瘤的影響。

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Summarize of the Common Problem and the Experience of Tumor-burdened in Nude-mice

ZHAO Yong，WU Jing，MAO Feng-feng，ZHAO Shan-min，ZHANG Cai-qin，BAI Bing，SHI Chang-hong
(Laboratory Animal Center of Fourth Military Medical University，Xi'an 710032，China)

Objective Discussion the common problem of tumor-burdened in node-mice，In order to improve the success rate of tumor burden.Method Through analysis the influence of various factors of tumor-burden in node-mice，seek the solution of problem in tumor burdended.Result Summarized the various factors in the tumor burden，and put forward reasonable suggestions.Conclusion Node-mice tumor burden is the base of the oncology，drug and biological products of safety evaluation and effectiveness screening.This paper is to provide reasonable suggestions for the preparation of good nude mice tumor model.

Nude mice;Tumor;Model，animal

Q95-331;R332

A

1671-7856(2012)07-0017-04

10.3969.j.issn.1671.7856.2012.007.005

2012-07-05

趙勇，(1982－)男，主要從事實(shí)驗(yàn)動(dòng)物疾病模型制備;E-mail:zhaoy_mail@yahoo.com.cn。

師長宏，博士，副教授，主要研究方向:動(dòng)物疾病模型;E-mail:changhong@fmmu.edu.cn。