大、小鼠微生物檢測質(zhì)量控制探討

白 冰，張 海，毛峰峰，趙 勇，張彩勤，趙善民，師長宏

(第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，西安 710032)

大、小鼠微生物檢測質(zhì)量控制探討

白 冰，張 海，毛峰峰，趙 勇，張彩勤，趙善民，師長宏

(第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，西安 710032)

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量直接影響科研數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，通過定期微生物檢測，可對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量進(jìn)行控制，因此對(duì)檢測結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制是對(duì)檢測工作進(jìn)行日常管理和監(jiān)督的有效和必要的手段。實(shí)驗(yàn)室通過總結(jié)近年檢測工作經(jīng)驗(yàn)，對(duì)微生物檢測質(zhì)量控制工作進(jìn)行探討，為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測提供相關(guān)資料。

大鼠;小鼠;檢測;質(zhì)量控制

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是生命科學(xué)研究的基礎(chǔ)和重要支撐條件，標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和優(yōu)良的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)條件是進(jìn)行醫(yī)藥衛(wèi)生研究的基礎(chǔ)。在生命科學(xué)研究中，不能用人去做實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物作為人類的替身承擔(dān)藥物的安全評(píng)價(jià)和效果試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的質(zhì)量直接決定著藥品的安全和生命科學(xué)研究結(jié)果的準(zhǔn)確性。隨著我國科研水平的不斷提高，研究人員對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的質(zhì)量要求也越來越嚴(yán)格，鑒于此，本文根據(jù)當(dāng)前實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測工作的開展和重要性，結(jié)合本人歷年工作經(jīng)驗(yàn)，從以下3方面進(jìn)行分析與闡述“實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物檢測中結(jié)果分析與質(zhì)量控制”的問題，希望此文能給從事實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測工作的同仁提供借鑒。

1 細(xì)菌檢測質(zhì)量控制

細(xì)菌檢測首先要進(jìn)行采樣，采樣的準(zhǔn)確直接影響后續(xù)的檢測。而生化試驗(yàn)是對(duì)采樣進(jìn)行鑒定分析的首要方法，試驗(yàn)方法的準(zhǔn)確與否也同樣影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。在生化試驗(yàn)中我們首先要用到培養(yǎng)基，培養(yǎng)基是用于專門測定細(xì)菌生理和生化特性的一類培養(yǎng)基，適用于細(xì)菌純化以后的鑒定和分類，通過直接檢測細(xì)菌分泌的酶及酶解產(chǎn)物，來判定未知細(xì)菌的科、屬、種。作者所在實(shí)驗(yàn)室在近年來的試驗(yàn)中選擇了目前國內(nèi)幾個(gè)比較大的培養(yǎng)基生產(chǎn)廠家和一個(gè)國外知名培養(yǎng)基生產(chǎn)廠家生產(chǎn)的幾種常用生化培養(yǎng)基進(jìn)行比對(duì)。考慮到普遍性與特殊性的問題，本實(shí)驗(yàn)室選擇實(shí)驗(yàn)動(dòng)物常見的沙門菌 ATCC:50103;嗜肺巴斯德桿菌 ATCC:35149;鼠棒狀桿菌(由中國藥品生物制品檢定所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)進(jìn)行比對(duì)。沙門菌為所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物細(xì)菌學(xué)檢測必須檢測的細(xì)菌，比對(duì)結(jié)果表明，其在各個(gè)來源的各種生化培養(yǎng)基上的生長情況保持一致，培養(yǎng)基的來源未影響到檢測結(jié)果的準(zhǔn)確判定;嗜肺巴斯德桿菌、鼠棒狀桿菌在常規(guī)細(xì)菌學(xué)檢測中，因其營養(yǎng)要求較高，常常生長不好，若它們?cè)诟鱾€(gè)來源的各種生化培養(yǎng)基上的生長情況可比，則對(duì)其他營養(yǎng)要求相對(duì)不太高的細(xì)菌也可應(yīng)用;同時(shí)針對(duì)嗜肺巴斯德桿菌、鼠棒狀桿菌等一些較難生長的細(xì)菌，作者在實(shí)際應(yīng)用中對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行了摸索，獲得一些有應(yīng)用價(jià)值的數(shù)據(jù)，針對(duì)這些數(shù)據(jù)在實(shí)際工作中對(duì)檢測方法進(jìn)行了相應(yīng)的改進(jìn)。檢測中我們發(fā)現(xiàn)，嗜肺巴斯德桿菌在各廠家的克氏雙糖鐵或三糖鐵培養(yǎng)基上反應(yīng)結(jié)果有較大差異，究其原因是因?yàn)槭蟀魻顥U菌在培養(yǎng)基上生長的營養(yǎng)要求較高，雙糖鐵或三糖鐵培養(yǎng)基所含的營養(yǎng)成分不能完全提供細(xì)菌生長的營養(yǎng)物質(zhì)，因而生長不好，從而影響了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的觀察。通過我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在接種時(shí)加大接種量，有利于得出較為準(zhǔn)確的結(jié)果，同時(shí)配合其他生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行綜合判定，最終確定細(xì)菌的種屬［1］。

我們?cè)谟靡宜徙U紙條法對(duì)細(xì)菌進(jìn)行檢測時(shí)發(fā)現(xiàn)，廠家提供的包裝是一整袋中放入多個(gè)紙條，在實(shí)際檢測中無法一次使用完，包裝袋無法進(jìn)行密封保存，乙酸鉛紙條與空氣接觸發(fā)生變化，影響下次檢測結(jié)果的判定。我們建議廠家乙酸鉛紙條使用單獨(dú)包裝，即一張紙條一個(gè)包裝，保證使用中不改變紙條生化性質(zhì)。膽鹽硫乳瓊脂培養(yǎng)基(DHL)是沙門菌鑒別培養(yǎng)基，在多次檢測過程中，培養(yǎng)基上出現(xiàn)部分菌落帶黑心貨全黑，但其他生化試驗(yàn)結(jié)果卻與國標(biāo)GB/T 14926.1－2001沙門菌生化反應(yīng)結(jié)果不一致，結(jié)果中有一項(xiàng)或兩項(xiàng)不符合，按照國標(biāo)規(guī)定應(yīng)作出陰性報(bào)告，但作者認(rèn)為可以作出陽性報(bào)告。因?yàn)殍b別培養(yǎng)基上菌落形態(tài)完全符合國標(biāo)規(guī)定，而其他可疑菌種在DHL培養(yǎng)基上無法生長或菌落形態(tài)不符合國標(biāo)規(guī)定，根據(jù)多年檢測工作經(jīng)驗(yàn)，作者認(rèn)為是沙門菌的可能性較大。出現(xiàn)生化指標(biāo)有不符合項(xiàng)，可能是操作或培養(yǎng)基出現(xiàn)問題，這些影響因素可為其他檢測單位提供一些參考資料。

生化試驗(yàn)結(jié)果較易受外界條件的影響，有些實(shí)驗(yàn)，如硝酸鹽實(shí)驗(yàn)和靛基質(zhì)實(shí)驗(yàn)非常敏感，產(chǎn)生假陽性結(jié)果，因此每次實(shí)驗(yàn)設(shè)立空白對(duì)照和標(biāo)準(zhǔn)菌株對(duì)照是非常必要的。本實(shí)驗(yàn)室在以往檢測中就出現(xiàn)過硝酸鹽培養(yǎng)基的試驗(yàn)管和空白對(duì)照管均為陽性，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果無法判定的情況。在檢測中使用的一些生化培養(yǎng)基為微量生化反應(yīng)管，通過實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，使用的微量生化反應(yīng)管與干粉培養(yǎng)基的效果一樣，比干粉培養(yǎng)基使用更為方便實(shí)用、且節(jié)省培養(yǎng)基的用量，同時(shí)因?yàn)榕囵B(yǎng)基量少，細(xì)菌接種量相對(duì)較多，更能保證沙門菌、鼠棒狀桿菌和嗜肺巴斯德桿菌等營養(yǎng)要求嚴(yán)格菌的生長發(fā)育，便于得出準(zhǔn)確的結(jié)果。但目前生產(chǎn)微量生化反應(yīng)管的有些不穩(wěn)定，而且保存時(shí)間較短，品種又很有限，作者建議在實(shí)際應(yīng)用中應(yīng)對(duì)每批次生化管用標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行鑒定，合格后再用于檢測才能確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性［2］。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢測質(zhì)量控制除了選擇合適的培養(yǎng)基，檢測方法的選擇也是對(duì)檢測結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制的重要途徑。在檢測過程中，對(duì)樣本要進(jìn)行人員比對(duì)、儀器比對(duì)和實(shí)驗(yàn)室比對(duì)，達(dá)到細(xì)菌檢測質(zhì)量控制目標(biāo)。

2 病毒檢測質(zhì)量控制

在大、小鼠疾病中，病毒性疾病占有重要位置，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室近年來病毒檢測工作中遇到的問題，作者選擇檢測中遇到的病毒進(jìn)行探討，大、小鼠病毒性疾病包括:鼠痘病毒、仙臺(tái)病毒、小鼠肝炎病毒、漢坦病毒［3－6］。

作者近年來對(duì)大、小鼠病毒檢測多使用檢測試劑盒進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果經(jīng)常出現(xiàn)假陽性和假陰性現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)室通過人員比對(duì)、儀器比對(duì)，結(jié)果中假陽性和假陰性依然存在。作者分析，人員操作和儀器差異是出現(xiàn)此種結(jié)果原因之一，最主要原因可能是使用的試劑盒存在不穩(wěn)定性，每一批次試劑盒對(duì)同一樣品的檢測結(jié)果存在不一致情況。因此，對(duì)病毒檢測的質(zhì)量控制必須使用穩(wěn)定的試劑盒，同時(shí)，作者建議使用標(biāo)準(zhǔn)菌株對(duì)每批次試劑盒進(jìn)行鑒定，合格后再用于檢測，才能得到準(zhǔn)確可靠的結(jié)果。另外，作者在檢測過程中發(fā)現(xiàn)檢測試劑盒類型比較單一，若一次樣品量較大時(shí)，使用試劑盒比較經(jīng)濟(jì)，如果樣品量較少，在使用試劑盒時(shí)會(huì)有浪費(fèi)的可能，因此作者建議試劑盒供應(yīng)商應(yīng)該提供不同類型的包裝，方便檢測單位不同樣品量的檢測工作。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病毒檢測工作除使用檢測試劑盒，作者建議可使用傳統(tǒng)的ELISA和IFA法進(jìn)行比對(duì)檢測，雖然這兩種方法操作過程比較繁瑣，但是相對(duì)于試劑盒檢測，用ELISA和IFA法檢測結(jié)果比較準(zhǔn)確可靠，假陽性和假陰性結(jié)果出現(xiàn)率較低，重復(fù)性較好。

3 質(zhì)量檢測要與國際接軌

作者還認(rèn)為近年來細(xì)菌和病毒檢測單位之間應(yīng)加強(qiáng)交流與合作，定期進(jìn)行人員、儀器和實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)，將工作好的工作經(jīng)驗(yàn)積極推廣，一方面可以提高檢測質(zhì)量，保證檢測工作的順利進(jìn)行;另一方面進(jìn)行比對(duì)工作也符合國家質(zhì)監(jiān)總局對(duì)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制的總體要求，將檢測工作標(biāo)準(zhǔn)與國際接軌;第三，提倡各檢測單位轉(zhuǎn)換工作思路，將被動(dòng)轉(zhuǎn)主動(dòng)，提升本單位檢測能力，引進(jìn)專業(yè)人才，配備先進(jìn)儀器，在軟硬件上同時(shí)下功夫的同時(shí)，要與國際專業(yè)檢測機(jī)構(gòu)進(jìn)行合作與交流，獲取國際認(rèn)證認(rèn)可，這樣實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢測質(zhì)量才能得到大幅度的提升，質(zhì)量控制工作才能高效進(jìn)行。

［1］范薇，隋麗華，劉永梅，等.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物細(xì)菌檢測常用生化培養(yǎng)基的篩選及應(yīng)用［J］.中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)雜志，2001，11(2):69－71.

［2］王伙聰，徐海濱，陳建輝，等.福建省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物檢測結(jié)果分析［J］.海峽預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2010，16(3):39－40.

［3］田克恭.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病毒性疾病［M］.北京:農(nóng)業(yè)出版社，1992，57－83.

［4］楊松濤，夏咸柱，喬軍，等.鼠痘病毒CC強(qiáng)毒株的分離與鑒定［J］.中國病原生物學(xué)雜志，2007，2(1):4－7.

［5］劉懷然，張齡，張?zhí)炻敚?仙臺(tái)病毒黑龍江省地方株的分離與鑒定［J］.中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2006，14(2):132－134.

［6］劉香梅，張鈺，趙維波，等.廣東省屏障設(shè)施小鼠群中小鼠肝炎病毒感染情況［J］.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2009，19(10):72－74.

Investigation of Microbiological Test Quality Control on Rat and Mouse

BAI Bing，ZHANG Hai，MAO Feng-feng，ZHAO Yong，ZHANG Cai-qin，ZHAO Shan-min，SHI Chang-hong
(Laboratory Animal Center，F(xiàn)ourth Millitary Medical University，Xi’an 710032，China)

The quality of lab animal affected the correct of research data directly，we could control the quality of lab animal through microbiological test regularly，so the microbiological test quality control was the effective and necessary way to manage and supervise daily.We summarized the experiences for the past few years，then we investigated the quality control work to provide some data for lab animal microbiological test.

Rat;Mouse;Test;Quality control

Q95-331 R332

A

1671-7856(2012)07-0069-03

10.3969.j.issn.1671.7856.2012.007.017

2012-07-06

白冰(1980－)，男，獸醫(yī)師，研究方向:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物學(xué)。

師長宏(1973－)，男，副教授，博士。E-mail:changhong@fmmu.edu.cn。