哺乳類動(dòng)物胃腸道內(nèi)味覺受體的信號(hào)研究

陳曉慧，張春雷，陳 宏＊，2，房興堂

（1.江蘇師范大學(xué)細(xì)胞與分子生物學(xué)研究所，江蘇 徐州221116；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院/陜西省農(nóng)業(yè)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌712100）

胃腸道是腔內(nèi)營(yíng)養(yǎng)或非營(yíng)養(yǎng)的化學(xué)物質(zhì)、微生物、藥物、毒素等各種信號(hào)分子的感覺器官。我們通常以胃腸細(xì)胞來檢測(cè)腔內(nèi)的物質(zhì)是如何啟動(dòng)激素和神經(jīng)系統(tǒng)的信號(hào)通路，最終達(dá)到調(diào)控營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收，食物的攝取量，胰島素的分泌及新陳代謝等一系列機(jī)能反應(yīng)。到目前為止，有關(guān)于胃腸腔內(nèi)不同化學(xué)成分的分子識(shí)別機(jī)制還沒做過完整的闡述。在此，我們就來闡述口腔內(nèi)味覺識(shí)別的分子信號(hào)通路和胃腸細(xì)胞的化學(xué)感應(yīng)機(jī)制。這些新的研究結(jié)果可以為臨床醫(yī)療和動(dòng)物的飼養(yǎng)管理提供參考，特別是由腔內(nèi)的化學(xué)敏感引起的食欲不振和代謝紊亂疾病。

1 胃腸道內(nèi)味覺受體基因家族的表達(dá)

我們已經(jīng)知道，苦味受體基因家族taste receptor，type2（T2Rs）在人和嚙齒類動(dòng)物的口腔味蕾受體細(xì)胞中表達(dá)［1－3］。這些味覺受體屬于G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）超家族，是由一條多肽形成的7次跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，有3個(gè)胞內(nèi)環(huán)和3個(gè)胞外環(huán)。味覺受體第一 家 族 taste receptor，type1，［T1Rs（T1R1、T1R2、T1R3）］也屬于G蛋白偶聯(lián)受體超家族，它們是甜味劑和 L－氨基酸的受體［4，5］。小鼠和大鼠的taste receptor，type2（T2Rs）基因家族由36個(gè)完整的基因和至少7個(gè)假基因組成，它們分別位于小鼠的2、6、15號(hào)染色體上，大鼠的2、3、4號(hào)染色體上［6］。人類的T2R基因家族由33個(gè)成員組成，至少24個(gè)基因編碼，分布在第5、7、12號(hào)染色體上［7］，揭示在不同的動(dòng)物中，T2Rs位于不同的染色體上。T2Rs各成員之間僅有30%～70%序列相似度。雖然它們的序列相似度較低，但在第1～3、第7跨膜區(qū)和第2胞內(nèi)區(qū)具有高度保守的序列［2］。T2R基因家族各成員在不同物種中的序列相似度更低，對(duì)小鼠和人的T2Rs的研究發(fā)現(xiàn)，在位于第5跨膜區(qū)且靠近第3胞內(nèi)區(qū)的1個(gè)氨基酸殘基是完全保守的［8］。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，T2Rs結(jié)構(gòu)中，跨膜區(qū)保守性最高，其次是胞內(nèi)區(qū)，而胞外區(qū)的變異性最高，所以我們推斷胞內(nèi)區(qū)和其臨近的跨膜區(qū)是與G蛋白相互作用的位點(diǎn)，胞外區(qū)是與苦味物質(zhì)結(jié)合的區(qū)域［2，9，10］。這一基于序列的推斷被后來的功能實(shí)驗(yàn)所驗(yàn)證。

我們從小鼠、大鼠的肝臟、心臟、腎臟、腦組織和IEC－6/IEC－8細(xì)胞系中提取的 RNA，經(jīng)過實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，T2Rs在這些組織中均未表達(dá)，但在胃腸道粘膜中均表達(dá)［11］。最新的研究發(fā)現(xiàn)，在人的結(jié)腸中表達(dá) T2Rs，包括 T2R3、T2R4、T2R5、T2R10、T2R13、T2R38、T2R39、T2R40、T2R42、T2R43、T2R44、T2R45、T2R46、T2R47、T2R49、T2R50、T2R60［12］。目前，hT2Rs有些受體的配基已經(jīng)被鑒別出來了，比如，denatonium benzoate偶聯(lián)在hT2R47位點(diǎn)上，士的寧偶聯(lián)在hT2R10位點(diǎn)上，水楊苷偶聯(lián)在hT2R16位點(diǎn)上［13］，其他苦味物質(zhì)的偶聯(lián)位點(diǎn)仍需進(jìn)一步探究。小鼠、大鼠和人腸道內(nèi)的T1R1、T1R3以異源二聚體的形式識(shí)別L－氨基酸，T1R2、T1R3以異源二聚體的形式識(shí)別甜味物質(zhì)［14－16］。這些研究結(jié)果都證明了，甜味、苦味、L－氨基酸受體在小鼠、大鼠和人的腸道內(nèi)均表達(dá)。

2 小鼠、大鼠和人胃腸道細(xì)胞中α－味導(dǎo)素Ga和轉(zhuǎn)導(dǎo)素Gat－2的表達(dá)

基因?qū)W和生物化學(xué)方面的證據(jù)表明，G蛋白的α亞基即α－味導(dǎo)素Ga對(duì)T1Rs、T2Rs的信號(hào)識(shí)別起著重要作用［17］。除了舌上皮組織外，Ga在胃［11，18］、腸［11，19］、胰腺細(xì)胞［11，20］中也有表達(dá)，表明味覺感 受機(jī)制也存在于胃腸道內(nèi)。通過原位雜交方法確認(rèn)，編碼Ga的mRNA存在于小鼠和大鼠整個(gè)胃腸系統(tǒng)的粘膜中［11，16，21］。

與味覺信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的轉(zhuǎn)導(dǎo)素Gat－2在胃腸粘膜中表達(dá)［6，11］。嚙齒類動(dòng)物胃腸粘膜轉(zhuǎn)導(dǎo)素 Gat－2陽性細(xì)胞的分布和形態(tài)與Ga的陽性細(xì)胞不同［11］，表明Ga和轉(zhuǎn)導(dǎo)素Gat－2也許在小鼠和大鼠胃腸道不同類型的上皮細(xì)胞中表達(dá)［6，11］。

3 胃腸道內(nèi)分泌細(xì)胞Ga的表達(dá)

Ga－gust免疫反應(yīng)性細(xì)胞存在于人胃腸道的各個(gè)細(xì)胞，同時(shí)，我們還得知，Ga在腸內(nèi)分泌細(xì)胞中表達(dá)，在其他的腸上皮組織中不表達(dá)，說明了Ga－gust是在人胃腸道的內(nèi)分泌細(xì)胞中揮作用［12，16，22］。胃腸道的內(nèi)分泌細(xì)胞占腸上皮組織的量不到1%，但是它們組成了人體最大的內(nèi)分泌器官，產(chǎn)生和分泌多種激素［23］。開放型的腸內(nèi)分泌細(xì)胞對(duì)腔內(nèi)信號(hào)分子的識(shí)別是通過基底側(cè)胃腸激素的分泌來完成的。比如，胃腸內(nèi)分泌L細(xì)胞，多位于小腸和結(jié)腸處，產(chǎn)生和分泌腸肽激素PYY、胰高血糖素GLP－1。對(duì)Ga陽性細(xì)胞進(jìn)行免疫反應(yīng)性，發(fā)現(xiàn)也存在PYY和GLP－1。PYY 和 GLP－1 可 以 調(diào) 節(jié) 食 物 的 攝 取量［24，27］。除此之外，我們還檢測(cè)到 Ga與膽囊收縮素CCK共定位于胃腸內(nèi)分泌I細(xì)胞中，CCK可以調(diào)節(jié)胃腸的蠕動(dòng)和食物的攝取量。后來的研究同樣也證實(shí)了，Ga與GLP－1、抑胃多肽GIP共定位于小鼠和人的十二指腸內(nèi)分泌L細(xì)胞中［28，29］。

4 腸內(nèi)分泌細(xì)胞系中與味覺識(shí)別有關(guān)的因子的表達(dá)

培養(yǎng)的細(xì)胞系已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于研究腸細(xì)胞的功能、信號(hào)通路。通過RT－PCR和序列分析，證明了在腸內(nèi)分泌細(xì)胞系STC－1中表達(dá)T2Rs、Ga－gust、磷脂酶Cβ2（PLCβ2）、瞬時(shí)受體電位 M5（TRPM5），這些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子都與舌上皮細(xì)胞的味覺感知有關(guān)［6，11，30］。最近的研究表明，小鼠的腸內(nèi)分泌細(xì)胞系GLU Tag也表達(dá)特異性味覺信號(hào)因子［16］，大鼠的胰腺腫瘤細(xì)胞系 AR42J中也表達(dá)T2Rs、Gagust、Gat－2［6］。因此，小鼠的腸內(nèi)分泌細(xì)胞系STC－1、GLU Tag、大鼠的胰腺腫瘤細(xì)胞系A(chǔ)R42J為研究信號(hào)通路提供了好的模式系統(tǒng)。

人的腸內(nèi)分泌細(xì)胞系 HuTu－80、NCI－H 716中Ga－gust與特異性味覺受體共表達(dá)［12］。HuTu－80細(xì)胞系表達(dá)hT1R3，h T2Rs，包括h T2R38。NCI－H 716細(xì)胞系表達(dá) Ga－gust、h T2R38、T1R1、T1R2、T1R3、TRPM5［22］。事實(shí)上，腸內(nèi)分泌細(xì)胞系STC－1、GLU Tag、HuTu－80、NCI－H 716表達(dá)味覺信號(hào)通路中的多個(gè)因子，說明了胃腸道內(nèi)分泌細(xì)胞對(duì)腔內(nèi)容物的化學(xué)成分的感知起到重要作用。

5 胃腸道細(xì)胞中苦味信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

有關(guān)口腔內(nèi)味覺的信號(hào)通路已經(jīng)很清楚了。例如苦味的識(shí)別，苦味劑與T2Rs特異性配對(duì)后，G蛋白就和受體偶聯(lián)，引發(fā)信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。此過程會(huì)有2條轉(zhuǎn)導(dǎo)通路：一種是受體和配體結(jié)合后激活Ga，活化磷酸二酯酶PDE，水解cAMP，解除了環(huán)核苷酸（cNMP）對(duì)離子通道的抑制，Ca2＋濃度升高，導(dǎo)致膜去極化和神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。另一種是受體和配體結(jié)合后，G蛋白的βγ亞基分離，激活磷脂酶β2（PLCβ2），PLCβ2把磷脂酰肌醇－4，5－二磷酸［PI（4，5）P2］水解成二三磷酸肌醇（IP3）和二脂酰甘油（DAG），IP3和特異性受體結(jié)合后，Ca2＋濃度升高，導(dǎo)致膜去極化和神經(jīng)遞質(zhì)的釋放［9］。

有關(guān)胃腸道內(nèi)分泌細(xì)胞的苦味、甜味信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路還沒有完全弄清楚。最初的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)STC－1、HuTu－80、NCI－H 716、AR42J細(xì)胞受到苯酸芐銨酰胺（DB）、苯基硫脲（PTC）、cycloheximide（CYX）等苦味劑的刺激后，細(xì)胞內(nèi)Ca2＋濃度明顯升高［6，11，12，30，31］，所 以 我 們 就 推 斷，口 腔 內(nèi) 特 異 性 味 覺的信號(hào)通路在內(nèi)分泌細(xì)胞中也發(fā)揮作用。

L型電壓敏感性Ca2＋通道（VSCCs）能介導(dǎo)細(xì)胞外Ca2＋流入神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞，使細(xì)胞去極化［32］。當(dāng)有 L－VSCCs的阻斷劑nitrendipine和diltiazem時(shí)，由DB、PTC、CYX等苦味劑刺激細(xì)胞時(shí)，Ca2＋濃度并沒有升高，說明了STC－1細(xì)胞內(nèi)Ca2＋濃度升高是由開放型的 L－VSCCs介導(dǎo)的［30］。而在不表達(dá)T2Rs和G蛋白的多細(xì)胞系中，當(dāng)受到DB、PTC、CYX等苦味劑刺激后不能引起細(xì)胞內(nèi)Ca2＋濃度升高［6，11，12，30］。不同的苦味劑和各自特異性的苦味受體結(jié)合后可能會(huì)引起不同的信號(hào)通路。

6 甜味、苦味劑誘導(dǎo)胃腸道多肽類的釋放

我們現(xiàn)在推斷，甜味、苦味劑使胃腸內(nèi)分泌細(xì)胞Ca2＋濃度升高，引發(fā)了CCK、PYY、GLP－1多肽類物質(zhì)的釋放，這些多肽類物質(zhì)刺激了局部的神經(jīng)中樞的條件反射和（或）迷走輸入通路，激活了胰腺β細(xì)胞等周圍目標(biāo)細(xì)胞的活性。

現(xiàn)在的研究主要集中在活體體內(nèi)，對(duì)小鼠、大鼠進(jìn)行不同的處理來驗(yàn)證這些信號(hào)通路的正確與否。在給缺失Ga的小鼠填喂糖類物質(zhì)時(shí)，血液中的GLP－1濃度并沒有升高，相反，這些小鼠的胰島素分泌受損，高血糖明顯［22］。除此之外，缺失 Ga或T1R3的小鼠，甜味受體的激活能夠激活Na＋/葡萄糖共轉(zhuǎn)運(yùn)載體GLUT2的表達(dá)［16］。對(duì)小鼠的空腸灌注不同的甜味劑（包括人工合成劑）時(shí)，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體GLUT2的表達(dá)量升高［15］。這些研究均表明了，味覺信號(hào)分子的識(shí)別能夠引起腸細(xì)胞對(duì)糖的吸收、調(diào)節(jié)胰島素的分泌等一系列生理生化反應(yīng)。

7 小結(jié)和展望

口腔內(nèi)味覺信號(hào)通路在胃腸道中也能發(fā)揮作用這一推斷，得到了大量實(shí)驗(yàn)有力地證明。現(xiàn)在已經(jīng)確定，特異的味覺分子轉(zhuǎn)導(dǎo)器，包括T1Rs、T2Rs、Gat－2、Ga－gust、PLCβ2、TRPM5在小鼠、大鼠、人的腸內(nèi)分泌細(xì)胞系中表達(dá)。最新的研究發(fā)現(xiàn)，Ga－gust與GLP－1、PYY共定位于人和嚙齒動(dòng)物粘膜的腸內(nèi)分泌L型細(xì)胞中。大量的實(shí)驗(yàn)顯示，甜味、苦味劑能夠引起培養(yǎng)的腸內(nèi)分泌細(xì)胞分泌CCK、GLP－1、GIP胃腸多肽類物質(zhì)。對(duì)小鼠進(jìn)行空腸灌注甜味劑后，血液中的GLP－1濃度升高。而在缺乏Ga或T1R3的小鼠上沒有發(fā)現(xiàn)此類現(xiàn)象。

L細(xì)胞分泌的GLP－1、PYY和I細(xì)胞分泌的CCK使小鼠產(chǎn)生了厭食反應(yīng)。GLP－1、PYY與食物攝取量的基本調(diào)控機(jī)制有關(guān)聯(lián)，也許也與由新陳代謝紊亂引起的疾病有關(guān)，例如II型糖尿病。GPCRs是目前許多治療藥物的靶目標(biāo)，胃腸道細(xì)胞中與化學(xué)感應(yīng)有關(guān)的GPCRs的鑒定、識(shí)別能為研究出新型的治療藥物提供新的思路。

目前關(guān)于味覺信號(hào)通路的研究都集中在小鼠、大鼠和人上，在牛等反芻動(dòng)物上還未見相關(guān)報(bào)道。反芻動(dòng)物氨基酸的營(yíng)養(yǎng)需要研究一直以來就是個(gè)熱點(diǎn)和難點(diǎn)，難點(diǎn)主要體現(xiàn)在：反芻動(dòng)物采食的氨基酸有一部分會(huì)被瘤胃微生物降解，并且其代謝和生產(chǎn)的氨基酸需要量受生理狀態(tài)和生產(chǎn)水平的影響，因此研究人員很難準(zhǔn)確直接測(cè)定氨基酸的需要量；其次是，關(guān)于氨基酸的吸收和體內(nèi)氨基酸平衡的調(diào)控機(jī)制還沒有完全搞清楚。而氨基酸在反芻動(dòng)物生產(chǎn)性能的發(fā)揮中所起的重要作用又使得搞清楚氨基酸需要成為一個(gè)迫切的問題。動(dòng)物機(jī)體存在氨基酸的快速識(shí)別系統(tǒng)，特別是T1R1和T1R3能以異源二聚體的形式在氨基酸的識(shí)別中發(fā)揮重要作用，所以，我們可以從體內(nèi)氨基酸識(shí)別入手來研究反芻動(dòng)物氨基酸的攝取與消化吸收的調(diào)控機(jī)制，從而為反芻動(dòng)物飼料的營(yíng)養(yǎng)配制提供指導(dǎo)作用。

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