轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉毒蛋白檢測方法及其表達(dá)規(guī)律研究進(jìn)展

賀 文，陳金湘

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，長沙410128)

棉花是重要的經(jīng)濟(jì)作物和紡織工業(yè)的重要原料，發(fā)展棉花產(chǎn)業(yè)，對提高棉農(nóng)經(jīng)濟(jì)收入、發(fā)展紡織工業(yè)和改善人們衣著水平有著密切關(guān)系［1］。蟲害是制約棉花高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的重要因素，常規(guī)化學(xué)藥劑防治蟲害的同時，使棉蟲產(chǎn)生抗性，同時污染了生態(tài)環(huán)境，增加生產(chǎn)成本。20世紀(jì)80年代生物工程技術(shù)飛速發(fā)展，為培育抗病蟲性強(qiáng)、纖維品質(zhì)優(yōu)、產(chǎn)量高的雜交棉品種提供了技術(shù)保障，尤其是培育成功的轉(zhuǎn)Bt基因棉——其表達(dá)產(chǎn)生的δ－內(nèi)毒素具有對鱗翅目等目標(biāo)昆蟲毒力高、專一性強(qiáng)、且在棉株體內(nèi)修飾后表達(dá)水平高等優(yōu)點(diǎn)，促使轉(zhuǎn)Bt基因棉成為世界上轉(zhuǎn)基因植物大規(guī)模商業(yè)化種植的主要作物之一，取得了巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。深入研究轉(zhuǎn)Bt基因在棉株各組織、器官中Bt毒蛋白的表達(dá)量及抗蟲特點(diǎn)，旨在揭示轉(zhuǎn)Bt基因棉Bt毒蛋白表達(dá)含量的基本規(guī)律及明確對目標(biāo)害蟲毒殺性，為轉(zhuǎn)Bt基因棉品種(組合)的選育、繁殖、推廣和安全評價管理提供科學(xué)的依據(jù)［2］。

1 Bt毒蛋白檢測方法

1.1 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)

酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)因其操作相對簡便、快速和檢測靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛研究和應(yīng)用［3］。該方法主要是基于抗原、抗體特異性結(jié)合以及標(biāo)記酶的高效催化原理而建立的檢測微量蛋白的方法。ELISA檢測方法可分為:直接ELISA、間接ELISA、雙抗夾心法［4］。該項技術(shù)需要固定相的抗原或抗體、酶標(biāo)記的抗原或抗體和酶作用底物等3種試劑。其免疫分析過程為:首先將抗原(Antigen)或抗體(Antibody)結(jié)合到固相載體里，待測溶液中的特殊抗原或抗體結(jié)合到固相載體表面后，使酶標(biāo)記抗球蛋白與抗體或抗原化合物結(jié)合，結(jié)合物通過酶標(biāo)記物和底物顏色的改變而被檢測，通過最后溶液顏色深淺進(jìn)行定量測定(溶液顏色的深淺與原待測中的抗原與抗體的量成正比例)，從而應(yīng)用吸光度值根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系計算抗原(抗體)的量。

1.2 蛋白質(zhì)印跡法(Western Bloting)

蛋白質(zhì)印跡被廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平的表達(dá)。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體(非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì))上，以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。通常有兩種:毛細(xì)管印跡法和電泳印跡法［5］。其一般步驟為:1)蛋白樣品的制備;2)SDS－PAGE電泳;3)轉(zhuǎn)膜(PVDF或NC膜)與顯色。

1.3 免疫試紙條法

免疫層析試紙條技術(shù)是20世紀(jì)80年代初發(fā)展起來的基于免疫學(xué)方法的快速檢測技術(shù)，其原理是基于抗原抗體反應(yīng)來檢測待檢物，結(jié)構(gòu)主要包括樣本墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜(NC膜)、檢測線(T線)、質(zhì)控線(C線)、吸水墊及黏性底板等幾個部分組成。依據(jù)其免疫層析反應(yīng)時抗原與抗體結(jié)合方式的不同，免疫層析試紙條主要分為兩類:雙抗夾心免疫層析法和競爭免疫層析法［6］。

1.4 生物測定

生物測定法是目前最為廣泛采用的鑒定方法，其原理是利用不同昆蟲對毒蛋白的不同敏感性或者同一昆蟲的不同死亡率來進(jìn)行的，抗蟲性分級標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)束春娥［7］等的分級標(biāo)準(zhǔn)，棉花植株的抗蟲性以棉鈴蟲的實(shí)際死亡率和校正死亡率表示，計算方法分別為:棉鈴蟲幼蟲實(shí)際死亡率=死蟲數(shù)/(死蟲數(shù)+活蟲數(shù))×100%;棉鈴蟲幼蟲校正死亡率=(處理死亡率－對照死亡率)/(1－對照死亡率)×100%。高抗表現(xiàn)為幼蟲校正死亡率＞80%，葉片被害呈Ⅰ級，活幼蟲1～2齡;中抗則表現(xiàn)為幼蟲校正死亡率60% ～79%，葉片被害呈Ⅱ級，活幼蟲2齡;低抗表現(xiàn)為幼蟲校正死亡率＜59%，葉片被害呈Ⅲ級，活幼蟲2～3齡。

2 轉(zhuǎn)Bt基因棉花毒蛋白表達(dá)規(guī)律及其影響因素

自轉(zhuǎn)Bt基因棉問世以來，國內(nèi)外研究人員通過免疫化學(xué)測定法、生物測定法等對轉(zhuǎn)Bt基因棉花不同組織、器官的毒蛋白變化進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)Bt毒蛋白在所有檢測到的器官中均有表達(dá)，轉(zhuǎn)Bt基因棉花Bt毒蛋白含量及其對棉鈴蟲的抗性均呈明顯的時空動態(tài)變化。

2.1 空間動態(tài)變化規(guī)律

轉(zhuǎn)Bt基因棉花發(fā)育的同一階段不同組織、器官中Bt毒蛋白含量、抗蟲性不一致，并隨著棉株發(fā)育而變化，但總體表現(xiàn)為:營養(yǎng)器官Bt毒蛋白的含量和殺蟲活性均高于生殖器官。王保民等［8］經(jīng)過測定，發(fā)現(xiàn)棉花葉片中的Bt毒蛋白含量顯著性高于蕾、花、鈴，果枝葉中Bt毒蛋白含量的變化規(guī)律與主莖葉基本相同。趙奎軍等［9］研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)Bt抗蟲基因棉GK－12品系相同部位葉片的殺蟲活性隨著棉花生育期推移呈下降的趨勢，尤其在盛花期之后顯著降低;不同器官殺蟲活性的順序?yàn)?葉＞蕾＞鈴＞花。孫偉等［10］用抗體夾心ELISA技術(shù)測定，Bt毒蛋白含量在苗期葉片中最高，蕾期次之，花鈴期最低。Sivasupramaniam S等［11］用酶聯(lián)免疫法分別測定轉(zhuǎn) Cry1Ac、Cry2Ab2棉 株 各 個 組 織 Cry1Ac、Cry2Ab2毒蛋白含量，結(jié)果表明轉(zhuǎn)Cry1Ac毒蛋白表達(dá)量在頂葉中最高，在完全葉、花萼、苞葉中較低，但轉(zhuǎn)Cry2Ab2毒蛋白表達(dá)量在幼鈴中最高，完全葉、花萼、苞葉中較低。

2.2 時間動態(tài)變化規(guī)律

隨著時間的變化，轉(zhuǎn)Bt棉花整個生育階段棉花的各個組織、器官中Bt毒蛋白的含量和抗蟲性都有較大的差異，測定的結(jié)果也不盡相同，但總體表現(xiàn)為棉株生育前期植株生長旺盛，其Bt毒蛋白表達(dá)量高、殺蟲活性強(qiáng);隨著棉株生長發(fā)育的推移，其Bt毒蛋白表達(dá)量顯著下降，其殺蟲活性急劇降低。陳松等［12］發(fā)現(xiàn)隨著棉花生長發(fā)育進(jìn)程的推進(jìn)，Bt毒蛋白在葉片中的表達(dá)強(qiáng)度逐漸減弱，其中以苗期葉片中最高，蕾期次之，花鈴期最低。李汝忠、沈法富［13］的研究表明，Bt毒蛋白的表達(dá)強(qiáng)度從苗期到蕾期呈上升趨勢，至蕾期達(dá)到高峰，以后逐漸減弱。陳鵬等［14］采用ELISA法(酶鏈免疫法)研究和分析了單價(Bt)轉(zhuǎn)基因抗蟲棉及雙價(Bt/CpTI)轉(zhuǎn)基因抗蟲棉不同生育期以及花鈴期不同器官的殺蟲蛋白含量，發(fā)現(xiàn)在時間分布上，各生育期頂尖平展葉表現(xiàn)為:初花期＞蕾期、花鈴期＞苗期＞吐絮期。周曉梅等［15］用 Envirologix Cry1Ab/Cry1Ac 平板試劑盒檢測了兩種轉(zhuǎn)Cry1Ac基因棉花品系(NUCOTN33B、NUCOTN99B)以及常規(guī)對照品系(蘇棉12)不同生育期主莖嫩葉、側(cè)枝嫩葉、蕾及蕾的苞葉中殺蟲蛋白Cry1Ac的含量，發(fā)現(xiàn)兩種轉(zhuǎn)Bt基因棉主莖嫩葉殺蟲蛋白Cry1Ac的含量隨生育期的推移呈明顯下降趨勢，花鈴期(NUCOTN33B和NUCOTN99B分別為4.43、2.93 μg/g)和吐絮期(3.87 和 2.86 μg/g)的含量分別降至苗期第 6葉(7.64、8.38 μg/g)的58%、35%和51%、34%;相同時期的主莖嫩葉和側(cè)枝嫩葉中Cry1Ac的含量均顯著高于蕾及蕾的苞葉，前兩者均為后兩者的兩倍以上。Chen F等［16］試驗(yàn)證明了棉花不同生育階段有不同的Bt毒蛋白表達(dá)量;通過提升田間CO2濃度含量可以促使轉(zhuǎn)Bt基因棉花生物量增加，但會導(dǎo)致Bt外源毒素表達(dá)含量減少;通過對出苗后45 d和90 d棉株莖、嫩枝毒蛋白測定，發(fā)現(xiàn)隨著棉花生物量顯著增加，Bt毒蛋白表達(dá)量減少，但是對出苗后90 d Bt棉葉和鈴檢測，發(fā)現(xiàn)其Bt毒蛋白無顯著性變化。Guo WZ等［17］通過測定棉株不同生育時期主莖上葉片毒蛋白含量和抗蟲鑒定，隨著棉株生育期推移，Bt毒蛋白含量呈下降趨勢，其對棉鈴幼蟲毒殺率也逐漸降低。Bird LJ等［18］通過溫室測定后發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)Cry1Ac棉表達(dá)毒蛋白在出苗15周后其毒蛋白表達(dá)含量與出苗4周相比降低了75%，不足10%的棉鈴幼蟲發(fā)育到了第五代，而室內(nèi)轉(zhuǎn) Cry1Ac棉株上棉鈴成蟲存活率為62%，F(xiàn)1代棉鈴幼蟲存活率為39%。

2.3 影響轉(zhuǎn)Bt基因Bt毒蛋白表達(dá)及抗蟲性的因素

轉(zhuǎn)Bt基因Bt毒蛋白表達(dá)及抗蟲性具有時空特異性，這表明轉(zhuǎn)Bt基因棉花中Bt毒蛋白的表達(dá)受棉株體內(nèi)發(fā)育調(diào)控和外界環(huán)境條件影響。其原因有以下幾個方面:1)外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)水平受表達(dá)載體的影響，啟動子起關(guān)鍵作用，不同來源的啟動子在不同基因中的表達(dá)效率有明顯差異。目前，在棉花Bt抗蟲基因研究過程中，廣泛使用的35S啟動子來源于花椰菜花葉病毒(CaMV35S)蛋白基因，此啟動子在棉株體細(xì)胞內(nèi)具有很強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄活性，可以在棉株不同時期器官、組織內(nèi)表達(dá)對目標(biāo)害蟲毒殺的蛋白，但不是特定階段表達(dá)型或蟲害侵害誘導(dǎo)表達(dá)型，隨著棉花生長生育后期棉株體內(nèi)表達(dá)毒蛋白顯著性下降，抗蟲性變差。2)植物體內(nèi)轉(zhuǎn)入目的基因表現(xiàn)“沉默”現(xiàn)象已達(dá)成共識，轉(zhuǎn)Bt基因在棉株體內(nèi)的沉默可能與甲基化、轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)、插入受體裹包體位點(diǎn)及與受體中有同源基因等有關(guān)，使其表達(dá)水平低、不穩(wěn)定［29］。3)Bt毒蛋白的表達(dá)水平受降水、光強(qiáng)、溫度、栽培方式等條件影響，在低光強(qiáng)、高溫下棉株生長旺盛時，抗性增加，反之則降低。降水也能夠降低Bt殺蟲蛋白的毒性表達(dá)［29］。4)棉花本身特定的次生物(棉酚為代表的萜烯類化合物和單寧類化合物)也會對棉鈴蟲的生長和發(fā)育產(chǎn)生影響，研究發(fā)現(xiàn)棉花縮合單寧和Bt毒蛋白之間有一定的拮抗作用，Bt殺蟲蛋白表達(dá)會影響到棉花中縮合單寧的合成［30］。5)通過植物介導(dǎo)的RNAi(RNA interference)技術(shù)能夠有效下調(diào)目標(biāo)昆蟲體內(nèi)特異基因的表達(dá)，從而使轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出抵御害蟲的能力;將棉鈴蟲生長代謝有關(guān)基因CYP6AE14特異的 dsRNA(double－stranded RNA)導(dǎo)入植物中表達(dá)，并用轉(zhuǎn)基因植物組織喂食棉鈴蟲幼蟲，發(fā)現(xiàn)幼蟲體內(nèi)CYP6AE14的表達(dá)水平降低，幼蟲的生長得到抑制［31，32］。

3 問題與展望

目前直接測定轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉株內(nèi)Bt毒蛋白的方法主要有酶聯(lián)免疫法(ELISA)、蛋白質(zhì)印跡法、免疫試紙條法、生物試法。酶聯(lián)免疫法(ELISA)具有高特異性、靈敏性，檢測值可至ng～pg水平，但需特異性的抗體，且容易出現(xiàn)假陽性。免疫印跡具有SDS－PAGE的高分辨力和固相免疫測定的高特異性和敏感性，能對蛋白進(jìn)行定性和半定量分析，但操作步驟繁瑣，且實(shí)驗(yàn)過程中須有良好的內(nèi)參體系，否則實(shí)驗(yàn)結(jié)果有偏差。免疫試紙條法檢測快速，操作簡便，價格低廉，適用快速檢測及診斷，但靈敏度偏低，要求采用純度高、親和力強(qiáng)的單克隆抗體以及新型發(fā)射光譜型標(biāo)記物并配合試紙條熒光讀取儀，才能提高免疫層析試紙條的靈敏度。有些轉(zhuǎn)基因棉株中Bt毒蛋白的表達(dá)量極低，甚至用ELISA和蛋白質(zhì)印跡法都難以測定，而且生物試驗(yàn)結(jié)果仍表現(xiàn)出對敏感昆蟲的抗性。測定過程中需統(tǒng)一蟲源、蟲齡，且試驗(yàn)占用空間大，測定所需時間長，昆蟲飼養(yǎng)過程中易被病毒感染。鑒于全球轉(zhuǎn)基因植物商業(yè)化迅猛發(fā)展，建立一種快速、高效、低成本、靈敏性強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測法將成為今后研究的發(fā)展趨勢。

目前，轉(zhuǎn)Bt基因棉花中Bt毒蛋白表達(dá)的研究尚處于初級階段，研究人員對轉(zhuǎn)Bt基因棉Bt毒蛋白含量的表達(dá)變化及抗蟲性測定結(jié)果存在一定的差異，在今后的研究中，應(yīng)進(jìn)一步深入開展對外源基因在轉(zhuǎn)基因植株中的動態(tài)表達(dá)機(jī)理，以及Bt毒蛋白表達(dá)水平與棉株體內(nèi)次生代謝產(chǎn)物之間關(guān)系和害蟲對Bt不同基因類型產(chǎn)生毒蛋白交叉抗性的研究，并結(jié)合運(yùn)用“避難所”策略和天敵的協(xié)同作用，發(fā)揮轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉毒蛋白對目標(biāo)害蟲防治的最佳效應(yīng)。

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