電針結合重復經(jīng)顱磁刺激對焦慮模型大鼠中樞腎上腺皮質激素受體基因表達的影響＊

周奇志，魏焦祿，蔡定均△，彭曉華，余曙光，鄭 重，方楊琪

（1.成都中醫(yī)藥大學針灸推拿學院針灸學實驗室 610075；2.四川大學華西醫(yī)院心理衛(wèi)生中心電生理室，成都 610041；3.成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院針灸學校 610041）

研究顯示，焦慮障礙總體年發(fā)病率和終身患病率分別是10.6%和16.6%［1］；且治療成本高，干預措施的有效性與高成本并非成正比［2］。中樞特別是海馬、前額皮質等邊緣結構分布有大量的腎上腺皮質激素受體［鹽皮質激素受體（MR）和糖皮質激素受體GR）］，MR和GR均可與糖皮質激素結合，共同調節(jié)應激、焦慮情緒等，且MR／GR系統(tǒng)的失平衡可導致焦慮情緒的發(fā)生。電針、重復經(jīng)顱磁刺激（repetitive transcranial magnetic stimulation，rTMS）治療焦慮障礙均顯示一定療效［3－4］，但總體療效還不夠突出，尚缺乏二者結合的效應和機制研究。本課題擬探索電針結合rTMS抗焦慮協(xié)同效應的部分中樞作用機制，為臨床尋求經(jīng)濟、有效和安全的治療措施，提供科學的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 RAPID2型rTMS器，英國 Magstim公司生產(chǎn)；PM－200十字迷宮視頻跟蹤系統(tǒng)，成都泰盟公司生產(chǎn)；基因擴增儀（C1000，BIO－RAD）；熒光定量 PCR（CFX96，BIO－RAD）。總RNA提取試劑盒（離心柱型）、Quantscript RT Kit Quant cDNA第一鏈合成試劑盒和Quant一步法逆轉錄－聚合酶鏈反應（RT－PCR）試劑盒購自北京TIANGEN生物技術公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組與模型復制 （1）實驗條件:選用清潔級雄性SD大鼠50只，體質量180～220g，購自成都中醫(yī)藥大學動物實驗中心［合格證書號:川實動管質第SCXK（川）2009－11］；（2）分組:將50只大鼠隨機分為空白組、模型組、模針組、模磁組、磁針組，每組10只；（3）動物在實驗前適應性馴養(yǎng)1周。參考單個持續(xù)刺激（single prolonged stress，SPS）方法［5］，復制焦慮模型，即禁錮2h，強迫性游水20min，乙謎麻醉至意識喪失后，立即放回原籠，單籠飼養(yǎng)。

1.2.2 實驗方法 空白組:每天在相同的時間進行與模針組相同的方法固定。模型組:在造模后次日，處理方法同空白組。模針組:在造模后次日進行電針治療。穴位選擇:“百會”、“長強”，依據(jù)《實驗針灸學》的動物穴位圖譜模擬定位［6］。接電針治療儀，選用疏密波，頻率15～25次／分。每天1次，持續(xù)15 min，連續(xù)治療3d。模磁組:在造模后次日，對大鼠頭部進行rTMS治療。運動閾值（motor threshold，MT）為75% ，刺激頻率18.3Hz，400個脈沖。每天1次，連續(xù)治療3d。磁針組:在造模后次日，對大鼠先后進行電針和rTMS治療，方法同模針組和模磁組。

1.2.3 指標檢測方法 （1）行為學檢測:在治療結束后次日，按文獻［7－8］分別進行曠場實驗（open field，OF）和高架十字迷宮實驗（elevated plus maze，EPM）。（2）腦組織和血清采集:實驗結束后，采用乙醚輕度麻醉各組動物，斷頭迅速取腦，置于液氮冷凍待測。參照腦立體定位圖譜［9］，取海馬和前額皮質組織塊約20mg，進行組織勻漿。（3）MR和GR基因表達指標測試:按照相關試劑盒說明書，運用一步法RT－PCR測試基因表達。MR mRNA上游引物3′－AAC AAA ATG CCC CAC GGT TA－5′（20bp），下游引物3′－GGG ACG ATG CAA TGG ACT GT－5′（20bp）。GR mRNA上游引物3′－GGA TTT CCA GAG CCC ACC AT－5′（20bp），其下游引物3′－CAT TCC TGA TGG TCA CCT CG－5′（20bp）。

2 結 果

2.1 行為學實驗 曠場實驗結果:與空白組相比，模型組大鼠垂直運動次數(shù)明顯減少（P＜0.05）；與模型組相比，模磁組、磁針組水平移動格數(shù)、垂直運動次數(shù)顯著增加（P＜0.01），模針組垂直運動次數(shù)顯著增加（P＜0.01）；而磁針組較模針組、模磁組水平移動格數(shù)、垂直運動次數(shù)均顯著增加（P＜0.05）。十字迷宮實驗結果:與空白組比較，模型組大鼠OT%值、OE%值明顯下降（P＜0.01）；與模型組相比，治療3組OT%值、OE%值均顯著增加（P＜0.05）。結果見表1。

表1 行為學實驗各組指標比較（，n＝10）

表1 行為學實驗各組指標比較（，n＝10）

▲:P＜0.05，與空白組比較；★:P＜0.05，與模型組比較；■:P＜0.05，與磁針組比較。

組別曠場實驗水平移動格數(shù) 垂直運動次數(shù)十字迷宮實驗OT% OE%空白組 110.67±13.3518.45±4.32 0.36±0.12 0.46±0.19模型組 99.33±21.6212.67±3.78▲ 0.11±0.06▲ 0.13±0.12▲模針組 107.56±15.48■ 19.56±3.97★■ 0.31±0.14★ 0.32±0.11★模磁組121.00±13.65★■ 23.29±3.35★■ 0.30±0.12★ 0.29±0.06★磁針組 138.25±12.16★ 30.00±6.76★ 0.29±0.14★ 0.31±0.14★

析因設計的方差分析結果顯示，對行為學效應指標（OT%、OE%、水平移動格數(shù)和垂直運動次數(shù)）電針治療的統(tǒng)計量F值分別為6.500、8.594、5.154和15.073，P 值分別為0.015、0.006、0.031和0.001，rTMS 4個指標統(tǒng)計量F 值分別為4.617、5.043、21.778和36.140，P 值分別為0.038、0.031、0.000和0.000，可認為兩種治療單獨用有統(tǒng)計學意義，與表1結果基本一致。電針與rTMS同用時交互作用只在OT%、OE%兩指標上差異有統(tǒng)計學意義（F值分別為7.657和5.478，P值分別為0.009和0.025），表明在十字迷宮實驗中電針、rTMS同時運用顯現(xiàn)抗焦慮協(xié)同效應。

2.2 各組大鼠海馬、前額皮質MR和GR基因表達變化 大鼠經(jīng)SPS造模后，（1）模型組海馬GR mRNA的CT值、MR mRNA／GR mRNA的CT值比值均較空白組升高（P＜0.05）；而模針組和磁針組GR mRNA的CT值較模型組均有下降（P＜0.05）；MR mRNA各組差異不明顯（P＞0.05）。結果見表2。（2）模型組前額皮質 MR mRNA和GR mRNA的CT值以及比值與空白組、治療組比較差異不明顯（P＞0.05）。

由于CT值與起始模板拷貝數(shù)成反比，CT值越大，起始模板拷貝數(shù)越少，表示基因表達量越少。因此結果提示，造模后模型動物海馬GR基因表達量、MR mRNA／GR mRNA明顯低于正常動物，治療各組均顯示一定程度改善，且電針和電針結合rTMS對海馬GR基因表達量影響顯著。

表2 各組大鼠海馬MR和GR的mRNA CT值及其比值的比較（，n＝10）

表2 各組大鼠海馬MR和GR的mRNA CT值及其比值的比較（，n＝10）

▲:P＜0.05，與空白組比較；★:P＜0.05，與模型組比較。

組別 MRmRNA GR mRNA MR mRNA／GR mRNA空白組18.72±1.5916.93±2.26 1.12±0.18模型組 17.92±1.38 18.94±2.42▲ 0.96±0.11▲模針組 17.82±2.3916.89±2.18★ 1.07±0.20模磁組 17.18±2.4617.08±2.32 1.03±0.26磁針組 17.43±2.1916.76±1.45★1.04±0.13

3 討 論

焦慮障礙（anxiety disorder）是包括廣泛性焦慮障礙、恐懼癥、驚恐發(fā)作、創(chuàng)傷后應激障礙以及強迫癥等在內的一組臨床障礙［10］。經(jīng)過半個多世紀各國學者的大量研究，已相繼成功建立了各種各樣的焦慮動物模型和檢測方法。目前較多以SPS方法復制創(chuàng)傷后應激障礙（post traumatic stress disorder，PTSD）大鼠焦慮模型［5，7，11－12］。OF和 EPM 兩項實驗已成為國際公認有效評價動物焦慮情緒行為的常用測試方法［7－8］。本研究選用SPS方法，且單籠飼養(yǎng)，造成動物軀體和心理應激刺激，模型動物與正常比較有明顯的焦慮樣反應，說明該焦慮模型塑造成功。本研究結果顯示，電針、rTMS均有改善焦慮情緒反應的作用，這與文獻報道有一致性［3－4，13］。電針結合rTMS抗焦慮協(xié)同效應的研究雖未見報道，但本研究結果顯示電針結合rTMS治療焦慮抑郁具有協(xié)同效應［14］。

目前關于電針結合rTMS抗焦慮機制研究尚缺乏。近年來研究表明MR／GR系統(tǒng)對焦慮、恐懼情緒反應等起重要作用。研究顯示，運用SPS造模大鼠，24h急性應激后海馬GR和MR的mRNA均降低，可致 MR／GR比值下降，7、14d后GR升高、MR仍下降，MR／GR比值降低［12］。在社會孤立應激模型（單籠飼養(yǎng)）研究中，應激1周后在海馬和丘腦GR結合率降低、頂葉皮質和垂體未見變化，MR水平也未見變化；3周后在海馬和丘腦下降的GR回復至正常水平，而頂葉皮質GR結合率卻下降，海馬和中隔組織的MR水平嚴重低下，提示社會應激刺激導致皮質激素受體持續(xù)下調以及不同腦區(qū)不同階段GR和MR有不同變化［15］。本項研究結果顯示，造模后5d動物海馬GR基因表達量、MR mRNA／GR mRNA比值均發(fā)生了明顯改變，即顯著低于正常水平，而海馬 MR及前額皮質GR和MR mRNA表達水平均未現(xiàn)變化，這與文獻報道有一定相似性。本研究3種治療對模型動物海馬GR mRNA表達量均有一定程度改善，且電針和電針結合rTMS影響明顯。結合本研究結果，電針結合rTMS具有抗焦慮協(xié)同效應，其機制可能主要與改變海馬GR基因表達有關。

綜上所述，本研究初步揭示電針結合rTMS具有抗焦慮協(xié)同效應，其作用可能與調節(jié)腎上腺皮質激素受體基因表達相關，而基因表達改變后其下游分子事件是否參與了電針結合rTMS協(xié)同抗焦慮作用，尚待進一步探究。

［1］Somers JM，Goldner EM，Waraich P，et al.Prevalence and incidence studies of anxiety disorders:a systematic review of the literature［J］.Can J Psychiatry，2006，51（2）:100－113.

［2］Konnopkaa A，Leichsenringb F，Leibing E，et al.Cost－ofillness studies and cost－effectiveness analyses in anxiety disorders:A systematic review［J］.J Affect Disord，2009，114（1）:14－31.

［3］馬鐵明，白增華，任路，等.針刺治療焦慮癥療效 Meta分析［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2007，14（2）:101－103.

［4］Boggio PS，Rocha M，Oliveira MO，et al.Noninvasive brain stimulation with high－frequency and low－intensity repetitive transcranial magnetic stimulation treatment for posttraumatic stress disorder［J］.J Clin Psychiatry，2010，71（8）:992－999.

［5］Yamamoto S，Morinobu S，Takei S，et al.Single prolonged stress:toward an animal model of posttraumatic stress disorder［J］.Depress Anxiety，2009，26（12）:1110－1117.

［6］李忠仁.實驗針灸學［M］.北京:中國中醫(yī)藥出版社，2003，327－329.

［7］Wang HN，Peng Y，Tan QR，et al.Quetiapine ameliorates anxiety－like behavior and cognitive impairments in stressed rats:implications for the treatment of posttraumatic stress disorder［J］.Physiol Res，2010，59（2）:263－271.

［8］Sidor MM，Rilett K，F(xiàn)oster JA.Validation of an automated system for measuring anxiety－related behaviours in the elevated plus maze［J］.Neurosci Methods，2010，188（1）:7－13.

［9］包新民，舒斯云.大鼠腦立體定位圖譜［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，1993:75－84.

［10］邵福源，王宇卉.分子神經(jīng)藥理學［M］.上海:上海科學技術出版社，2005，4:582－587.

［11］Zhe D，F(xiàn)ang H，Shi YX.Expressions of hippocampal mineralocorticoid receptor（MR）and glucocorticoid receptor（GR）in the single－prolonged stress－rats［J］.Acta Histochem Cytochem，2008，41（4）:89－95.

［12］Wang W，Liu Y，Zheng H，et al.A modified single－prolonged stress model for post－traumatic stress disorder［J］.Neuroscience Letters，2008，441（2）:237－241.

［13］Kanno M，Matsumoto M，Togashi H，et al.Effects of repetitive transcranial magnetic stimulation on behavioral and neurochemical changes in rats during an elevated plus－maze test［J］.J Neurol Sci，2003，211（1／2）:5－14.

［14］何林麗，鄭重，蔡定均，等.電針結合重復經(jīng)顱磁刺激治療焦慮抑郁共病隨機對照研究［J］.中國針灸，2011，31（4）:294－298.

［15］Buwalda B，F(xiàn)elszeghyb K，Horváth KM，et al.Temporal and spatial dynamics of corticos－teroid receptor downregulation in rat brain following social defeat［J］.Physiol Behav，2001，72（3）:349－354.