微板干試劑測定血糖方法學(xué)的建立及其在體檢篩查中的應(yīng)用

白 曉，李軍民，談 昀，張 紅，趙 花，曾憲飛

（武警陜西省總隊醫(yī)院檢驗科，西安 710054）

血糖測定是體檢中常規(guī)項目之一，目前多使用全自動生化分析儀進(jìn)行檢測，但此法并不適用于基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)對單項目批量體檢者快速篩查。為了提高基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)檢測水平，便于批量體檢者普查需求，作者將葡萄糖氧化酶試劑進(jìn)行改良后，直接干燥于微孔板使用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測［1］，建立一種快速、簡單、準(zhǔn)確的新方法，并對體檢的120份標(biāo)本進(jìn)行了初步應(yīng)用研究。該方法操作簡單，對小批量單項血糖檢查甚至單個樣本能進(jìn)行快速而準(zhǔn)確的測定，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 檢測對象 本院進(jìn)行血糖體檢項目的120例體檢標(biāo)本，其中男58例，女62例；年齡31～74歲，平均41.9歲。患者血清標(biāo)本無溶血、脂血及黃疸。

1.1.2 儀器與器材 STAT FAX 2100全自動酶標(biāo)儀，吸光度（OD）值線性測定范圍為0.000～3.000；酶標(biāo)反應(yīng)微孔板（Cellstar，USA）；Eppendorf可調(diào)式移液排槍；ModulyoD－230冷凍干燥機(jī)（美國Thermo公司）；日立7060全自動生化分析儀。

1.1.3 試劑

1.1.3.1 測定試劑［2］葡萄糖酶試劑（保定長城臨床試劑有限公司）中按0.5%加入3－羥基－2，4，6－三溴苯甲醇（TBHBA）［3］，

并添加10g／L清蛋白作為賦形劑以此作為測定用試劑［4］，取微孔板一塊，每孔加入300μL試劑進(jìn)行凍干，置于－70℃冰箱過夜。待其結(jié)晶后，放入冷凍干燥機(jī)真空抽干6h，并注意其真空度變化。經(jīng)過升華、解吸附，于真空度達(dá)83mbar時取出，將干燥好試劑的微孔板用塑膠加熱法密封，放入裝有硅膠的密封袋內(nèi)，置于2～8℃冰箱保存。

1.1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)液 參考《全國臨床檢驗操作規(guī)程》精確稱取經(jīng)80℃烘烤4h以上并置于干燥器至恒重的無水葡萄糖1.802g，以12mmol／L苯甲酸溶液溶解并移入100mL容量瓶內(nèi)，再以12mmol／L苯甲酸溶液稀釋至100刻度處，得到100mmol／L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲存液，根據(jù)需要另配制為1～30mmol／L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液。

1.2 方法 按照試劑與待檢血清的反應(yīng)比例200∶1，用微量定量加樣器吸取待檢血清10μL，置于已加入2mL去離子水的試管內(nèi)，混勻后由加樣排槍從上述處理液中吸取待檢血清300μL于干燥好試劑的微孔板內(nèi)進(jìn)行復(fù)溶，水浴箱孵育10min后于酶標(biāo)儀在505nm波長進(jìn)行吸光度檢測，與試劑配套標(biāo)準(zhǔn)品濃度和吸光度比值計算結(jié)果并打印報告輸出。

2 結(jié) 果

2.1 線性范圍 用100mmol／L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲存液制備系列葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液［5］，使葡萄糖含量為1～30mmmol／L，結(jié)果顯示OD值與相應(yīng)濃度在1～24mmol／L范圍內(nèi)呈直線相關(guān)，其回歸方程為:Y＝0.0731X＋0.0842，r＝0.9958。

2.2 與定值血清比較 使用低、中、高濃度定值血清進(jìn)行測定（分別使用試劑盒正常范圍標(biāo)準(zhǔn)品作為中值濃度靶值；自配低、高濃度定值血清，在日立7060全自動生化分析儀上測定5次，取均值為靶值），每份樣本以本法同時在酶標(biāo)儀上測定5次，取均值與靶值比較，計算相對偏差率分別為2.04%、0.68%及－1.88%，平均為0.28%，在允許誤差（±5%）范圍內(nèi)。

2.3 精密度測定

2.3.1 批內(nèi)精密度 取低、中、高值葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，同時測定15次，計算x、s和變異系數(shù)（CV），其均值分別為2.10、4.97和15.23mmol／L；s分別為0.05、0.08和0.13mmol／L，CV分別為2.15%、1.64%和0.88%。

2.3.2 日間精密度 將上述3種標(biāo)準(zhǔn)液每天測定1次，同時測定2遍，共測定8d，計算x、s和CV，葡萄糖濃度均值分別為2.07、4.88和15.31mmol／L；s分別為0.08、0.10和0.16mmol／L；CV分別為3.74%、2.10%和1.05%。

2.4 干擾性實驗［6］參考Fujita等［7］用血清建立對照組和加入至少3個濃度的三酰甘油、血紅蛋白、膽紅素干擾物分別作為脂血、溶血、黃疸標(biāo)本實驗組，每組樣品同時測定3次，計算干擾率，以可疑干擾物最大濃度的干擾率在±3%內(nèi)，未見明顯干擾。由結(jié)果計算，當(dāng)膽紅素在175.60μmol／L時，干擾率為2.52%；當(dāng)三酰甘油濃度為11.20mmol／L時，干擾率為2.44%；當(dāng)血紅蛋白濃度為7.34g／L時，干擾率為2.69%，血清中加入上述物質(zhì)及濃度均未見明顯干擾。

2.5 體檢篩查中的初步應(yīng)用 運用本法及日立7060全自動生化分析儀檢測120名體檢者的血糖濃度，測定結(jié)果（）如下:本法（5.47±2.37）mmol／L，全自動分析儀（5.41±2.31）mmol／L，回歸方程:

結(jié)果顯示，本方法與日立7060全自動生化分析儀測定結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義，具有較好的一致性。

3 討 論

目前，多由臨床大型生化儀器進(jìn)行血糖檢測，而多數(shù)基層和社區(qū)中小醫(yī)院等衛(wèi)生單位由于受經(jīng)濟(jì)、維修、試劑等種種條件的限制，至今尚未能普遍推廣應(yīng)用［8］；較為普及的半自動生化儀雖價格適中、體積微小，但在工作量較大時，不便于人群的篩查應(yīng)用。

本方法使用實驗室常用的微板、酶標(biāo)儀［9－10］，通過對血糖測定試劑及方法進(jìn)行改進(jìn)，建立了能適應(yīng)較大樣本單項檢測的微板干試劑葡萄糖氧化酶法，使微孔板中每孔均相當(dāng)于一個待檢標(biāo)本反應(yīng)池，可同時多標(biāo)本檢測，保證了試劑孵育時間和檢測反應(yīng)時間的基本一致，同時該法將試劑預(yù)先干燥好，測定時即拆即用，省去了添加液體試劑的繁瑣，使操作步驟更為簡單，小型醫(yī)療機(jī)構(gòu)均可配備和使用。在本法研究中，作者將液體試劑加入0.5%TBHBA及10g／L清蛋白，分別作為色原和賦形劑，直接凍干于96孔微板中，保持了試劑原本反應(yīng)性能，也具有良好的復(fù)溶性。按照試劑與待檢血清的反應(yīng)比例200∶1進(jìn)行標(biāo)本預(yù)處理，由加樣排槍從上述處理液中吸取300μL加入微孔板內(nèi)進(jìn)行試劑復(fù)溶，并在水浴箱中孵育10min，結(jié)合臨床常用酶標(biāo)儀進(jìn)行測定并計算輸出結(jié)果。由實驗結(jié)果表明，該干試劑在1～24 mmol／L范圍內(nèi)線性良好，在方法學(xué)評價中其準(zhǔn)確性在允許偏差±5%內(nèi)，重復(fù)性CV＜5%，干擾實驗等均能滿足檢測的要求。同時作者用微板干試劑葡萄糖氧化酶法檢測了120名體檢者的血糖結(jié)果，與日立7060全自動生化分析儀測定結(jié)果具有較好的一致性（r＝0.9875），能夠滿足臨床測定的基本要求。以上均說明該法能有效應(yīng)用于臨床的普篩及初步診斷檢測。

微板干試劑測定血糖方法雖然在檢測的預(yù)處理以及試劑反應(yīng)時間一致性的控制上可能會造成一些不可避免的誤差，但基于基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)檢驗人員少、經(jīng)濟(jì)條件不好的情況下，本法試劑用量少、成本低，在經(jīng)濟(jì)實用的同時提高了小批量單項血糖檢查工作的效率。在大力發(fā)展基層、社區(qū)醫(yī)療的今天，隨著酶標(biāo)儀廣泛普及應(yīng)用，該方法具有推廣應(yīng)用的價值。

［1］Frenchik MD，McFaul SJ.A microplate assay for the determination of hemoglobin concentration［J］.Clin Chim Acta，2004，339（1／2）:199－201.

［2］王翰林.干試劑在血糖血脂微量快速檢測上的應(yīng)用研究［J］.四川醫(yī)學(xué)，2009，30（9）:1465－1467.

［3］劉琳琳，王華忠，吳杰紅，等.以TBHBA為色原的唾液葡萄糖全自動分析法的建立及應(yīng)用［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2006，35（17）:1552－1553.

［4］Marion G，Hanns－Christian A，Klaus M.Freeze drying of human serum albumin（HSA）nanoparticles with different excipients［J］.Int J Pharm，2008，363（1／2）:162－169.

［5］孫艷艷，謝杰紅.便攜式血糖儀的臨床應(yīng)用價值評估［J］.中國實驗診斷學(xué)，2009，13（10）:1461－1462.

［6］李桂云.標(biāo)本溶血對15項生化檢驗結(jié)果的影響及分析［J］.檢驗醫(yī)學(xué)與臨床，2006，3（4）:164－165.

［7］Fujita T，Kawakami Y，Kohda S，et al.Assay of magnesium in serum and urine with use of only one enzyme，isocitrate dehydrogenase（NADP＋）［J］.Clin Chem，1995，41（9）:1302－1305.

［8］潘德剛.基層部隊半自動生化分析儀使用現(xiàn)狀及建議［J］.醫(yī)療衛(wèi)生裝備，2006，27（1）:76.

［9］張鵬.微孔板速率法在丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶檢測中的應(yīng)用［J］.現(xiàn)代檢驗醫(yī)學(xué)，2007，22（6）:60－61.

［10］桑勝云，胡榮芬.酶標(biāo)儀微量酸堿法測定獻(xiàn)血員血紅蛋白［J］.臨床輸血與檢驗，2009，2（3）:49－50.