同步硝化反硝化細(xì)菌的鑒定與脫氮特性研究

張 巍

（遼寧省環(huán)境科學(xué)研究院 國(guó)家環(huán)境保護(hù)村鎮(zhèn)污水處理與資源化工程研究中心，沈陽(yáng)110031）

近年來(lái)，中國(guó)廣泛開(kāi)展了脫氮方面的研究，并且取得了階段性的進(jìn)展。在已經(jīng)開(kāi)發(fā)的廢水脫氮方法中，生物脫氮法是目前公認(rèn)的最為經(jīng)濟(jì)有效的方法之一。在硝化 反硝化生物脫氮過(guò)程中，參與硝化的主要微生物硝化菌為自養(yǎng)菌，生長(zhǎng)緩慢，世代時(shí)間長(zhǎng)，需要較長(zhǎng)的污泥齡，使得硝化成為城市污水處理廠的制約因素［1］。

不少研究和報(bào)道［2－4］已充分證明，反硝化可發(fā)生在有氧條件下，使得有關(guān)好氧硝化 反硝化生物脫氮的研究日趨活躍。目前已知的好氧硝化 反硝化菌有：糞產(chǎn)堿菌［5］（Alcaligenesfaecalis），泛養(yǎng)硫球菌［6］（Thiosphaerapantotropha），現(xiàn)更名為脫氮副球菌［7］（Paracoccusdenitrificans）和赤紅紅球菌［8］（Rhodococcusruber）等，它們能同時(shí)利用氧和硝酸作為電子受體以獲得高生長(zhǎng)率。已有報(bào)道［9］Pseudomonasmendocina是典型的反硝化細(xì)菌，具有較強(qiáng)的反硝化活性，當(dāng)硝酸鹽濃度為88.5mg／L時(shí)，反硝化速率最大，為26.2mg／（L·d），顯現(xiàn)出較強(qiáng)的厭氧氨氧化能力。利用好氧同時(shí)硝化－反硝化菌發(fā)展好氧脫氮技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)：1）使硝化／反硝化反應(yīng)在同1個(gè)反應(yīng)器中進(jìn)行，可以大大減少占地面積和建設(shè)資金；2）使用好氧反硝化細(xì)菌可以減少處理過(guò)程中加入調(diào)節(jié)系統(tǒng)pH的化學(xué)物質(zhì)，降低成本；3）在處理過(guò)程中好氧反硝化菌更容易控制［10］。因此新型好氧反硝化微生物的篩選和好氧同時(shí)硝化反硝化生物脫氮技術(shù)已經(jīng)成了生物脫氮領(lǐng)域新的研究和發(fā)展趨勢(shì)。同時(shí)，污水處理中微生物的代謝情況與溫度有關(guān)，隨著溫度降低微生物活性下降，當(dāng)溫度低于4℃時(shí)，微生物的生理活動(dòng)幾乎停止。北方冬季的低溫條件會(huì)對(duì)微生物的生存造成很大影響，水溫過(guò)低，會(huì)影響細(xì)菌的增殖速率和生理活性，同樣會(huì)使硝化 反硝化作用停止。少數(shù)微生物會(huì)因?yàn)榛蛲蛔兌a(chǎn)生抗寒性，因此可以通過(guò)人工選擇的方式來(lái)培養(yǎng)耐低溫優(yōu)勢(shì)菌種，使其在低溫下仍有較強(qiáng)的脫氮能力［11］。

筆者依據(jù)好氧硝化 反硝化脫氮的原理，采用低溫?fù)u床富集、篩選具有硝化作用的反硝化脫氮菌，利用傳統(tǒng)與現(xiàn)代分子生物學(xué)相結(jié)合手段進(jìn)行同步硝化 反硝化短程脫氮菌分離并鑒定確定其分類地位。為富集高效硝化 反硝化短程脫氮菌，提高硝化 反硝化脫氮過(guò)程的效率，開(kāi)發(fā)高效節(jié)能低耗的硝化反硝化短程脫氮工藝提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用菌種來(lái)源于遼寧省昌圖污水處理廠A／O裝置中的好氧活性污泥。其他化學(xué)試劑均為市售分析純。基因組DNA抽提試劑盒，寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 分析儀器

分光光度計(jì)（UNICO UVTU－1901）；電子天平（LP502A）；pH 計(jì)（上海雷磁，pHs－3c），離心機(jī)（TDZ5－WS）；生化培養(yǎng)箱（SPX－100B－Z）；高壓滅菌鍋（HVE－50AUTOCLAVE）；電子顯微鏡（OLYMPUS CX41KF）；BIOLOG微生物鑒定系統(tǒng)（美國(guó)microLog）；恒溫水浴搖床（英國(guó) OLS200）。

1.3 分析方法

菌體濃度測(cè)定采用分光光度法測(cè)定［12］。CODCr測(cè)定采用重鉻酸鉀法，NH4＋－N采用納氏分光光度計(jì)法［13］。

1.4 培養(yǎng)基

用于富集培養(yǎng)降解同步硝化反硝化細(xì)菌的培養(yǎng)基配方為：NaNO20.5g、牛肉膏3.0g、蛋白胨10.0g、NaCl 5.0g、pH 7.0［14］。

用于分離純化同步硝化反硝化菌的培養(yǎng)基配方為：NaNO21.0g、Na2CO31.0g、NaH2PO40.25g、CaCO31.0g、K2HPO40.75g、MnSO40.01g、MgSO4·4H2O 0.03g、H2O 1 000mL、瓊脂15g。

1.5 菌株的富集與分離

將好氧污泥接種于4瓶250mL富集培養(yǎng)基中，每瓶污泥接種1.0mL，搖床培養(yǎng)，搖床溫度為15℃，轉(zhuǎn)速120r·min－1。4d后，將富集好的菌液稀釋后涂布于20個(gè)裝有分離培養(yǎng)基的平板上。將平板置于溫度為15℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期觀察菌體的生長(zhǎng)情況。用接種環(huán)將平板上生長(zhǎng)良好的菌落挑出，劃線培養(yǎng)于分離培養(yǎng)基中，翻接8～10次，將菌株分離。將分離出的菌株，劃線于普通肉汁斜面，4℃冰箱保藏。

1.6 菌株的生理生化鑒定

參照《菌種保藏手冊(cè)》［15］和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》［16］，對(duì)SNDB－5進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)。

1.7 BIOLOG鑒定

BIOLOG鑒定系統(tǒng)由濁讀儀、讀數(shù)儀、數(shù)據(jù)庫(kù)、軟件、微孔鑒定板組成，其實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)［17］。

1.8 細(xì)菌的基因組DNA提取

采用寶生物工程（大連）有限公司的基因組DNA抽提試劑盒提取。

1.9 16SrDNA擴(kuò)增與測(cè)序

以SNDB－5總DNA為模板，以用DNASTAR軟件分析設(shè)計(jì)的引物P1（188bp左右有一段21bp片斷：5′－CGCTAATACCGCAT ACGTCCT－3′）和P2（1 128bp左右有1段20bp片斷：5′－CCATGCAGCACCTGTGTCTG－3′）進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)液為50μL，含有ddH2O 40μL，dNTP 1μL，10×buffer 5μL，TaqE 1μL，模板DNA 1μL，50pmol·μL－1引物2μL。PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5min，94℃1min，53℃40s，72℃40s，35個(gè)循環(huán)，最后72℃保溫6min。測(cè)序由寶生物工程（大連）有限公司完成，將測(cè)序結(jié)果用Blast軟件與Genbank中16SrDNA序列進(jìn)行同源性比較。

1.10 菌株SNDB－5脫氮效能實(shí)驗(yàn)（以下實(shí)驗(yàn)均在好氧條件下進(jìn)行）

將SNDB－5以10%的接菌量分別接種到經(jīng)高壓滅菌的同步硝化反硝化培養(yǎng)基和NaNO2模擬廢水中，在15℃下，120r／min進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)裝置如圖1。每12h監(jiān)測(cè)同步硝化反硝化培養(yǎng)基中NO2－－N、NO3－－N、菌體生長(zhǎng)吸光度（OD600）的變化；硝化培養(yǎng)基及NaNO2模擬廢水中NO3－－N、NO2－－N、菌體生長(zhǎng)吸光度（OD600）的變化。

圖1 菌株實(shí)驗(yàn)裝置

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的分離與鑒定

2.1.1 菌株分離純化 經(jīng)過(guò)富集分離，篩選出一株同步硝化反硝化脫氮效果好的菌株SNDB－5，其在肉汁瓊脂平板上生長(zhǎng)旺盛，菌落較大，呈乳白色。光滑，濕潤(rùn)，中間隆起，不透明，無(wú)核，邊緣整齊。通過(guò)革蘭氏染色，鑒定為革蘭氏陰性菌，在顯微鏡下觀察菌株，發(fā)現(xiàn)該菌均為桿狀菌，大小為（1.5～1.8）μm×（0.4～0.6）μm（如圖2所示）。

圖2 菌株SNDB－5的顯微照片（1000×）

2.1.2 BIOLOG鑒定結(jié)果 使用Biolog自動(dòng)菌種鑒定系統(tǒng)對(duì)該株菌進(jìn)行鑒定，該菌株鑒定種屬為Pseudomonasmendocina（如圖3所示）。

圖3 SNDB－5菌的代謝指紋特征和鑒定結(jié)果

2.1.3 SNDB－5菌株的16SrDNA基因序列、基因克隆分析 在以16SForward、16SInternal和16S Reverse為引物進(jìn)行DNA測(cè)序時(shí)，發(fā)現(xiàn)測(cè)序結(jié)果均出現(xiàn)連續(xù)套峰，懷疑是菌種不純所致，因此采取了克隆測(cè)序。

質(zhì)粒CTD445－XT1－2測(cè)序結(jié)果符合實(shí)驗(yàn)要求。登陸NCBI網(wǎng)站，將質(zhì)粒進(jìn)行序列比對(duì)，分別篩選出10余種與其相似的菌種，利用MEGA4軟件，采取鄰近法對(duì)質(zhì)粒構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

將測(cè)得的CTD445－XT1－2的16SrDNA序列在GenBank中進(jìn)行BLAST比對(duì)，所獲得的同源序列均為Pseudomonas屬的16SrDNA序列。

將 CTD445－XT1－2 的 16SrDNA 序 列 與 Gen－Bank中相似的14種已知菌的序列進(jìn)行多序列比對(duì)，運(yùn)用MEGA4軟件做出進(jìn)化樹(shù)，如圖4所示。

圖4 依據(jù)16SrDNA序列構(gòu)建的SNDB－5及相關(guān)種的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

由 圖3可知CTD445－XT1－2 與 EU636659.1（Pseudomonasmendocina）同源性最近，相似性高達(dá)99%。

通過(guò)BIOLOG和分子生物學(xué)鑒定，結(jié)合菌株的形態(tài)學(xué)和生理學(xué)特性，可基本確定分離的菌株為Pseudomonasmendocina。菌株SNDB－5與現(xiàn)已報(bào)道的好氧同步硝化反硝化菌均不相同。目前已報(bào)道的Pseudomonasmendocina具有反硝化作用，而關(guān)于硝化作用尚無(wú)報(bào)道。

2.2 菌株SNDB－5的硝化作用

以NaNO2（濃度為0.1%）為惟一的氮源，培養(yǎng)基在121℃滅菌20min后，取20mL放入120mL的培養(yǎng)瓶中，菌株活化后接種于該液體培養(yǎng)基中，菌株在以NaNO2為氮源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)，菌體生長(zhǎng)曲線及溶液中NO3－濃度的變化曲線如圖5示。由圖4可知，菌體的硝化主要是在菌體的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期發(fā)生的，而在菌體進(jìn)入衰亡期后，溶液中的NO3－的濃度一直處于很低的濃度水平。碳酸鈉在好氧硝化過(guò)程中起著非常重要的作用，它不但作為細(xì)菌Pseudomonasmendocina生長(zhǎng)所需的碳源，也是菌株進(jìn)行硝化過(guò)程中能量的來(lái)源，在C／N比為2～3時(shí)，硝化速率達(dá)到最大［18］。本實(shí)驗(yàn)中C／N 約為1.6，可能尚未達(dá)到該菌株最佳C／N比，需要進(jìn)一步研究，以確定此時(shí)它的最大硝化速率。

圖5 菌株SNDB－5的硝化作用

2.3 不同亞硝酸鹽負(fù)荷對(duì)菌株SNDB－5的硝化作用的影響

以不同濃度 NaNO2（25、50、100、150mg／L）為惟一的氮源，培養(yǎng)基在121℃滅菌20min后，取20 mL放入120mL的培養(yǎng)瓶中，菌株活化后接種于該液體培養(yǎng)基中，菌株在以不同濃度NaNO2為氮源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)，溶液中NO2－濃度的變化曲線如圖6示。由圖6可知，菌株SNDB－5在亞硝酸鹽負(fù)荷為50mg／L時(shí)，亞硝酸鹽去除效率最高為66%。在亞硝酸鹽負(fù)荷為25mg／L時(shí)，亞硝酸鹽去除率只有19%。當(dāng)亞硝酸鹽負(fù)荷大于50mg／L時(shí)，亞硝酸鹽去除率隨之下降，在亞硝酸鹽負(fù)荷為100mg／L時(shí)，亞硝酸鹽去除率為64%，亞硝酸鹽負(fù)荷為150 mg／L時(shí)，亞硝酸鹽去除率為48%。

隨著亞硝酸鹽負(fù)荷的提高，亞硝酸鹽去除率降低，可以推斷出隨著水中的亞硝酸鹽的濃度加大，菌株SNDB－5的活性受到了抑制。

圖6 亞硝酸鹽負(fù)荷對(duì)SNDB－5生長(zhǎng)的影響

3 結(jié) 語(yǔ)

1）分離的菌株SNDB－5經(jīng)鑒定為Pseudomonas mendocina，它與目前所報(bào)道的好氧硝化反硝化菌均不相同，表明了自然界中好氧硝化反硝化菌的生物多樣性，對(duì)揭示好氧硝化反硝化菌群的生態(tài)學(xué)有重要的意義。

2）菌株SNDB－5能分別適應(yīng)不同的亞硝酸鹽濃度，當(dāng)亞硝酸鹽負(fù)荷大于50mg／L時(shí)，亞硝酸鹽去除率隨之下降，在亞硝酸鹽負(fù)荷為100mg／L時(shí)，亞硝酸鹽去除率為64%，亞硝酸鹽負(fù)荷為150mg／L時(shí)，亞硝酸鹽去除率為48%。使得該菌株適應(yīng)力較強(qiáng)，可能存在于含有高氮素濃度的活性污泥中，有應(yīng)用于污水好氧硝化反硝化脫氮處理的潛力。隨著亞硝酸鹽負(fù)荷的提高，菌株SNDB－5的活性受到了抑制。

3）低溫條件下硝化反硝化脫氮菌的分離成功為后續(xù)高效工程菌的構(gòu)建及工程應(yīng)用研究提供了理論支撐和前提條件，使低溫地區(qū)污水處理廠在冬季運(yùn)行時(shí)提高脫氮率成為可能。

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