影響輻射小鼠肝臟SOD及MDA活性的孔石莼多糖研究

張宸閣，高雯欣，盧衛(wèi)紅

(1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150090;2.黑龍江省質(zhì)量監(jiān)督檢測研究院，黑龍江 哈爾濱 150010)

孔石莼(Ulva pertusa Kjellm)是一種石莼科石莼屬的大型綠藻，俗稱為海白菜、海菠菜、豬母菜、海葛茵等。廣泛分布于西太平洋沿海，在我國遼寧、河北、山東和江蘇等沿海均有分布，資源十分豐富［1］。其味甘咸，性寒，有降低膽固醇和清熱解毒、軟堅(jiān)散結(jié)、利水減壓的功效。在民間常利用其與其它藥用植物配合來治療中暑、頸淋巴結(jié)腫、甲狀腺腫、瘡疔、急慢性腸胃炎、高血壓、水腫和小便不利、喉炎等病癥［2－3］。

孔石莼藻體中含有大量多糖，均以雜多糖形式存在，水解后可得到多種單糖，包括鼠李糖、葡萄糖、木糖、三碳糖、褐藻糖、甘露糖、半乳糖、和阿拉伯糖等［2］?？资恢泻兴姆N相對分子量的水溶性多糖(151.7、64.5、58.0 和 28.2ku)［4］。有研究顯示，孔石莼多糖具有降血脂，抗病毒，抗腫瘤活性，降膽固醇，抗凝血以及治療心血管疾病等作用［5］。

為了進(jìn)一步了解不同相對分子量段孔石莼多糖在體內(nèi)條件下對輻照所致哺乳動物肝組織損傷的抑制作用，為孔石莼多糖用于抗輻射作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。實(shí)驗(yàn)以小鼠肝臟組織SOD及MDA活性作為實(shí)驗(yàn)依據(jù)，對不同相對分子量段孔石莼多糖拮抗輻照致肝組織損傷的作用進(jìn)行了探索。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

孔石莼藻體，采集自大連沿海。昆明種小鼠30只，6～10周齡，體質(zhì)量18～22g，均為雄性，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。MDA和SOD試劑盒，由南京建成生物公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

CLINAC21EX醫(yī)用電子直線加速器(VARIAN公司，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院提供);微濾膜(0.45μm，0.25μm，上海市新亞凈化器件廠);超濾膜(30ku，100ku)、超濾杯(上海市摩速科學(xué)器材有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 不同分子量孔石莼多糖的制備

孔石莼藻體粉末經(jīng)85%乙醇80℃回流3次，離心，取沉淀在40℃下減壓干燥，得到脫脂及醇溶性色素的孔石莼藻體。乙醇回流后藻體用20倍蒸餾水于100℃水浴下攪拌提取1h，過濾，取濾液，濾渣再重復(fù)提取2次，棄濾渣，合并3次提取的濾液。濃縮后，加入4倍體積95%乙醇進(jìn)行沉淀，離心，棄上清，得到粗多糖。

通過Sevag法對粗多糖進(jìn)行脫蛋白，重復(fù)2次。經(jīng)過除蛋白處理后的多糖進(jìn)行濾紙抽濾處理，之后分別用0.45μm和0.25μm微濾膜進(jìn)行預(yù)處理，以除去浸提液中的大分子物質(zhì)。

選擇30Ku和100Ku兩種分子量的超濾膜對預(yù)處理后的多糖進(jìn)行超濾分級，最終將多糖分為≧100Ku分子量、30～100Ku分子量及≦30Ku分子量三種不同分子量段多糖。

1.3.2 模型的建立及肝組織勻漿的制備

將小鼠隨機(jī)分為≧100Ku分子量多糖組、30～100Ku分子量多糖組、≦30Ku分子量多糖組，以及空白對照組和輻照對照組，每組6只。

對三個不同分子量段組的小鼠分別進(jìn)行對應(yīng)分子量段多糖藥品灌胃，多糖藥品的濃度均為20mg/ml，每天1次，每次0.2mL，連續(xù)灌胃21天;空白對照組及輻照對照組灌服等體積蒸餾水。第21天灌胃后，除空白對照組外各組均通過醫(yī)用電子直線加速器進(jìn)行4.0Gy劑量輻照。劑量率為1.00Gy/min，照射野為20cm×20cm，皮源距為100cm，輻照后24h頸椎脫臼法處死小鼠。

迅速取出小鼠的肝臟組織，在生理鹽水中清洗后置于研缽中，向其中注入少許液氮，用缽杵進(jìn)行快速研磨，使肝臟組織充分勻漿化。向研缽中加入一定體積的0.86%冷生理鹽水，充分混合后轉(zhuǎn)移至離心管，補(bǔ)充生理鹽水至加入生理鹽水的總體積為肝臟自身重量的9倍，制備成10%的肝組織勻漿。利用離心機(jī)以2 000r/min的轉(zhuǎn)速離心10min，棄沉淀取上清備用。

1.3.3 肝臟組織勻漿蛋白含量的測定

肝臟組織勻漿蛋白含量通過考馬斯亮藍(lán)法來測定［6］。

試劑配制:1)BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:在100mL蒸餾水中加入20mg BSA，即為200μg/mL的BSA原液。2)考馬斯亮藍(lán)G－250試劑的配制:在50mL 95%(V/V)的乙醇中加入100mg的考馬斯亮藍(lán)G－250，充分溶解后加入120mL的85%(W/V)磷酸，用蒸餾水定容到1 000mL。配制好的考馬斯亮藍(lán)G－250試劑轉(zhuǎn)移至棕色瓶當(dāng)中于常溫下可保存1個月。

標(biāo)準(zhǔn)曲線測定:經(jīng)測定0～200μg/mL BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，得到回歸方程:y=0.005x+0.017，R2=0.999 1。

圖1 考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線

樣品測定:取出根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定范圍稀釋的樣品溶液1mL，取考馬斯亮藍(lán)G－250試劑5mL加入其中后充分進(jìn)行震蕩混合，經(jīng)過2min染色后，在595nm波長測吸光度OD595值，并將其代入標(biāo)準(zhǔn)曲線求出樣品相應(yīng)的蛋白濃度。

1.3.4 超氧化物歧化酶(SOD)活性的測定

按南京建成公司SOD試劑盒說明書來加入試劑。

試劑加入后，充分混勻，在室溫下放置10min，用1cm光徑比色杯于波長550nm處，用蒸餾水進(jìn)行調(diào)零，進(jìn)行OD值的測定。

備注:在預(yù)實(shí)驗(yàn)中通過抑制率計(jì)算公式等最終確定實(shí)驗(yàn)中所取的蒸餾水及樣本量為0.001mL。

計(jì)算公式:

1.3.5 脂質(zhì)過氧化物(MDA)含量測定

按南京建成公司MDA試劑盒說明書來加入試劑。

通過漩渦混勻器將其混勻后，將試管口用保鮮膜扎緊，并用針頭在上面捅一個小孔，置于95℃下水浴40min，取出后在流水下對其冷卻。之后在4 000r/min轉(zhuǎn)速下進(jìn)行低速離心10min，取上清，用1cm光徑比色杯在波長532nm處，用蒸餾水進(jìn)行調(diào)零，測得各管的OD值。

通常情況下，每批當(dāng)中應(yīng)做標(biāo)準(zhǔn)管，標(biāo)準(zhǔn)空白管以及測定空白管1～2支，但由于在預(yù)實(shí)驗(yàn)當(dāng)中發(fā)現(xiàn)測定管中的蛋白含量不是太高，因而測定空白管沒有測定，而是由標(biāo)準(zhǔn)空白管進(jìn)行替代。

肝組織中MDA含量計(jì)算公式:

2 結(jié)果與分析

通過1.3.4所示方法測定各組小鼠肝組織TSOD含量，結(jié)果如表1，圖2中所示。

從表1中可看出，空白對照組中SOD含量最高，相較之下，其他經(jīng)輻照處理組的SOD含量低很多(P＜0.01)。表明4.0Gy劑量的輻照能導(dǎo)致小鼠肝臟中SOD活性顯著降低。

表1 各組肝組織SOD和MDA含量比較(s)

表1 各組肝組織SOD和MDA含量比較(s)

注:與輻照對照組相比，*P＜0.05，＊＊P ＜0.01。

組別 n SOD含量(U/mgprot)MDA含量(nmol/mgprot)6 462.56±10.14 6.85±0.27輻照對照組 6 294.31±7.28 10.27±0.56≧100ku多糖組 6 310.25±11.21* 10.31±0.37 30～100ku多糖組 6 321.74±5.24＊＊ 8.62±0.19＊＊≦30ku多糖組 6 363.93±6.10＊＊ 8.93±0.43空白對照組＊＊

圖2 各組肝臟組織SOD含量比較柱形圖

從圖2可明顯看到，相較于輻照組，各多糖給樣組的T－SOD均有所升高，其中≧100ku多糖組有一定的提高(P＜0.05)，而30～100ku多糖組和≦30ku多糖組兩組則有更為明顯的提高(P＜0.01)，故而可知三種分子量段多糖對輻照降低SOD含量有一定的抑制作用，其中較小的兩種分子量段多糖的這種抑制作用更為明顯。

通過1.3.5所示方法測定各組小鼠肝組織MDA含量，結(jié)果如表1，圖3中所示。

從表1中可看出，空白對照組中MDA含量最低，與之相比，其他各組經(jīng)輻照后MDA含量均有明顯上升(P＜0.01)。表明4.0Gy劑量的輻照能導(dǎo)致小鼠肝臟中MDA含量顯著升高。由于MDA能使酶分子中氨基酸發(fā)生交聯(lián)、肽鏈斷裂，形成新的聚合物，從而產(chǎn)生新的大分子，使原來酶活性喪失或改變，破壞細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)，使膜內(nèi)外離子交換紊亂加速自由基的產(chǎn)生［7］，故而可推測4.0Gy劑量輻照對小鼠臟器細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)有不同程度的損害作用。

圖3 各組肝組織MDA含量比較柱形圖

從圖3中各組的對比可看出，輻照可明顯增加肝臟組織當(dāng)中的MDA的含量。與輻照對照組比較，≧100ku多糖組的MDA含量并無明顯變化，而30～100ku多糖組和≦30ku多糖組兩組則出現(xiàn)了較為明顯的減少(P＜0.01)。由此可知30～100ku和≦30ku兩個分子量段的多糖對輻照提升MDA含量有較為明顯的抑制作用。

3 討論

隨著科學(xué)水平的提高及核能技術(shù)在各領(lǐng)域的推廣和發(fā)展普及，使得核能與人們平常的生活密不可分，正因?yàn)檫@樣，人體受到放射線輻射傷害的機(jī)會也大大增加。前不久日本福島核電站放射性物質(zhì)泄露，對海面及周邊領(lǐng)域造成了大面積的放射性污染，對周圍地區(qū)和國家的居民造成了傷害，這在無形當(dāng)中都促使著人們加大開展對抑制輻照危害的研究。輻射對機(jī)體造成損害，其間接作用于機(jī)體內(nèi)水分子，可產(chǎn)生大量的自由基，對機(jī)體細(xì)胞和組織產(chǎn)生氧化傷害作用。

自由基能攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用，并因此形成丙二醛MDA等脂質(zhì)過氧化物。MDA具有細(xì)胞毒性，會引起蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合，對機(jī)體細(xì)胞造成損傷［8］。因此測定MDA的量常?？煞从硻C(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接反映出細(xì)胞損傷的程度。超氧化物歧化酶(SOD)能清除掉超氧陰離子自由基(O－2·)，保護(hù)細(xì)胞使其免受損傷，故而其在機(jī)體的氧化與抗氧化的平衡當(dāng)中起著至關(guān)重要的作用［9］。

通過對SOD活性和MDA含量測定的結(jié)果比照發(fā)現(xiàn)，30～100ku和≦30ku兩個分子量段的多糖在小鼠輻照后均明顯提升了其肝臟中SOD的活性并有效降低了其MDA的含量，顯示這兩個分子量段的多糖對肝臟有一定的輻射損傷保護(hù)作用。

本研究實(shí)驗(yàn)通過不同組小鼠肝臟組織SOD及MDA活性含量測定比較對不同分子量段孔石莼多糖致輻照引起的小鼠機(jī)體氧化損傷的抑制作用進(jìn)行了初步研究。結(jié)果顯示，在三種分子量段的孔石莼多糖組中，小鼠的SOD活性與輻照對照組的相比，三個多糖組均有顯著性差異(P＜0.05或P＜0.01)，其中30～100ku和≦30ku兩個分子量段多糖組均具有明顯的差異(P＜0.01);小鼠的MDA活性與輻照對照組的相比，≧100ku分子量段多糖組無顯著性差異，而30～100ku和≦30ku兩個分子量段多糖組均具有明顯的差異(P＜0.01)。說明低分子量段孔石莼多糖對輻照引起的小鼠肝臟的氧化傷害產(chǎn)生了明顯的抑制作用。

從本次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，可以初步得出這樣的結(jié)論:低分子量段孔石莼多糖對小鼠肝臟組織的氧化損傷具有一定的保護(hù)功能，可作為臨床上應(yīng)用輻照進(jìn)行腫瘤理療及其他高輻射環(huán)境下作業(yè)時的輔助用藥，對于降低輻照致動物肝臟組織損傷具有重要的意義。但是，全面評價孔石莼多糖抑制輻照的肝臟組織氧化損傷作用，揭示其抗誘變作用的物質(zhì)基礎(chǔ)和機(jī)理，以及單一分子量段孔石莼多糖抗輻射抗氧化的量效關(guān)系還需要進(jìn)一步的深入研究。

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