延胡索乙素對(duì)老年大鼠紅細(xì)胞膜影響的實(shí)驗(yàn)研究

馬伯艷，袁良杰，牛雯穎，肖洪彬

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

延胡索乙素(dl－tetrahydropalmatine，dl－THP)為罌粟科紫堇屬植物延胡索(Corydalisyanhusuo W.T.Wang)中主要成分。本課題組研究已表明，dl－THP對(duì)老齡大鼠紅細(xì)胞聚集性增高有很好的改善作用，同時(shí)對(duì)紅細(xì)胞變形性也有一定影響。因此，我們擬進(jìn)一步從紅細(xì)胞膜成分變化角度就dl－THP改善血液流變學(xué)機(jī)制進(jìn)行研究。

1 材料

1.1 動(dòng)物

清潔級(jí)健康Wistar老齡大鼠40只，清潔級(jí)健康Wistar青年大鼠10只，均由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)提供(合格證號(hào)SCXK(黑)2008004)，室溫20～22℃，自由飲水，飼固體飼料。

1.2 藥物

羅痛定片(主要成分為延胡索乙素，四川金藥師制藥有限公司，批號(hào)091101);阿司匹林片(黑龍江百泰藥業(yè)有限公司，批號(hào)100101)。

1.3 試劑

PBS(pH=7.4，NaCl 6g，KCl 0.2g，KH2PO40.2g和 Na2HPO41.56g，溶于800 ml蒸餾水，1mol/L HCl調(diào)節(jié)溶液 pH值至7.4，蒸餾水定容至1L，4℃冰箱保存);Tris－HCl(pH=7.4，0.605g Tris溶于800ml蒸餾水中，1mol/L HCl調(diào) pH值，補(bǔ)至終體積1L，4℃冰箱保存);1%抗凝劑;2ml肝素鈉注射液(每瓶 2ml，12500U)加10.5ml生理鹽水而成;1mmol/mL PMSF(0.0174g PMSF用異丙醇溶解，定容于10ml，現(xiàn)用現(xiàn)配);20%烏拉坦(20g氨基甲酸乙酯用生理鹽水溶解，定容至100ml即可，密封常溫保存)。

總膽固醇試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司);唾液酸試劑盒、巰基試劑盒、SOD試劑盒、MDA試劑盒、ATP酶試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.4 儀器

KQ－800KDE型高功率數(shù)控超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司);722分光光度計(jì)(山東高密分析儀器廠);BECKMAN超速離心機(jī)(美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司);TGL－16G型高速臺(tái)式離心機(jī)(上海醫(yī)用分析儀器廠);分析天平(梅特勒托利多儀器(上海)有限公司);Waters 2695高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司);ELSD 2000型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(美國(guó)Alltech公司)。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組及給藥

25～36月齡Wistar大鼠40只，雌雄各半，體質(zhì)量(320±46)g，按體重隨機(jī)分為延胡索乙素高(延高)、低劑量組(延低)、老齡空白組(老齡空白)、阿司匹林組，每組10只;另取3～4月齡Wistar青年大鼠10只，雌雄各半，體質(zhì)量(108±19)g，作為青年空白組(青齡空白)。延胡索乙素高劑量組按132.8mg/kg濃度灌胃給藥、低劑量組按33.2mg/kg濃度灌胃給藥，阿司匹林組按13.83mg/kg濃度灌胃給藥，各組按10ml/kg體積灌胃，每日1次，連續(xù)給藥14天。

2.2 取血及紅細(xì)胞膜制備

取血前禁食24h，不禁水，末次給藥1h后，大鼠腹腔注射20%烏拉坦5ml/kg麻醉，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈，采血測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)及制備紅細(xì)胞膜。

取新鮮肝素抗凝血 5ml，以 3 000r/min離心10min，棄上清，除去中間層(主要為白細(xì)胞和血小板)，以1∶3比例加入等滲pH 7.4 PBS，3 000r/min離心10min，棄上清，反復(fù)洗滌3次，得到紅細(xì)胞懸液。向紅細(xì)胞懸液中以1∶80比例加入預(yù)冷5mmol/L pH 7.4 Tris－HCl溶液，同時(shí)加入苯甲基磺酰氟(PMSF)0.1mmol/L，以80Hz 20℃超聲15min，放入4℃溶血過夜，將所得紅細(xì)胞溶血液以15 000r/min離心10min，棄上清，再加入 5mmol/L pH 7.4 Tris－HCl溶液，以15 000r/min離心10min，反復(fù)洗滌3次至乳白色膜，將其1∶1懸浮在PBS溶液中。

2.3 Na+－K+－ATP酶活性及膽固醇含量測(cè)定

Na+－K+－ATP酶活性采用比色法，按照試劑盒操作測(cè)定。紅細(xì)胞膜膽固醇含量測(cè)定采用高效液相色譜法。

2.4 唾液酸含量及巰基含量測(cè)定 唾液酸含量測(cè)定采用5－甲基苯二酚絡(luò)合法檢測(cè);巰基含量測(cè)定采用比色法，按照試劑盒說明書規(guī)定操作。

2.5 紅細(xì)胞膜SOD活力及MDA含量測(cè)定 SOD活力測(cè)定采用黃嘌呤氧化酶法檢測(cè);MDA含量測(cè)定采用TBA(硫代巴比妥酸)法。按照試劑盒說明書進(jìn)行。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 紅細(xì)胞膜膽固醇含量及Na+－K+－ATP酶活性的影響 結(jié)果見表1。

表1 延胡索乙素對(duì)紅細(xì)胞膜膽固醇含量及Na+－K+－ATP酶活性的影響(s，n=10)

表1 延胡索乙素對(duì)紅細(xì)胞膜膽固醇含量及Na+－K+－ATP酶活性的影響(s，n=10)

注:與老齡空白組比較，*P﹤0.05，＊＊P﹤0.01。

組別 劑量(mg/kg)Na+－K+－ATP酶(μmolPi/mgprot/hour)膽固醇含量(mmol/mg膜蛋白)老齡空白 － 1.402 ±0.134 1.098 ±0.231青齡空白 － 2.076±0.222＊＊ 0.913±0.087*延高 132.8 1.653 ±0.127* 0.846 ±0.142＊＊延低 33.2 1.629 ±0.323 0.800 ±0.283＊＊阿司匹林13.83 1.505 ±0.350 1.053 ±0.187

由表1可見，延胡索乙素高劑量組可增加老年大鼠紅細(xì)胞膜Na+－K+－ATP酶活性(P＜0.05)，延胡索乙素兩個(gè)劑量組均可明顯降低老齡大鼠紅細(xì)胞膜膽固醇含量(P＜0.01)。

3.2 老齡鼠紅細(xì)胞膜唾液酸及巰基含量的影響 結(jié)果見表2。由表2可見，與老齡空白對(duì)照組比較，延胡索乙素高劑量組能夠明顯增加老齡大鼠紅細(xì)胞膜巰基含量(P＜0.05)，唾液酸含量有升高趨勢(shì)，但與老齡空白組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 延胡索乙素對(duì)老齡鼠紅細(xì)胞膜唾液酸及巰基含量的影響(s，n=10)

表2 延胡索乙素對(duì)老齡鼠紅細(xì)胞膜唾液酸及巰基含量的影響(s，n=10)

注:與老齡空白組比較，*P﹤0.05，＊＊P﹤0.01。

組別 劑量(mg/kg)唾液酸(mmol/gprot)巰基(mmol/gprot)老齡空白 － 0.446 ±0.110 0.264 ±0.033青齡空白 － 0.538±0.075＊＊ 0.355±0.030＊＊延高 132.8 0.495 ±0.110 0.327 ±0.033＊＊延低 33.2 0.483 ±0.084 0.276 ±0.074阿司匹林13.83 0.470 ±0.105 0.292 ±0.449

3.3 老齡大鼠紅細(xì)胞膜SOD及MDA的影響 結(jié)果見表3。

表3 延胡索乙素對(duì)老齡大鼠紅細(xì)胞膜SOD及MDA的影響(s，n=10)

表3 延胡索乙素對(duì)老齡大鼠紅細(xì)胞膜SOD及MDA的影響(s，n=10)

注:與老齡空白組比較，*P﹤0.05，＊＊P﹤0.01。

組別 劑量(mg/kg)SOD(U/mgprot)MDA(nmol/mgprot)老齡空白3.68 ±0.55 4.48 ±0.61青齡空白 － 6.09±0.34＊＊ 3.58±0.43＊＊延高 132.8 4.54 ±0.99* 3.8 ±0.4*延低 33.2 4.21 ±1.11 4.15 ±0.31阿司匹林 13.83 4.44 ±0.71 3.80 ±0.57－＊＊

由表3可見，與老齡空白對(duì)照組比較，延胡索乙素高劑量組可提高SOD活力(P＜0.05)，降低MDA水平(P＜0.05)。

4 討論

臨床上或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)時(shí)測(cè)量全血黏度常采用低切變率和高切變率進(jìn)行測(cè)定，而低切變率的全血粘度主要反映紅細(xì)胞的聚集程度，高切變率的全血粘度主要反映紅細(xì)胞的變形性。我們前期研究顯示，延胡索乙素高劑量組可明顯降低老年大鼠低切變率下全血黏度，對(duì)高切變率全血黏度有降低趨勢(shì)，同時(shí)可提高紅細(xì)胞變形能力趨勢(shì)。紅細(xì)胞具有變形性和聚集性與紅細(xì)胞膜的流變學(xué)特征，即紅細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、膜的組成成分、膜的流動(dòng)性等方面密切相關(guān)。膽固醇是紅細(xì)胞膜脂質(zhì)主要成分，其功能是提高細(xì)胞膜雙分子層機(jī)械穩(wěn)定性、調(diào)節(jié)膜流動(dòng)性及通透性、維持細(xì)胞正常代謝及形態(tài)相對(duì)穩(wěn)定。紅細(xì)胞自身不能合成膽固醇等脂質(zhì)，而是與血漿膽固醇快速實(shí)行交換，因此當(dāng)由于年齡增長(zhǎng)而使血漿膽固醇含量升高，紅細(xì)胞膜膽固醇濃度也升高，繼而引起膜膽固醇及膽固醇/磷脂比值升高，蛋白質(zhì)跨膜運(yùn)動(dòng)及磷脂側(cè)向運(yùn)動(dòng)均受到限制，膜的剛性和脆性增高，膜變形能力下降。ATP酶廣泛存在細(xì)胞質(zhì)膜上，維持胞內(nèi)外滲透壓平衡和跨膜電化學(xué)梯度，確保胞內(nèi)外離子濃度相對(duì)穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，老年大鼠與青年大鼠比較，其紅細(xì)胞膜膽固醇增加、Na+－K+－ATP酶活性降低、唾液酸含量及巰基含量明顯減少、MDA增加而SOD減少，說明老年大鼠上述紅細(xì)胞膜微觀指標(biāo)變化是其宏觀血液流變學(xué)變化的部分原因。而延胡索乙素(尤其是延胡索乙素高劑量組)可以增強(qiáng)老年大鼠紅細(xì)胞膜Na+－K+－ATP酶活性、減少紅細(xì)胞膜膽固醇含量和巰基含量、減少M(fèi)DA并增加SOD活性。說明延胡索乙素改善老年大鼠血液流變學(xué)異常的機(jī)制可能與上述指標(biāo)變化相關(guān)。