蛇床子素對癲癇大鼠電壓門控鉀通道Kv1.2表達(dá)的影響

李志強， 鄒颯楓， 曾常茜， 崔家輝， 李曉燕， 潘 心， 段春梅

癲癇(epilepsy)是一組由多種病因引起的，以腦部神經(jīng)元高度同步放電為特征的，發(fā)作性、短暫性和刻板性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性臨床綜合征。目前癲癇的發(fā)病機制仍不完全清楚，離子通道學(xué)說受到研究者的廣泛關(guān)注，鉀離子通道特別是電壓門控鉀離子通道(Kv)在促進(jìn)細(xì)胞膜恢復(fù)靜息狀態(tài)，調(diào)節(jié)興奮性方面發(fā)揮重要的作用。有研究表明蛇床子素(osthole，OST)可以通過抗炎、抗氧化及抗凋亡作用對腦缺血及再灌注引起的神經(jīng)元功能損傷起到保護(hù)作用［1］;OST對帕金森病和阿爾茲海默病的神經(jīng)元也有保護(hù)作用［2，3］。但是OST對癲癇神經(jīng)元損傷的作用尚不清楚。

本實驗通過檢測OST對鉀離子通道Kv1.2蛋白表達(dá)的影響，探討OST對癲癇的作用及機制，旨在為癲癇的治療提供一種新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 清潔級SD雄性大鼠60只(10周齡、體重220±20克)，由大連醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。實驗條件下適應(yīng)性喂養(yǎng)1w后，隨機均分為3組(n=20)即空白對照組、模型組、OST組(50mg/kg)。

1.1.2 實驗試劑 蛇床子素(純度 ＞99.8%)購于成都曼斯特生物科技有限公司;KA購于Sigma公司;抗鼠Kv1.2單克隆抗體購于alomone公司;免疫組化SP試劑盒、DAB顯色劑、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG購于北京中杉金橋;結(jié)晶紫、二甲基亞砜、NaOH購于大連綠竹;水合氯醛、考馬斯亮藍(lán)試劑盒、牛血清白蛋白(BSA)購于上海生物工程有限公司;預(yù)染 Marker、β-actin購自 Cell Signal Technology公司;RIPA裂解液、PMSF購于江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司;丙烯酰胺、SDS、甘氨酸、Tris堿、溴酚藍(lán)、Tween-20、TEMED、PVDF膜等均為Sigma公司產(chǎn)品。

1.1.3 實驗主要儀器 POWERLAB電生理記錄儀(ADinstruments/澳大利亞);DU640紫外分光光度計(Beckman/美國);顯微鏡及自動照相系統(tǒng)(Olympus/日本);蛋白電轉(zhuǎn)儀、垂直電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司/美國)。

1.2 方法

1.2.1 癲癇模型的制作 每天在同一時間點給予OST(50mg/kg)大鼠灌胃［2］，空白對照組和模型組給予等時等量生理鹽水灌胃，連續(xù)10d。第11天OST組與模型組均通過頸內(nèi)皮下注射KA10mg/kg，濃度為 5mg/ml致癇［4］，空白對照組經(jīng)頸內(nèi)皮下注射等量的生理鹽水，然后觀察各組大鼠的行為和腦電的變化。大鼠驚厥的行為表現(xiàn)采用Racine六級評價標(biāo)準(zhǔn)。Racine分級標(biāo)準(zhǔn)［5］為:0級:無任何反應(yīng);Ⅰ級:面部陣攣，包括眨眼、動須、節(jié)奏性咀嚼、濕狗樣抖動等;Ⅱ級:Ⅰ級加節(jié)律性點頭和(或)甩頭;Ⅲ級:Ⅱ級加前肢陣攣;Ⅳ級:Ⅲ級加后肢站立;Ⅴ級:Ⅳ級加雙側(cè)前、后肢強直、身體背屈強直、跌倒，持續(xù)站立和傾倒，失平衡和四肢抽動。注射KA后觀察大鼠的行為學(xué)變化并記錄，當(dāng)大鼠達(dá)Ⅳ～V級且重復(fù)的驚厥發(fā)作達(dá)10min以上或者腦電監(jiān)測為尖波、慢波、尖慢復(fù)合波時認(rèn)定大鼠致癇成功，72h后處死3組大鼠，并取腦組織進(jìn)行以下實驗。

1.2.2 大鼠行為學(xué)觀察 觀察并記錄各組大鼠癲癇發(fā)作的潛伏期，發(fā)作持續(xù)時間和緩解時間及大鼠癲癇發(fā)作Racine等級。

1.2.3 腦電的引導(dǎo)與分析 每組大鼠各取兩只行腦電監(jiān)測。應(yīng)用腦立體定位儀確定電極安裝位置:右額及右枕(右額坐標(biāo)為:前囟前3.0mm，中線旁2.0mm，硬膜下 0.5mm;右枕坐標(biāo)為:前囟后5.8 mm，中線旁 3.0mm，硬膜下 0.5mm)。用 powerlab生理記錄儀對大鼠的腦電圖進(jìn)行記錄，參數(shù)為:高通0.03S，低通 30Hz，量程 500μv ～ 3mv。分別在注射的前后監(jiān)測大鼠的EEG，每5min記錄一次，直至150min。通過腦電圖的形態(tài)、頻率以及波幅對癲癇大鼠的大腦進(jìn)行癇樣放電的判斷。

1.2.4 腦片制作 3組大鼠在10%水合氯醛(350mg/kg)腹腔麻醉下經(jīng)左心室灌注生理鹽250ml，隨后灌注4%多聚甲醛0.0lmol/L PBS(pH 7.4，4℃)250ml。將大鼠斷頭取腦，切開大腦左右半球，分別取海馬部。其中一半球用4%多聚甲醛固定24h，4℃保存。常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋。從約位于海馬區(qū)層面連續(xù)冠狀切片，腦切片每隔5片取2片，行免疫組織化學(xué)染色。將另一半球海馬迅速置于液氮罐中低溫儲存，以備行Western blot檢測。

1.2.5 免疫組化染色檢測電壓門控鉀通道Kv1.2蛋白水平 鉀通道Kv1.2表達(dá)檢測采用ABC染色方法。各組大鼠海馬做石蠟切片后常規(guī)脫蠟，微波修復(fù)抗原，自然涼至室溫。抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性后，用山羊免疫正常血清封閉非特異性結(jié)合位點，室溫孵育30min。加兔抗鼠Kv1.2單克隆抗體(1∶200)，4℃過夜。PBS洗滌5min，重復(fù)3次。加生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體，37℃孵育1h后，PBS洗滌5min，重復(fù)3次。滴加SP試劑，室溫作用20min，PBS洗滌5min，重復(fù)3次。加DAB顯色2min后，用蘇木素復(fù)染1min。脫水、透明，中性樹膠封片。顯微鏡下(×40和×400)觀察結(jié)果。用Image proplus圖像分析軟件測定海馬CA3區(qū)Kv1.2蛋白表達(dá)的平均光密度(IOD/area)，并進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.2.6 Western blot檢測電壓門控鉀通道 K v1.2蛋白水平 用RIPA裂解液提取腦組織全細(xì)胞蛋白、紫外光分光光度計測定蛋白濃度及計算上樣量;在100℃水浴中煮5min使蛋白充分變性;用蛋白電轉(zhuǎn)儀裝置進(jìn)行轉(zhuǎn)膜;NC膜放入封閉液中4℃過夜;在NC膜上均勻加入羊抗鼠Kv1.2單克隆抗體(1∶200)，37℃孵育1h，TTBS 洗滌10min，重復(fù) 3 次;加入辣根酶標(biāo)記的鏈霉親和素工作液，37℃孵育1h，TTBS洗滌10min，重復(fù)3次;滴加DAB液，避光顯色。用Lannch Doc-Itis軟件對圖片條帶行光密度測定，取各條帶累積光密度(IOD)與相對應(yīng)的β-actin內(nèi)參蛋白IOD之比即Kv1.2蛋白的相對量作統(tǒng)計分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 用SPSS13.1軟件對免疫組化檢測電壓門控鉀通道Kv1.2蛋白表達(dá)的平均光密度進(jìn)行方差分析和LSD檢驗。Kv1.2蛋白表達(dá)的IOD與β-actin蛋白的IOD比值作為蛋白表達(dá)相對量，對此進(jìn)行方差分析和LSD檢驗。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠的行為學(xué)表現(xiàn) 空白對照組大鼠頸內(nèi)皮下注射生理鹽水后與前未見行為學(xué)變化。模型組大鼠頸內(nèi)皮下注射KA后，15min左右開始出現(xiàn)動須、濕狗樣抖動等Ⅰ級反應(yīng);30min左右出現(xiàn)頸部肌肉痙攣、節(jié)律性點頭、一側(cè)前肢陣攣等Ⅱ、Ⅲ級表現(xiàn);60min出現(xiàn)雙側(cè)前、后肢強直、身體背屈強直、跌倒、站立和傾倒、失平衡和四肢抽動等Ⅳ、Ⅴ級表現(xiàn)，說明大鼠達(dá)到癲癇持續(xù)狀態(tài)，并持續(xù)約30～60min，隨后抽搐、痙攣等行為減少，變安靜。OST組大鼠注射KA后，30min后出現(xiàn)呼吸急促、躁動不安、節(jié)律性咀嚼、偶發(fā)濕狗樣抖動等Ⅰ級反應(yīng);約90min后出現(xiàn)濕狗樣抖動的頻率和幅度均增加、點頭、一側(cè)前肢出現(xiàn)痙攣等Ⅱ、Ⅲ級表現(xiàn);180min后大鼠四肢痙攣、直立、跌倒、翻轉(zhuǎn)、口吐白沫、持續(xù)約1～5min等Ⅳ、Ⅴ級表現(xiàn)，但發(fā)作的程度較模型組大鼠輕;大約240min后大鼠的抽搐及痙攣行為明顯減少;24h后大鼠偶有濕狗樣抖動發(fā)作。蛇床子素各組大鼠癲癇發(fā)作的潛伏期較模型組時間長，發(fā)作程度較模型組輕，發(fā)作時間以及持續(xù)時間較模型組短?？瞻讓φ战M大鼠未發(fā)現(xiàn)異常。

2.2 腦電圖檢測結(jié)果 空白對照組大鼠腦電圖(EEG)示彌漫α波，波幅均勻一致;模型組大鼠癲癇發(fā)作時，EEG示大量的棘波、尖波、棘-慢波和尖-慢波，節(jié)律不規(guī)則。OST組大鼠癲癇發(fā)作時，EEG示棘波、尖波的頻率和波幅較癲癇組大鼠明顯降低 (見圖1)。

2.3 大鼠 Kv1.2蛋白表達(dá)的檢測結(jié)果 Kv 1.2蛋白在各組大鼠海馬均有表達(dá)，并以錐體細(xì)胞層和齒狀回顆粒細(xì)胞層表達(dá)最為明顯。高倍鏡下可見陽性細(xì)胞，表現(xiàn)在胞漿與胞膜上為棕黃色顆粒而胞核為藍(lán)色，以CA3區(qū)較明顯(見圖2、圖3)。模型組大鼠的陽性細(xì)胞數(shù)較空白對照組和蛇床子素組少，且陽性細(xì)胞著色淺，少有突起。模型組的平均光密度值(0.053 ±0.012)分別較對照組(0.089 ±0.009)和蛇床子素組(0.084 ±0.017)顯著減少(P＜0.05);對照組與蛇床子素組的平均光密度值無顯著性差異(P ＞0.05)。

圖1 各組大鼠腦電圖檢測結(jié)果

2.4 大鼠Kv1.2蛋白相對濃度的檢測結(jié)果Western blot蛋白免疫印跡檢測顯示，在分子量為57kD處有明顯的蛋白條帶，對照組與蛇床子素組較模型組蛋白條帶明顯增寬，且蛇床子素組與對照組之間差異不明顯。結(jié)果提示:各組大鼠海馬神經(jīng)元CA3區(qū)均有Kv1.2蛋白表達(dá);模型組大鼠海馬神經(jīng)元CA3區(qū)Kv1.2蛋白相對濃度減少，蛇床子素組大鼠Kv1.2蛋白相對濃度較模型組多，這與免疫組化檢測結(jié)果相一致。模型組(0.794)與蛇床子素組(0.997)、對照組(1.027)大鼠海馬CA3區(qū)Kv1.2蛋白相對濃度有明顯差異。模型組與對照組和蛇床子素組比較均P＜0.05;對照組與蛇床子素組比較P＞0.05。

3 討論

癲癇的病變基礎(chǔ)是神經(jīng)元高度同步化異常放電，而異常放電是由離子異常跨膜運動所致，后者的發(fā)生與離子通道的結(jié)構(gòu)和功能異常有關(guān)。癲癇的發(fā)病機制仍不完全清楚，但一些發(fā)病關(guān)鍵環(huán)節(jié)已經(jīng)為人類所知，離子通道學(xué)說受到研究者的廣泛認(rèn)同，鉀離子通道特別是電壓門控鉀離子通道(Kv)在促進(jìn)細(xì)胞膜恢復(fù)靜息狀態(tài)、調(diào)節(jié)興奮性方面發(fā)揮重要的作用［6］。

調(diào)控離子通道的神經(jīng)遞質(zhì)和調(diào)質(zhì)功能障礙又是引起離子通道功能異常的主要原因。神經(jīng)遞質(zhì)分為興奮性神經(jīng)遞質(zhì)和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)。KA是人工合成的腦內(nèi)興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸的類似物，主要作用于離子型谷氨酸受體。給予大鼠系統(tǒng)注射KA可以選擇性地激活邊緣系統(tǒng)特別是海馬錐體神經(jīng)元，并伴隨一系列病理學(xué)變化如神經(jīng)細(xì)胞丟失、錐體細(xì)胞軸突側(cè)枝芽生新的谷氨酸突觸聯(lián)系等，引起急性癲癇發(fā)作［7］。用KA制作的大鼠癲癇模型，海馬結(jié)構(gòu)的形態(tài)變化主要在于CA3區(qū)，且在注射KA后72h達(dá)高峰，可以很好地模擬人類顳葉癲癇的發(fā)作行為學(xué)和病理學(xué)改變。

蛇床子素又名甲氧基歐芹酚或歐芹酚甲醚(osthole，OST)，其化學(xué)名稱為7-甲氧基-8-異戊烯基香豆素，是1909年首先從傘形科植物蛇床成熟果實蛇床子(frucrus cnidii)中提取分離出的天然香豆素類單體(C15H16O3)。OST能很好地通過血腦屏障，且在中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有抗缺血性腦損傷、抗癡呆、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗帕金森病等藥理作用［8］。Luszczki等［9］應(yīng)用最大電休克誘導(dǎo)小鼠制作癲癇發(fā)作模型，觀發(fā)現(xiàn)OST具有明確的抗電休克所致的發(fā)作效應(yīng)，但其機制未闡明。

本實驗通過頸內(nèi)皮下注射KA建立實驗性癲癇大鼠動物模型，將大鼠分為空白對照組、模型組、OST干預(yù)組，對大鼠海馬CA3區(qū)瞬時外向鉀離子通道Kv1.2蛋白進(jìn)行免疫組化和Western blot檢測。經(jīng)過OST預(yù)處理的KA致癇大鼠CA3區(qū)Kv1.2蛋白表達(dá)明顯增加，且與空白對照組比較未見明顯差異。實驗結(jié)果顯示，OST可通過降低癲癇大鼠Kv 1.2蛋白的減少程度而減少大鼠的神經(jīng)元凋亡，進(jìn)而對神經(jīng)元起到保護(hù)作用。最近研究發(fā)現(xiàn)，鉀通道Kv1.2蛋白表達(dá)減少與全身強直-陣攣發(fā)作性癲癇發(fā)病機制密切相關(guān)［10］，主要原因為Kv1.2蛋白表達(dá)減少或活性減低可以導(dǎo)致神經(jīng)元高度興奮，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡。Kv1.2蛋白表達(dá)減少主要是由于Kv1.2蛋白磷酸化所致，而這種磷酸化主要通過PI3-K凋亡信號通路調(diào)節(jié)［11］。有研究顯示，Kv1.2蛋白表達(dá)同時也受到炎癥因子IL-1β和TNF-α以及活性氧(ROS)的影響［12］。這與蛇床子素在帕金森和阿爾茨海默中的作用機制類似。所以O(shè)ST可能通過PI3-K通路減少對Kv1.2蛋白的磷酸化，以及發(fā)揮OST抗炎抗氧化的作用，共同增加Kv1.2蛋白表達(dá)來實現(xiàn)對神經(jīng)元的保護(hù)作用。因此，OST可能為鉀離子通道開放劑;通過增加Kv1.2蛋白表達(dá)從而減少對神經(jīng)元的損傷，這為癲癇的治療開辟了新的道路。

圖2 大鼠海馬CA3區(qū)Kv1.2表達(dá)的免疫組化染色(DAB染色，蘇木素復(fù)染，×40)，A:對照組;B:模型組;C:蛇床子素組

圖3 大鼠海馬CA3區(qū)Kv1.2表達(dá)的免疫組化染色(DAB染色，蘇木素復(fù)染，×400)，A:對照組;B:模型組;C:蛇床子素組

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