MCAO大鼠梗死灶對(duì)側(cè)皮層Nogo-A的動(dòng)態(tài)變化及電針干預(yù)

梁艷桂， 譚 峰， 陳 杰， 吳?？?， 萬賽英王海僑， 王學(xué)文， 黃勛福， 韓福蘭， 吳 強(qiáng)

目前，國內(nèi)外急性腦梗死(acute cerebral infarction，ACI)的研究主要集中在如何減輕梗死灶局部神經(jīng)損傷和增強(qiáng)周圍組織的代償能力方面，而對(duì)遠(yuǎn)隔病灶部位繼發(fā)性損害極少關(guān)注。研究證實(shí)，ACI損害并不限于梗死灶局部，遠(yuǎn)隔部位也發(fā)生繼發(fā)性損害，并阻礙神經(jīng)功能的恢復(fù)［1，2］。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，Nogo-A參與ACI丘腦繼發(fā)性損害，電針對(duì)高血壓腦缺血損傷的保護(hù)作用可能與其下調(diào)神經(jīng)抑制因子neurocan-mRNA與Nogo-A表達(dá)等機(jī)制有關(guān)［3～5］。但電針對(duì)ACI遠(yuǎn)隔損害有無影響?對(duì)Nogo-A抑制信號(hào)傳導(dǎo)有何作用?能否通過調(diào)控Nogo-A抑制信號(hào)傳導(dǎo)通路蛋白表達(dá)來減輕腦梗死遠(yuǎn)隔損害，促進(jìn)CNS修復(fù)?這些問題還不清楚，國內(nèi)外亦未見翔實(shí)的研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用改良Zea Longa法制備大鼠大腦中動(dòng)脈的缺血再灌注模型，應(yīng)用免疫組織化學(xué)法及透射電鏡技術(shù)觀察電針對(duì)腦缺血再灌注大鼠腦梗死灶對(duì)側(cè)皮層不同時(shí)期Nogo-A表達(dá)、細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響，探討電針促進(jìn)神經(jīng)功能修復(fù)的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組 SPF級(jí)雄性SD大鼠130只，重(240±40)g，月齡3個(gè)月，由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，普通顆粒飼料和自來水喂養(yǎng)，室溫控制在15℃ ～24℃。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SCXK(粵)為2008-0002，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)為0065739。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為5組:電針組(30只)、假穴位組(30只)、模型組(30只)、假手術(shù)組(30只)和空白組(10只)。

1.2 試劑及儀器 兔抗大鼠 Nogo-A:Santa Cruz Biotechnology公司;SABC顯色試劑盒:武漢博士德生物工程有限公司;多導(dǎo)生理記錄儀:德國HU GO SACHSEL EKTONIK;JEM1200-EX型透射電鏡:日本電子公司;顯微鏡:日本Olympus Ixto倒置顯微鏡;全自動(dòng)圖像分析儀:德國Kontron IBAS 2.0全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng);JVC ky-F30B 3-CCD彩色圖像攝錄輸入儀。

1.3 MCAO模型制作 采用改良的Zea Longa法［6］制備左側(cè)MCAO模型。用3%戊巴比妥鈉(0.2 ml/100g)腹腔麻醉后，經(jīng)頸部正中切口逐層分離組織，暴露和分離左側(cè)頸總動(dòng)脈(common carotid artery，CCA)、頸外動(dòng)脈(exterior carotid artery，ECA)和頸內(nèi)動(dòng)脈(interior carotid artery，ICA)，結(jié)扎并游離ECA及其分支，沿ICA向下分離翼腭動(dòng)脈(pterygopalatine artery，PPA)。于ECA殘端起始部剪一小口，輕輕插入制備好的尼龍線，快到達(dá)PPA時(shí)，用鑷子輕輕夾住PPA起始部，讓尼龍線順利進(jìn)入ICA顱內(nèi)段，尼龍線插入深度以CEA分叉處開始計(jì)算約為(18±0.5)cm?？p合皮膚。再灌注時(shí)外拉尼龍線使其球端回到ECA內(nèi)即可恢復(fù)ICA和MCA的血供。術(shù)后單籠喂養(yǎng)觀察(模型成功標(biāo)準(zhǔn):參照文獻(xiàn)［6］的方法，MCAO制模成功的標(biāo)志為:大鼠在線栓后即出現(xiàn)左側(cè)Horner綜合征(左側(cè)瞳孔縮小)，麻醉清醒時(shí)出現(xiàn)右側(cè)前肢或前后肢癱瘓。在規(guī)定缺血時(shí)限內(nèi)(術(shù)后2～3h)未出現(xiàn)右側(cè)肢體癱瘓或已經(jīng)死亡的大鼠被剔除。再灌注成功的標(biāo)準(zhǔn)為線栓拔出后ICA和Willis環(huán)無血栓和出血)。動(dòng)物死亡及時(shí)補(bǔ)充，保證每組動(dòng)物數(shù)量。假手術(shù)組:只作頸總動(dòng)脈分離，然后縫合皮膚，不作線栓處理。模型組:僅作MCAO缺血再灌注模型處理。電針組:缺血再灌注后每天給予電針治療，按文獻(xiàn)［7］方法定位大鼠督脈“百會(huì)、大椎”穴位。假穴位組(30只):缺血再灌注后每天選取督脈“百會(huì)、大椎”穴左側(cè)旁開1cm處作電針治療?？瞻捉M(10只):不作任何處理，一般喂養(yǎng)。

1.4 針刺及處理方法 選用30號(hào)1寸毫針，沿皮斜刺“百會(huì)、大椎”兩穴，進(jìn)針深度2～3mm。針柄接至G68051A針灸治療儀電極上，復(fù)流后，通電留針30min，采用連續(xù)波，頻率為3Hz，強(qiáng)度3V，以肢體抖動(dòng)、但使動(dòng)物不掙扎、嘶叫為度。電針1次/d，連續(xù)28d。假穴位組取督脈“百會(huì)、大椎”穴旁開1寸處作電針治療，方法同上。假手術(shù)組、模型組、電針組和假穴位組大鼠分別于術(shù)后1d、7d、28d 3個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)用3%戊巴比妥鈉(0.2ml/100g)麻醉，經(jīng)左心室向主動(dòng)脈插管，灌注4℃生理鹽水100ml，然后換用4℃ 4%多聚甲醛緩沖液100ml灌注，灌注后的動(dòng)物開顱取腦，放于4%多聚甲醛溶液里浸泡固定24h?？瞻捉M大鼠則觀察28d后用同樣方法灌注固定后取腦檢測(cè)。

1.5 觀察項(xiàng)目及檢測(cè)方法

1.5.1 Nogo-A采用免疫組織化學(xué)染色法(SABC法)。參照《大鼠腦立體定位圖譜》［8］取缺血中心的大腦進(jìn)行石蠟包埋，冠狀切片，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的每只大鼠取5張切片，片厚3μm，按免疫組織化學(xué)染色步驟操作。對(duì)照實(shí)驗(yàn):用PBS代替一抗進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。均采用陽性細(xì)胞記數(shù)法，在400倍光鏡下選取梗死對(duì)側(cè)皮層5個(gè)互不重疊的視野，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)共計(jì)15個(gè)視野，用Kontron IBAS 2.0高清晰彩色病理圖文分析系統(tǒng)，統(tǒng)計(jì)在400倍光鏡下每個(gè)視野的單位面積陽性細(xì)胞數(shù)，將所得均數(shù)作為各組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的陽性細(xì)胞數(shù)。

1.5.2 神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)觀察 分別于1d、7d及28d 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，從模型組、電針組和假穴位組中各隨機(jī)抽取1只大鼠用3%戊巴比妥鈉(0.2ml/100g)腹腔麻醉，迅速開胸，暴露心臟，左心室主動(dòng)脈插管，快速灌注生理鹽水100ml，然后用含4%多聚甲醛、2.5%戊二醛的磷酸鹽緩沖液(PBS)100ml灌注固定30min。斷頭取腦，分別從左側(cè)缺血區(qū)大腦皮層及對(duì)側(cè)皮層相應(yīng)部位各取組織塊約1×1 ×1mm，放入4%多聚甲醛、2.5%戊二醛的0.1mol/L PBS溶液進(jìn)行前固定3～4h;按常規(guī)電鏡樣品制備程序漂洗、脫水、浸透及環(huán)氧樹脂包埋。超薄切片后，將切片撈至載網(wǎng)上干燥。透射電鏡下觀察切片上細(xì)胞形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)的改變并攝片。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。所有計(jì)量資料均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，組間比較采用單因素的方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)取α=0.05，以 P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 電針對(duì)腦缺血再灌注大鼠不同時(shí)間點(diǎn)梗死灶對(duì)側(cè)皮層神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)的影響空白組和假手術(shù)組大鼠腦皮層結(jié)構(gòu)分明，神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞及毛細(xì)血管等超微結(jié)構(gòu)正常。模型組和假穴位組各時(shí)間點(diǎn)大鼠腦梗死灶對(duì)側(cè)皮層呈現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞胞體腫脹、細(xì)胞器水腫、核染色質(zhì)輕度溶解、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、管腔狹窄等輕度病理改變，以缺血再灌注后第7天最明顯，28d明顯減輕。上述病理改變均較同期患側(cè)皮層缺血區(qū)病變程度明顯減輕，且不足以引起支配側(cè)肢體神經(jīng)功能缺失。電針組大鼠腦梗死灶對(duì)側(cè)皮層神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞及毛細(xì)血管等超微結(jié)構(gòu)的改變均較同期模型組、假穴位組減輕。

2.2 電針對(duì)腦缺血再灌注大鼠不同時(shí)間點(diǎn)梗死灶對(duì)側(cè)皮層Nogo-A表達(dá)的影響 免疫組織化學(xué)顯示空白組和假手術(shù)組腦梗死灶對(duì)側(cè)皮層Nogo-A陽性細(xì)胞呈基礎(chǔ)表達(dá)，兩組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。模型組在 I/R 后1d、7d、28d各時(shí)間點(diǎn)大鼠腦梗死灶對(duì)側(cè)皮層見Nogo-A陽性細(xì)胞表達(dá)反應(yīng)性上調(diào)，7d最明顯，28d后明顯下降。電針組I/R后1、7d各時(shí)間點(diǎn)大鼠腦梗死灶對(duì)側(cè)皮層Nogo-A陽性細(xì)胞表達(dá)量均低于同期模型組和假穴位組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);假穴位組與模型組同期對(duì)比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)(見表1)。

表1 各組大鼠腦梗死灶對(duì)側(cè)皮層Nogo-A陽性細(xì)胞數(shù)目比較(，n=9，個(gè)/cm2)

表1 各組大鼠腦梗死灶對(duì)側(cè)皮層Nogo-A陽性細(xì)胞數(shù)目比較(，n=9，個(gè)/cm2)

與模型組、假穴位組同一時(shí)間點(diǎn)比較*P＜0.05

腦缺血再灌注不同時(shí)間點(diǎn)Nogo-A陽性細(xì)胞數(shù)組別 例數(shù)1d 7d 28d空白組假手術(shù)組模型組電針組假穴位組F值P值99999---1.91 ±0.35 5.91 ±1.85 4.16 ±1.11*5.47 ±1.85 18.458 0-2.38 ±0.48 6.47 ±1.71 4.84 ±0.99*6.07 ±1.94 15.411 0 2.09 ±0.46 1.98 ±0.55 3.44 ±1.19 2.27 ±0.97 2.93 ±2.25 2.036 0.129

3 討論

目前針對(duì)腦梗死的臨床和實(shí)驗(yàn)研究主要集中在梗死灶及缺血半暗帶神經(jīng)組織的保護(hù)和修復(fù)，但療效往往不盡人意。最近研究證實(shí)，ACI損害并不限于梗死灶局部，晚期由于遠(yuǎn)隔部位與梗死灶相聯(lián)系的神經(jīng)纖維出現(xiàn)華勒變性，導(dǎo)致遠(yuǎn)隔部位不可逆的進(jìn)行性萎縮或變性，稱之為遠(yuǎn)隔損害(secondary damage)。根據(jù)遠(yuǎn)隔損害的發(fā)生是腦梗死康復(fù)效果不理想、致殘率高的重要原因之一，從而提出卒中治療的新靶點(diǎn)［1，2］。

有關(guān)遠(yuǎn)隔梗死灶的腦組織發(fā)生繼發(fā)性損害的確切機(jī)制尚未完全闡明，已有研究提示包括以細(xì)胞凋亡引起的遲發(fā)性細(xì)胞死亡、軸突退行性改變、神經(jīng)營養(yǎng)障礙、神經(jīng)生長(zhǎng)抑制因子增加、局部腦血流量減少、神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)失衡和蛋白合成抑制等為中心在內(nèi)的多種因素參與其中［9～11］。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞后遠(yuǎn)隔部位小腦皮質(zhì)Nogo-A的表達(dá)明顯升高，并發(fā)生繼發(fā)性免疫損害［12］。腎血管性高血壓大鼠(stroke-prone renovascular hypertensive rats，RHRSP)大腦皮層梗死后1～4w，梗死灶同側(cè)丘腦的繼發(fā)性損害與神經(jīng)抑制因子Nogo-A增加有關(guān)，Nogo-A拮抗劑NEP1-40通過可對(duì)抗這種繼發(fā)性損害而改善神經(jīng)功能［5］。進(jìn)一步地，我們?cè)趧?dòng)物實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，RHRSP大腦皮層梗死后1～4w，梗死灶同側(cè)丘腦、海馬、中腦黑質(zhì)及對(duì)側(cè)脊髓前角神經(jīng)元等遠(yuǎn)隔部位繼發(fā)性損害與神經(jīng)抑制因子 neurocan-mRNA 和 Nogo-A 有關(guān)［2～5］。

抗Nogo-A抗體能明顯地增加未損傷的感覺運(yùn)動(dòng)皮層(SMC)來源的中線交叉的皮質(zhì)脊髓束，并發(fā)出新的投射到患側(cè)支配區(qū)，促進(jìn)患肢功能恢復(fù)［13，14］。這表明Nogo-A參與ACI遠(yuǎn)隔損害，抑制神經(jīng)再生。

本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)法及透射電鏡技術(shù)觀察電針對(duì)腦缺血再灌注大鼠腦梗死灶對(duì)側(cè)皮層不同時(shí)期Nogo-A表達(dá)、細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果顯示，缺血再灌注后第1天，大鼠腦梗死灶對(duì)側(cè)皮層可見Nogo-A陽性細(xì)胞表達(dá)呈反應(yīng)性增多;第7天達(dá)到高峰，28d大致恢復(fù)到基礎(chǔ)水平。透射電鏡觀察到腦缺血再灌注后各時(shí)間點(diǎn)大鼠腦梗死灶對(duì)側(cè)皮層亦出現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞胞體腫脹、細(xì)胞器水腫、核染色質(zhì)輕度溶解、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、管腔狹窄等輕度病理改變。

上述病變程度均輕于病灶側(cè)，且不足以引起支配側(cè)肢體神經(jīng)功能損傷。這提示與梗死灶壞死神經(jīng)元有相關(guān)聯(lián)系的對(duì)側(cè)皮層神經(jīng)元軸突也出現(xiàn)斷裂、腫脹，隨后發(fā)生髄鞘脫失、軸索溶解等華勒變性，同時(shí)伴隨相關(guān)部位神經(jīng)元丟失。此病理改變是否與Nogo-A動(dòng)態(tài)變化相關(guān)?我們發(fā)現(xiàn)，電針治療后，大鼠腦梗死灶對(duì)側(cè)皮層Nogo-A的表達(dá)均低于同期假穴位組和模型組(P＜0.05)。透射電鏡顯示電針組腦組織神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞、毛細(xì)血管等超微結(jié)構(gòu)的缺血性損傷均較假穴位組、模型組同期明顯減輕。

由此可推測(cè)，Nogo-A參與梗死灶對(duì)側(cè)皮層繼發(fā)性損害，電針可減輕遠(yuǎn)隔損害與部分阻遏Nogo-A抑制性信號(hào)傳導(dǎo)通路蛋白表達(dá)密切有關(guān)。其機(jī)制可能是電針在腦缺血早期通過穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)外離子濃度、抑制Ca2+內(nèi)流、穩(wěn)定神經(jīng)遞質(zhì)的濃度等多種方式調(diào)節(jié)突觸信號(hào)的傳遞，維持神經(jīng)元的存活和促進(jìn)神經(jīng)突觸的生長(zhǎng)及抑制膠質(zhì)瘢痕形成。而在后期少突膠質(zhì)細(xì)胞主要以合成抑制因子和損傷因子為主，電針以雙向調(diào)節(jié)的作用保護(hù)梗死灶對(duì)側(cè)皮層少突膠質(zhì)細(xì)胞及抑制少突膠質(zhì)細(xì)胞的激活，減少突觸抑制因子Nogo-A的合成和釋放，阻斷與其相關(guān)的抑制信號(hào)傳導(dǎo)通路，從而減輕遠(yuǎn)隔部位的繼發(fā)性損害。這為電針更好地治療ACI患者、減輕ACI遠(yuǎn)隔損害、提升康復(fù)療效提供了一定的理論依據(jù)。

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