意向性運(yùn)動療法對大鼠腦缺血再灌注損傷后GluR2和GRASP-1表達(dá)的影響

郭榮靜， 湯清平， 蔣 雯， 周芝文， 楊 杰

腦血管病是導(dǎo)致人類死亡的第二位疾病，其中缺血性腦血管病大約占全部腦血管病的80%［1］。腦卒中后存活者70%～80%遺留不同程度的功能障礙，很大程度上影響患者的生活質(zhì)量，給國家和社會造成了沉重的經(jīng)濟(jì)和社會負(fù)擔(dān)。

意向性運(yùn)動療法［2］是指某一個體集中其注意力并竭盡全力完成某一動作，以達(dá)到某一預(yù)定目標(biāo)的一種運(yùn)動方式。Tang等［3］發(fā)現(xiàn)大腦中動脈梗死(MCAO)早期即給予大鼠意向性運(yùn)動治療，能增加缺血期半暗帶區(qū)AMPA受體亞單位GluR2蛋白表達(dá)，但其具體調(diào)節(jié)機(jī)制仍不清楚。

GRASP-1(GRIP-associated protein-1)是2000年由Ye等［4］篩選出的蛋白，屬于Ras鳥嘌呤核苷酸交換因子(GEE)，且與GluR2、GRIP1存在共表達(dá)。最新研究發(fā)現(xiàn)［5］它通過介導(dǎo)突觸融合蛋白-13而將Rab4和Rab11連接起來，而從調(diào)節(jié)AMPA受體的運(yùn)輸，且經(jīng)證實GRASP-1對于維持樹突棘的形態(tài)以及AMPA的LTP是必需的。

本研究利用線栓法制備局灶性大腦中動脈缺血(MCAO)大鼠模型，在缺血后24h采用不同的康復(fù)手段，了解意向性運(yùn)動療法干預(yù)對于大鼠行為學(xué)的影響，及動態(tài)觀察其對GluR-2以及GRASP-1的影響，揭示意向性運(yùn)動療法的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物的準(zhǔn)備 清潔級健康雄性SD大鼠192只，大鼠質(zhì)量約為200～300g，鼠齡4～5個月(均購自中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院實驗動物中心)。將192只試驗大鼠隨機(jī)分為兩組:TTC組(96只)以及免疫組化組(96只)。每組又分為4組:(1)大腦中動脈梗死模型組(MCAO):MCAO手術(shù)后將大鼠放于常規(guī)飼料箱內(nèi);(2)意向性運(yùn)動療法(WM):MCAO手術(shù)再灌注后24h將大鼠放置于帶有人字梯的自制飼養(yǎng)箱內(nèi)，食物及水置于箱頂蓋上;(3)飼養(yǎng)環(huán)境改變組(EM):MCAO手術(shù)再灌后24h將大鼠置于帶人字梯的自制飼養(yǎng)箱內(nèi)，食物置放在飼養(yǎng)籠內(nèi);(4)一般康復(fù)組(CR):MCAO手術(shù)再灌后24h進(jìn)行滾筒式網(wǎng)狀訓(xùn)練，每日2次，每次30min，其余時間內(nèi)將大鼠置于帶人字梯的自制塑料箱內(nèi)，食物放在飼養(yǎng)籠內(nèi)。所有食物均在上午9:30～10:00和下午3:00～3:30投放。各組再分成MCAO手術(shù)再灌后3d、7d、15d、30d 4 個小組。

1.2 訓(xùn)練器材

1.2.1 飼料箱的制備 兩種類型的飼料箱:(1)常規(guī)飼料箱:箱底和側(cè)邊均為厚度約5mm的塑膠構(gòu)成，大小約為40×30×18(高)cm，不銹鋼網(wǎng)格狀頂蓋的前部凹陷處放置食物及飲水瓶之上;(2)自制飼料箱:底部及側(cè)邊厚約5mm、高18cm的塑膠構(gòu)成，其余周邊及頂蓋鐵制網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)，大小約為38×28×32(高)cm，內(nèi)放置自制人字型小梯8×10×22(高)cm。

1.2.2 自制滾筒式網(wǎng)狀訓(xùn)練器 長1.0m、直徑約為60cm的圓形網(wǎng)狀訓(xùn)練器，中間平均分為4個格，底座有一固定架，一端有一手搖柄，手搖按5r/min進(jìn)行轉(zhuǎn)動訓(xùn)練。

1.3 動物模型的制備 參考Zea Longa［6］的線栓法制備MCAO腦缺血模型。缺血2h后拔出，回抽尼龍線10mm，造成缺血再灌注。

1.4 行為學(xué)測量

1.4.1 神經(jīng)功能缺損評分 在再灌注后清醒時、1d、3d、7d、15d、30d，根據(jù)改良的 Longa［6］六級標(biāo)準(zhǔn)評分法進(jìn)行評分。2～5分為成功模型。

1.4.2 爬梯頻率 上午和下午各觀察大鼠1個小時的爬梯或側(cè)箱壁的次數(shù)，大鼠爬至箱頂或者梯頂計為一次，爬半梯計為0.5次。每日所得爬梯次數(shù)總和除以2為當(dāng)天每小時的爬梯次數(shù)。

1.4.3 前后肢抓握功能評估 爬梯時前后肢抓握評分如下:前肢評分:爬梯子或者爬側(cè)壁時，抓握使用單側(cè)健側(cè)前肢為0分;使用雙側(cè)前肢，患肢抓握不穩(wěn)者為1分;使用雙側(cè)前肢無明顯差別者為2分。后肢評分標(biāo)準(zhǔn)同前肢。

1.5 采用TTC染色測量梗死體積比 神經(jīng)行為評分后，斷頭取腦組織;將全腦放置于-20℃冰箱冰凍30min后，自額極到枕極冠狀切片，每片厚約2mm，共切取5片。將腦片置于新鮮配制的2%TTC磷酸鹽緩沖液中，37℃下避光水浴孵育30min后將腦片從TTC溶液中取出，放入10%多聚甲醛中固定24h，用數(shù)碼相機(jī)拍照。采用Image pro plus 6.0圖像軟件系統(tǒng)掃描腦片，測量每個腦片各個層面的梗死面積值、左側(cè)半球面積值以及右側(cè)半球面積值。為了排除水腫和個體差異的影響，得到糾正后的一個相對值，即梗死體積比=［損傷對側(cè)半球總體積-(損傷側(cè)半球總體積-腦組織梗死體積)］/損傷對側(cè)半球總體積。

1.6 免疫組化 應(yīng)用SABC法免疫組織化學(xué)染色。具體步驟:切片經(jīng)過漂洗，置于新鮮配制的30%H202+純甲醇溶液中，浸入0.01mol檸檬酸緩沖液，5%BSA封閉抗原，室溫20min，分別滴加2%BSA稀釋的山羊抗小鼠GluR2多克隆抗體(1∶100 santa cruz公司)、山羊抗大鼠(1∶100 santa cruz公司)，最后DAB顯色。

1.7 結(jié)果觀察 在光學(xué)顯微鏡下觀察缺血半暗帶區(qū)GluR2和 GRASP-1陽性細(xì)胞。以 HPIAS-1000彩色病理圖像分析系統(tǒng)分析每個切片，計數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)。每個指標(biāo)每個時間點選取2張切片，每張切片選取缺血半暗帶區(qū)5個不重疊視野，高倍鏡下(×400)觀察每個視野內(nèi)的陽性細(xì)胞數(shù)。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 SPSS16.0統(tǒng)計軟件處理。數(shù)據(jù)處理均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，所有數(shù)據(jù)均進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性檢驗;兩指標(biāo)見分析采用雙尾Pearson’s相關(guān)檢驗，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EM組、CR組、WM組爬梯頻率 再灌注后各時間點WM組大鼠爬梯次數(shù)均明顯多于CR組和EM組，再灌后7d、15d、30d具有統(tǒng)計學(xué)差異(均P ＜0.01)(見表1)。

2.2 4組神經(jīng)缺損評分比較 再灌注后30d，WM組神經(jīng)功能評分明顯低于MCAO組、EM組和CR組，與MCAO組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(見表2)。

2.3 EM組、CR組、WM組前后肢抓握功能再灌后15、30d，WM組與CR組以及EM組相比，前肢抓握功能改善明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。各組在再灌注各時間點相比，后肢的抓握功能差別無統(tǒng)計學(xué)意義(見表3、表4)。

2.4 4組之間TTC染色梗死體積比 經(jīng)過TTC染色發(fā)現(xiàn)，大鼠大腦額葉、頂葉、顳葉皮質(zhì)以及紋狀體可見明顯非紅染區(qū)域，為梗死灶。再灌注后15d、30d，WM組、EM 組、CR組與MCAO組相比較，梗死體積比均增大，以WM組增大的更明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P＜0.05)(見表5)。

2.5 4組之間不同時間點GluR2蛋白表達(dá)在缺血半暗帶區(qū)，再灌注后3d、7d、15d各組之間未見明顯差異。再灌注后30d WM組GluR2陽性細(xì)胞表達(dá)明顯增加，與MCAO組相比具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)(見表6、圖1)。

2.6 4組之間不同時間點GRASP-1蛋白表達(dá)在缺血半暗帶區(qū)，再灌注后3d、7d、15d各組之間未見明顯差異。再灌注后30d WM組GRASP-1陽性細(xì)胞表達(dá)明顯增加，與MCAO組比較具有統(tǒng)計學(xué)差異(P ＜0.05)(見表7、圖2)。

圖2 30d時各組大鼠缺血半暗帶GRASP-1蛋白表達(dá)(×400)

2.7 相關(guān)分析 通過 Pearson’s相關(guān)檢驗，GluR2與GRASP-1蛋白表達(dá)之間的相關(guān)系數(shù)為0.678，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.01)，說明 GluR2 與GRASP-1具有相關(guān)性。

表1 EM組、CR組、WM組爬梯頻率比較(，n=12)

表1 EM組、CR組、WM組爬梯頻率比較(，n=12)

與同時間點的EM組及CR組比較*P＜0.01

再灌時間(d)組別3715 30 EM組CR組WM組3.22 ±0.79 2.73 ±0.96 3.47 ±0.84 4.19 ±0.31 4.06 ±0.14 8.38 ±0.17*4.68 ±0.34 4.30 ±0.17 10.72 ±0.37*5.70 ±0.53 5.58 ±0.25 12.15 ±0.77*

表2 4組神經(jīng)功能缺損評分比較(，n=12)

表2 4組神經(jīng)功能缺損評分比較(，n=12)

與MCAO組比較*P＜0.05

再灌時間(d)組別1h 24h 3d 7d 15d 30d MCAO組EM組CR組WM組3.08 ±0.29 3.00 ±0.60 3.08 ±0.29 3.08 ±0.40 2.08 ±0.29 2.17 ±0.39 2.08 ±0.29 2.17 ±0.39 1.92 ±0.29 1.83 ±0.39 1.83 ±0.39 1.75 ±0.45 1.75 ±0.45 1.58 ±0.51 1.67 ±0.49 1.50 ±0.52 1.50 ±0.52 1.33 ±0.49 1.41 ±0.51 1.25 ±0.45 1.33 ±0.49 1.08 ±0.79 1.17 ±0.72 0.75 ±0.62*

表3 EM組、CR組、WM組前肢抓握功能(，分，n=12)

表3 EM組、CR組、WM組前肢抓握功能(，分，n=12)

與同時間點的EM組及CR組比較*P＜0.05

組別再灌時間(d)3 7 15 30 EM組CR組WM組0.73 ±0.47 0.55 ±0.52 0.67 ±0.49 0.91 ±0.30 0.83 ±0.39 0.91 ±0.29 1.33 ±0.49 1.25 ±0.45 1.75 ±0.48*1.52 ±0.46 1.46 ±0.38 1.92 ±0.29*

表4 EM組、CR組、WM組后肢抓握功能(，分，n=12)

表4 EM組、CR組、WM組后肢抓握功能(，分，n=12)

組別再灌時間(d)3 7 15 30 EM組CR組WM組0.83 ±0.39 0.75 ±0.45 0.92 ±0.38 1.18 ±0.40 1.17 ±0.58 1.17 ±0.71 1.83 ±0.39 1.83 ±0.39 1.91 ±0.30 1.92 ±0.29 1.92 ±0.29 2.00 ±0.00

表5 4組之間TTC染色梗死體積比(，n=6)

表5 4組之間TTC染色梗死體積比(，n=6)

與MCAO組比較*P＜0.05

組別再灌時間(d)3 7 15 30 MCAO組EM組CR組WM組0.20 ±0.10 0.16 ±0.25 0.11 ±0.15 0.14 ±0.10 0.13 ±0.19 0.17 ±0.13 0.18 ±0.14 0.12 ±0.08 0.08 ±0.18 0.17 ±0.18 0.15 ±0.14 0.30 ±0.16*0.08 ±0.14 0.25 ±0.25 0.21 ±0.21 0.29 ±0.78*

表6 各組大鼠缺血半暗帶區(qū)GluR2蛋白表達(dá)的比較(，陽性細(xì)胞數(shù)，n=6)

表6 各組大鼠缺血半暗帶區(qū)GluR2蛋白表達(dá)的比較(，陽性細(xì)胞數(shù)，n=6)

與MCAO組比較*P＜0.05

組別再灌時間(d)3 7 15 30 MCAO組EM組CR組WM組72.60 ±2.52 72.78 ±2.34 72.63 ±3.45 72.90 ±3.28 73.03 ±4.08 73.27 ±3.50 73.23 ±4.08 73.21 ±3.48 73.93 ±1.63 74.03 ±3.38 74.00 ±3.58 74.23 ±3.07 75.17 ±1.45 76.87 ±1.14 76.50 ±2.23 78.27 ±1.94*

表7 4組大鼠缺血半暗帶區(qū)GRASP-1蛋白表達(dá)的比較(，陽性細(xì)胞數(shù)，n=6)

表7 4組大鼠缺血半暗帶區(qū)GRASP-1蛋白表達(dá)的比較(，陽性細(xì)胞數(shù)，n=6)

與MCAO組比較*P＜0.05

組別再灌時間(d)3 7 15 30 MCAO組EM組CR組WM組85.50 ±5.47 85.94 ±7.12 85.55 ±5.01 86.11 ±6.55 86.50 ±1.28 86.67 ±5.12 86.55 ±8.53 86.72 ±8.53 87.00 ±1.09 87.67 ±1.46 87.33 ±6.63 88.27 ±1.10 88.00 ±2.42 88.94 ±1.74 88.89 ±1.73 91.28 ±2.26*

3 討論

運(yùn)動訓(xùn)練通過改變突觸的結(jié)構(gòu)和功能的可塑性影響學(xué)習(xí)記憶以及改善神經(jīng)功能恢復(fù)［7］。有研究［8］表明成年腦損傷可導(dǎo)致與損傷側(cè)腦組織毗鄰的腦區(qū)發(fā)生適應(yīng)性可塑性改變，康復(fù)訓(xùn)練通過改變鄰近損傷區(qū)域以及對側(cè)半球神經(jīng)元的可塑性，從而改善癱瘓的程度。功能磁共振［9］發(fā)現(xiàn)上肢功能完全或者部分恢復(fù)的患者，大腦內(nèi)相對應(yīng)區(qū)域的皮質(zhì)功能發(fā)生重組。國際上公認(rèn)的卒中后康復(fù)模式可分為:隨意運(yùn)動、非隨意運(yùn)動以及強(qiáng)迫運(yùn)動。在腦損傷后，這些康復(fù)模式改善認(rèn)知功能以及神經(jīng)功能恢復(fù)［10～12］。

Zheng等［13］研究不同康復(fù)模式對缺血再灌注后大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)以及BDNF的影響，該研究表明隨意運(yùn)動組、非隨意運(yùn)動組以及強(qiáng)迫運(yùn)動組與制動組相比，更能提高海馬BDNF的濃度以及促進(jìn)運(yùn)動功能的恢復(fù)。有研究發(fā)現(xiàn)早期強(qiáng)制患肢過度運(yùn)動可引起腦損傷，其機(jī)制可能是早期強(qiáng)制使用患側(cè)肢體增加NMDA介導(dǎo)的興奮性毒性作用，導(dǎo)致鈣離子大量內(nèi)流，從而使細(xì)胞膜通透性增加，加重腦組織損傷。而大部分的研究發(fā)現(xiàn)腦梗死后早期逐漸增加運(yùn)動的強(qiáng)度不增加梗死體積，不損害感覺運(yùn)動功能，對運(yùn)動功能恢復(fù)有利。

在本實驗WM組和EM組均屬于隨意運(yùn)動，CR組屬于強(qiáng)迫運(yùn)動。因為在腦梗死的早期，由于大鼠肢體癱瘓，以及不愿意活動的情緒障礙，不利于神經(jīng)功能的康復(fù)。WM組用食物和水誘導(dǎo)大鼠爬梯，大鼠在饑餓和口渴時必須運(yùn)動，而EM組則將爬梯僅作為一種娛樂活動，CR組每日則進(jìn)行定時定量的強(qiáng)迫運(yùn)動，強(qiáng)迫運(yùn)動后大鼠更不愿意自己主動運(yùn)動，經(jīng)過30d的各種形式的康復(fù)訓(xùn)練后，WM組在神經(jīng)功能評分以及前肢抓握功能方面較其他3組得到較好的恢復(fù)，這進(jìn)一步說明隨意運(yùn)動能促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。

Humm等［14］研究亦發(fā)現(xiàn)在缺血再灌注后的7d內(nèi)早期過度使用患側(cè)肢體導(dǎo)致大鼠感覺運(yùn)動皮層區(qū)神經(jīng)元損害擴(kuò)大，在很大程度上干擾神經(jīng)功能重建。Risedal［15，16］等研究發(fā)現(xiàn)在缺血再灌注 24h 即開始的特定運(yùn)動可以使梗死體積增大。

本實驗中發(fā)現(xiàn)再灌注后15d、30d時WM組較其他組梗死體積比增大。其可能原因為WM組大鼠必須通過大量的運(yùn)動來獲取食物及水，且缺血再灌注24d后即開始鍛煉，結(jié)合既往的文獻(xiàn)，推測體積增大與早期即給予高強(qiáng)度的訓(xùn)練有關(guān)，在以后的實驗中應(yīng)定時將大鼠放在自制飼養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行康復(fù)訓(xùn)練，而其余時間將其放在普通飼養(yǎng)籠中，從而減少運(yùn)動的強(qiáng)度。同時我們的實驗發(fā)現(xiàn)早期給予高強(qiáng)度的意向性運(yùn)動療法，一方面能改善大鼠的神經(jīng)功能;另一方面卻使梗死面積增大。既往亦有類似研究［17］發(fā)現(xiàn)梗死體積和神經(jīng)功能的恢復(fù)無明確相關(guān)性，其可能的原因是在腦卒中的早期，神經(jīng)功能評分反映的是缺血中心區(qū)以及缺血半暗帶的損傷，即病灶的部位和大小;而隨著灌注的恢復(fù)，缺血半暗帶的腦功能發(fā)生重組，神經(jīng)功能評分反映的是腦功能的可塑性和重組［18］。因此，雖然組織化學(xué)損害表現(xiàn)為加重，但是癥狀可能會減輕。臨床資料也［19，20］發(fā)現(xiàn)癥狀和病灶的演化無明確相關(guān)性。所以我們推測梗死面積和神經(jīng)功能的恢復(fù)可能無直接相關(guān)。

1955年Vrba［21］首次研究發(fā)現(xiàn)運(yùn)動訓(xùn)練可以影響谷氨酸系統(tǒng)。1999年Bland［22］發(fā)現(xiàn)肢體隨意運(yùn)動后，谷氨酸水平在紋狀體、海馬以及感覺運(yùn)動皮層均增加。2005年Dietrich［23］給予大鼠隨意運(yùn)動一個月后，發(fā)現(xiàn) GluR1、SAP-97、GRIP-1、GluR2/3、PSD-95 在大腦皮層表達(dá)均增加。2007年Tang等［3］在研究意向性運(yùn)動療法對大鼠局灶性腦缺血不同時期的影響時發(fā)現(xiàn)，在腦缺血再灌注30d后GluR2蛋白在缺血半暗帶的表達(dá)增加，15～30d時，GluR1 mRNA表達(dá)上調(diào)，GluR3、GluR4表達(dá)未見明顯變化。2010年，Caroline等［24］研究發(fā)現(xiàn)在經(jīng)過不同時間的訓(xùn)練后GluR2亞基的表達(dá)不同，經(jīng)過30d的訓(xùn)練其表達(dá)大量增加，并認(rèn)為這些受體在大腦的可塑性中起著重要作用。2011年侯德仁等［25～27］發(fā)現(xiàn)意向性運(yùn)動療法可以促進(jìn)MCAO大鼠神經(jīng)功能缺損的恢復(fù)，可能與缺血周圍腦組織GFAP、SYP、NT-3和GAP-43的表達(dá)有關(guān)。

AMPA受體的GluR2/3亞單位C末端可以直接與GRIP1相連，GRASP-1可以特異性地與GRIP1的第7個結(jié)構(gòu)域相互作用，特異地表達(dá)在所有神經(jīng)組織中。2010年 Hoogenraad［5］發(fā)現(xiàn) GRASP-1蛋白表達(dá)水平的降低可以減少生物素標(biāo)記上的GluR2亞基，并證實了在海馬神經(jīng)元GRASP-1和GluR1/2存在共表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)敲除GRASP-1基因后樹突中的循環(huán)內(nèi)體的數(shù)量只有原來的0～10%。并發(fā)現(xiàn)其定位于 Rab4陽性的早期內(nèi)體循環(huán)系統(tǒng)中，作為Rab4效應(yīng)器，與Neep21競爭性的結(jié)合syntaxin 13，GRASP-1表達(dá)增加可以使syntaxin 13從Neep21/EEA1/Rab5陽性結(jié)構(gòu)中分離，促使Rab4/Rab11在神經(jīng)元的共表達(dá)增加，從而使內(nèi)體循環(huán)至胞膜?？傊珿RASP-1在AMPA受體循環(huán)、維持突觸可塑性以及樹突的形態(tài)中起著重要作用;在分子水平發(fā)現(xiàn)，作為其可連接Rab4和Rab11，調(diào)節(jié)AMPA受體再循環(huán)。

本實驗研究結(jié)果顯示:在局灶性腦缺血亞急性期，意向性運(yùn)動療法可能通過誘導(dǎo)大鼠腦缺血再灌注損傷后缺血半暗帶區(qū)GRASP-1蛋白表達(dá)上調(diào)，增加GluR2表達(dá)，增強(qiáng)突觸傳遞效能，提高突觸可塑性。

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