醛固酮與轉(zhuǎn)化生長因子-β1在心肌纖維化中的作用機制

李林鋒，王 洪，劉朝暉，羅 汛，洪 浪

（江西省人民醫(yī)院心內(nèi)科，南昌330006）

慢性心力衰竭是常見而嚴重的臨床問題，是各種心臟疾病的最終轉(zhuǎn)歸。心肌病變是心力衰竭的基本病因，在各種原因造成的心肌病變中心肌纖維化起著十分重要的作用，因此進一步了解心肌纖維化的發(fā)病機制，并采取相應(yīng)的干預(yù)治療是延緩和防止心力衰竭發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵。

近年來很多研究[1]表明，醛固酮具有顯著的促心肌纖維化作用。但關(guān)于具體機制的研究并不多。轉(zhuǎn)化生長因子-β1 （transforming growth factor-β1，TGF-β1）屬TGF-β超家族，是一種多功能的細胞間信號蛋白，調(diào)節(jié)多種靶基因的表達，在細胞增殖、分化及細胞外基質(zhì)合成中發(fā)揮重要作用。Smads蛋白是目前所知主要的TGF-β1受體胞內(nèi)激活底物，介導(dǎo)TGF-β1信號的胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)。當(dāng)TGF-β1通路被激活，受體激活型Smads與抑制型Smads之間的平衡被打破，就會導(dǎo)致心肌纖維化的發(fā)生[2-3]。

本研究旨在通過探討醛固酮致心肌纖維化的過程中對TGF-β1/Smads信號通路的調(diào)節(jié)及對下游因子的影響，進一步闡明醛固酮致心肌纖維化的機制，從而為心肌纖維化的干預(yù)研究提供理論基礎(chǔ)和作用靶點。

1 材料與方法

1.1 動物和試劑

出生3 d內(nèi)的SD大鼠，雌雄不限，購于南昌大學(xué)動物中心；醛固酮、依普利酮購于Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶購于美國Gibco公司；胎牛血清購于奧地利PAA公司；波形蛋白單克隆抗體、纖維連接蛋白單克隆抗體、平滑肌肌動蛋白單克隆抗體為美國Santa Cruz公司產(chǎn)品；SABC試劑盒為武漢博士德公司產(chǎn)品；TGF-β1酶聯(lián)免疫試劑盒購自Genzyme公司；PlusSYBRPrimeScriptRTPCR Kit購自大連寶生物公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及鑒定

采用胰酶消化法和貼壁差速分離法獲取心肌成纖維細胞（CFs）。無菌條件下取出新生3 d內(nèi)SD大鼠心室，立即置入40℃PBS液，漂洗，剪碎，加入胰酶，反復(fù)消化，收集上清液，離心5 min；棄上清，加入含10%新生牛血清的DMEM，5%CO2，37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)90 min；差速貼壁法分離CFs。待CFs生長接近融合時按1∶3比例傳代。實驗采用第2和第3代細胞。培養(yǎng)的細胞于倒置顯微鏡下觀察形態(tài)，采用免疫組織化學(xué)SABC法鑒定，波形蛋白、纖維連接蛋白染色陽性、平滑肌肌動蛋白陰性鑒定為所需CFs，純度為98%。

1.2.2 實驗分組及細胞處理

ELISA檢測培養(yǎng)液中TGF-β1時，予低濃度（1%胎牛血清）DMEM預(yù)適應(yīng)24 h后，將獲取的CFs隨機分為5組，每組5只，培養(yǎng)液5mL。對照組：不予任何處理； 醛固酮組：1×10-7mol·L-1的醛固酮；醛固酮+依普利酮組：1×10-7mol·L-1的醛固酮+1×10-5mol·L-1的依普利酮（預(yù)處理 2 h）；依普利酮組：1×10-5mol·L-1的依普利酮。培養(yǎng)72 h后，收集培養(yǎng)液，-20℃保存。SB43l542預(yù)處理組：RT-PCR檢測Smad2、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原表達時增加TGF-β1受體拮抗劑（SB431542）+醛固酮。

1.2.3 培養(yǎng)液中TGF-β1水平的測定

應(yīng)用ELISA法檢測各組TGF-β1水平，按試劑盒說明書步驟進行，酶聯(lián)免疫檢測儀測450 nm波長OD值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算TGF-β1濃度。

1.2.4 RT-PCR檢測Smad2、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原的表達

取 1×106個細胞，加入 1 mL RNAiso，充分混勻，吹打數(shù)次。采用氯仿異丙醇法抽提細胞總RNA。按照PlusSYBRPrimeScriptRT-PCR Kit試劑說明書，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。Smad2上游引物：5′-ATGTCGTCCATCTTGCCATT-3′，下游引物：5′-GTCCCCAAATTTCAGAGCAA-3′；Ⅰ型膠原上游引物：5′-ACATGTTCAGCTTTGTGGACC-3′，下游引物：5′-TAGGCCATTGTGTATGCAGC-3′；Ⅲ型膠原上游引物：5′-TGGTAGAAAGGACACAGAGGC-3′，下游引物：5′-TCCAACTTCACCCTTAGCACC-3′；β-actin 上游引物 5’-GCATCCCCCAAAGTTCACAA-3’；下游引物 5’-AGGACTGGGCCATTCTCCTT-3’。依照說明書操作，采用ABI 7500 Fast Real-Time PCR System，反應(yīng)條件如下：SYBR Premix Ex TaqTMII 10 μL，PCR Forward Primer 0.8 μL，PCR Reverse Primer 0.8 μL，ROX Reference Dye or Dye II 0.4 μL，RT 反應(yīng)液 2μL，DEPC水6μL。95℃預(yù)變性30 s；95℃5 s，60 ℃ 34 s，40 個循環(huán)。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 ELISA檢測各組CFs中TGF-β1水平

與對照組相比，依普利酮組處理不影響CFs的TGF-β1分泌，醛固酮刺激后，能顯著促進CFs分泌TGF-β1，而依普利酮預(yù)處理后可以抑制醛固酮促CFs分泌 TGF-β1 的作用（圖 1）。

圖1 醛固酮對CFs分泌TGF-β1的影響（n=5）

2.2 RT-PCR

與對照組相比，醛固酮處理后，顯著上調(diào)Smad2、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原的表達，而依普利酮預(yù)處理后可以抑制醛固酮誘導(dǎo)的Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原表達。在SB43l542預(yù)處理組，其結(jié)果與依普利酮組相似，能顯著抑制Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原表達（圖2）。

圖2 醛固酮對SmadmRNA表達的影響

圖3 醛固酮對Ⅰ型膠原mRNA表達的影響

圖4 醛固酮對Ⅲ型膠原mRNA表達的影響（n=5）

3 討論

多年前，人們就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，心臟局部具有合成醛固酮的能力[4]，而且心臟中多種細胞存在醛固酮特異性受體[5]，心臟的醛固酮是導(dǎo)致心肌纖維化形成和發(fā)展的一個重要因素[6]，且不依賴于其調(diào)節(jié)體液以及電解質(zhì)的作用，但其具體機制并不十分清楚。

CFs是心肌纖維化的主要效應(yīng)細胞，CFs增殖、間質(zhì)中膠原沉積增加、比例失調(diào)、排列紊亂是心肌纖維化的病理基礎(chǔ)。心肌纖維化與CFs合成和分泌多種生物活性物質(zhì)有關(guān)。其中TGF-β1被廣泛關(guān)注，TGF-β1對成纖維細胞有強烈的趨化作用，促使成纖維細胞分泌大量的細胞外基質(zhì)。研究表明，成纖維細胞在TGFβ1的作用下,先合成大量的纖維連接蛋白，隨后Ⅰ、Ⅲ型膠原表達增多[7]。 Smads蛋白是TGF-β1信號通路重要的下游調(diào)節(jié)因子，TGF-β1首先與Ⅱ型受體結(jié)合，Ⅱ型受體與跨膜Ⅰ型受體相連并磷酸化后激活Smads蛋白，Smads蛋白具有特異的DNA結(jié)合活性，可以發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的功能，調(diào)節(jié)相關(guān)的細胞因子基因表達（如血小板源性生長因子、成纖維細胞生長因子、腫瘤壞死因子等），導(dǎo)致纖維化[8]。 而下調(diào)或抑制 TGF-β1/Smads的表達能減少膠原合成，改善心肌纖維化[9]。因此，筆者推測醛固酮通過激活TGF-β1/Smads信號通路在促進心肌纖維化發(fā)生。

在本實驗中，首先，筆者觀察到醛固酮處理后，能顯著增加TGF-β1水平，而依普利酮組后可以抑制醛固酮誘導(dǎo)的TGF-β1分泌，而單純依普利酮對CFs分泌TGF-β1的作用無影響。其次，醛固酮組Smad2、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原表達增加，而依普利酮預(yù)處理后可明顯抑制其表達，更重要的是，TGFβ1受體抑制劑SB43l542也可以抑制Smad2、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原表達。這表明醛固酮通過激活TGF-β1/Smads信號通路，增加Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的表達，從而導(dǎo)致心肌纖維化。而依普利酮能抑制醛固酮激活TGF-β1/Smads信號通路，抑制心肌纖維化。

本實驗結(jié)果提示醛固酮通過依普利酮調(diào)控成纖維細胞TGF-β1水平，TGF-β1作用其受體，激活細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)因子Smad2，調(diào)控下游多種目的基因的表達，促使Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的積聚，導(dǎo)致心肌纖維化。

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