百合親本及其雜種幼苗對(duì)高溫逆境的響應(yīng)1)

楊利平 李 蕊

(長江師范學(xué)院，重慶，408100) (河北農(nóng)業(yè)大學(xué))

“溫室效應(yīng)”導(dǎo)致全球溫度升高已經(jīng)成為不爭的事實(shí)。高溫逆境會(huì)引起植物新陳代謝受阻，致使植物產(chǎn)品產(chǎn)量和品質(zhì)下降，甚至植株死亡，因此，近年來糧食、蔬菜和觀賞植物耐熱育種已成為我國中低緯度地區(qū)育種工作的重點(diǎn)目標(biāo)之一［1-8］。通常植物種類、同種的不同種源(或生態(tài)型)及品種對(duì)逆境脅迫的反應(yīng)差異很大，利用優(yōu)良抗性親本對(duì)子代獲得優(yōu)良性狀起著非常重要的作用［8］。百合耐熱育種已經(jīng)起步，利用我國極為豐富的百合資源，培育出耐熱強(qiáng)的品種開始引起育種工作的關(guān)注［8-9］。條葉百合(Lilium callosum)產(chǎn)于我國東北草原，對(duì)溫度和干旱逆境抗性強(qiáng)，花紅色小巧，但無香氣、莖干細(xì)弱等限制其商品性的推廣［10］。而王百合(L.regale)和麝香百合品種‘雪皇后’(L.longifrolum‘Snow Queen’)花大，白色，有香氣，耐熱性較強(qiáng)，商品性好［11］。以條葉百合為母本，王百合及‘雪皇后’為父本遠(yuǎn)緣雜交，希望獲得耐熱性強(qiáng)，商品性較好的百合新種質(zhì)。研究者在前期工作中已獲得該組合的幼苗，并已被鑒定為真實(shí)雜交種［9］，因此，本研究旨在檢測(cè)、比較親本與雜交后代幼苗對(duì)高溫逆境的反應(yīng)，確定雜交種的耐熱性，為耐熱種質(zhì)的篩選做必要的前期工作。

1 材料與方法

以條葉百合(T)、王百合(W)、‘雪皇后’(‘SQ’)及已被鑒定為真實(shí)雜交種的條葉百合×王百合(T×W)、條葉百合ב雪皇后’(TבSQ’)的離體培養(yǎng)苗為試驗(yàn)材料。

將生長35 d左右的百合離體幼苗轉(zhuǎn)移到智能型人工氣候箱內(nèi)，以 25(對(duì)照處理)、28、31、34、37、40 ℃各處理24 h，光照強(qiáng)度167 μmol·m-2·s-1，光照14 h。處理完畢后取健康植株成熟葉片進(jìn)行各指標(biāo)測(cè)定，各測(cè)定指標(biāo)均重復(fù)3次。

氮藍(lán)四唑(NBT)法測(cè)定超氧物歧化酶(SOD)活力，愈創(chuàng)木酚法測(cè)定過氧化物酶(POD)活力，考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定可溶性蛋白含量，根系活力測(cè)定采用 TTC 法［12］。

用英國Hansatech公司生產(chǎn)的植物效率儀(Plant Efficiency Analyser，PEA，即非調(diào)制式熒光儀)，根據(jù)Strasser等［13］的方法改良后進(jìn)行葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)曲線及其參數(shù)的測(cè)定［14］。將高溫脅迫后的葉片暗適應(yīng)20 min后，每株任選3片功能葉進(jìn)行測(cè)量。Strasser創(chuàng)建的快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)分析中的初始熒光Fo，相當(dāng)于PSⅡ反應(yīng)中心處于完全開放時(shí)的熒光產(chǎn)量。最大熒光產(chǎn)量Fm，相當(dāng)于PSⅡ反應(yīng)中心處于完全關(guān)閉時(shí)的熒光產(chǎn)量。Fv/Fm=(Fm-Fo)/Fm，反映了PSⅡ反應(yīng)中心最大光能轉(zhuǎn)化效率。

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)耐熱生理指標(biāo)進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，P＜0.05時(shí)有顯著差異，P＜0.01時(shí)有極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度處理對(duì)百合雜交種及親本葉長SOD活性的影響

SOD作為超氧陰離子自由基(O-2)的酶性清除劑，在高溫脅迫下其活性變化因品種耐熱性不同而異［15］。表1可以看出，百合葉片SOD酶活性隨溫度的增加呈起伏狀態(tài)，分別在28℃與40℃出現(xiàn)兩個(gè)高峰，且前一個(gè)高峰略大于后一個(gè)高峰。28℃處理時(shí)，SOD酶活性升高并極顯著達(dá)到峰值(P＜0.01)。雜交種條葉百合×王百合SOD酶活性介于親本之間，條葉百合ב雪皇后’SOD酶活性低于親本，表明為了消除過量的活性氧，維持其自由基代謝系統(tǒng)的平衡，SOD酶活性有所增加，活性氧產(chǎn)量減少后，SOD酶活性隨之降低;隨溫度的持續(xù)升高，組織細(xì)胞受損程度變大，活性氧產(chǎn)量增加，SOD酶活性在37℃至40℃階段時(shí)有少量增加(P＜0.05)，可推測(cè)此時(shí)細(xì)胞受最大損害;條葉百合ב雪皇后’耐熱優(yōu)勢(shì)較為明顯。

表1 百合葉片SOD活性對(duì)溫度的響應(yīng)

2.2 溫度處理對(duì)百合雜交種及親本葉片POD活性的影響

POD在植物體內(nèi)的主要作用是清除H2O2，可有效保護(hù)細(xì)胞免受其傷害［16］，是植物體內(nèi)最重要的保護(hù)酶之一。由表2可見，POD酶活性在處理過程中呈先升高后下降再上升的變化趨勢(shì)。28℃處理時(shí)，POD酶活性極顯著上升并達(dá)到峰值(P＜0.01)，雜交種條葉百合×王百合介于親本之間，條葉百合ב雪皇后’顯著高于親本;37℃處理時(shí)，POD酶活性降至最低，表明在高溫脅迫下百合葉片清除H2O2的能力最弱;40℃處理時(shí)緩慢上升，雜交種POD活性均顯著高于親本，雜交優(yōu)勢(shì)明顯。

表2 百合葉片POD活性對(duì)溫度的響應(yīng)

2.3 溫度處理對(duì)百合雜交種及親本葉片可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

高溫處理可引起蛋白質(zhì)的分解，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)有所下降。表3可表明，可溶性蛋白隨溫度的增加呈起伏狀態(tài)。25℃處理時(shí)，可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)處于峰值;28℃處理時(shí)，可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)極顯著下降(P＜0.01)，雜交種可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)均高于母本;31℃處理時(shí)，可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)又顯著上升，表明植物體內(nèi)合成蛋白以抵御熱脅迫，植物耐熱性提高，雜交種分別介于親本之間;隨溫度的增加，可溶性蛋白合成受阻，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降，植物抵御熱害能力減弱。

2.4 溫度處理對(duì)百合雜交種及親本根系活力的影響

根系是植物正常生長發(fā)育的重要器官，主要供應(yīng)地上部生長所需的水分、礦物質(zhì)等。根系活力大小反映了根系代謝能力強(qiáng)弱，直接影響植株生長和抗逆性［17］。由表4可知，百合根系活力隨脅迫溫度的增高呈先升高后降低的變化趨勢(shì)。31℃處理時(shí)，百合各個(gè)品種根系活力極顯著上升并達(dá)到峰值(P＜0.01)，且兩雜交種根系活力顯著高于其親本，雜交種耐熱性優(yōu)于親本，雜交優(yōu)勢(shì)明顯;隨后緩慢下降至處理末。表明在較低溫度脅迫下，百合對(duì)低溫脅迫有一定的應(yīng)激能力，能保持較高的根系吸收、運(yùn)輸?shù)裙δ埽参锬蜔嵝蕴岣?。?dāng)脅迫溫度增加時(shí)，根系活力逐漸降低。

表3 百合葉片可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)溫度的響應(yīng)

表4 百合根系活力對(duì)溫度的響應(yīng)

2.5 溫度處理對(duì)百合雜交種及親本葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

初始熒光產(chǎn)量Fo也稱基礎(chǔ)熒光，代表不參與PSⅡ光化學(xué)反應(yīng)的光能輻射部分，是PSⅡ反應(yīng)中心處于完全開放時(shí)光產(chǎn)量，它與葉綠素濃度有關(guān)。Fo的增加可能是植物葉片PSII反應(yīng)中心出現(xiàn)可逆的失活或出現(xiàn)不易逆轉(zhuǎn)的破壞，也可能是植物葉片類囊體膜受到損傷，而且Fo增加量越多，類囊體膜受損程度就越嚴(yán)重［18］。

表5 百合葉片初始熒光參數(shù)對(duì)溫度的響應(yīng)

在處理過程中，F(xiàn)o呈先上升后下降再上升的變化趨勢(shì)，見表5。28℃處理時(shí)，雜交種及親本Fo極顯著上升并達(dá)到峰值(P＜0.01)，表明熱脅迫引起膜蛋白構(gòu)象的可逆變化，但雜交種Fo較親本均低，表明雜交種PSII反應(yīng)中心受到的傷害較親本低，雜交種耐熱性較親本強(qiáng);隨后Fo緩慢下降(P＜0.05)，百合葉片具有一定的御熱能力，耐熱性提高;37℃至40℃處理階段，F(xiàn)o又有緩慢上升的趨勢(shì)，表明百合PSII反應(yīng)中心出現(xiàn)不易逆轉(zhuǎn)的破壞，植物受損害程度嚴(yán)重。Fm是最大熒光產(chǎn)量，是PSⅡ反應(yīng)中心處于完全關(guān)閉時(shí)的熒光產(chǎn)量，反映通過PSⅡ的電子傳遞情況，見表6。

表6 百合葉片最大熒光產(chǎn)量參數(shù)對(duì)溫度的響應(yīng)

Fv/Fm是最大光化學(xué)量子產(chǎn)量，反映PSⅡ反應(yīng)中心內(nèi)稟光能轉(zhuǎn)換效率，葉暗適應(yīng)20 min后測(cè)得。在正常條件下該參數(shù)變化極小，不受物種和生長條件的影響，逆境下該參數(shù)明顯下降。表5可知，隨溫度的增加，F(xiàn)v/Fm變化趨勢(shì)不明顯，呈先上升后下降的緩慢變化趨勢(shì)。31℃處理時(shí)，F(xiàn)v/Fm緩慢上升達(dá)到峰值(P＜0.05)，雜交種均介于親本之間;隨后緩慢下降至處理末。表明溫度脅迫對(duì)Fv/Fm參數(shù)影響不大，見表7。

表7 百合葉片最大光能轉(zhuǎn)化效率參數(shù)對(duì)溫度的響應(yīng)

3 結(jié)論與討論

以抗性種質(zhì)條葉百合、王百合和‘雪皇后’為親本，通過有性雜交得到的雜交種條葉百合×王百合、條葉百合ב雪皇后’在高溫逆境脅迫下，對(duì)測(cè)定耐熱指標(biāo)反應(yīng)不完全一致，其耐熱性介于親本之間或高于親本。

超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)作為活性氧酶性清除系統(tǒng)，被認(rèn)為是植物抗熱性生理的基礎(chǔ)之一，高溫脅迫下植物細(xì)胞質(zhì)中SOD和POD活性增加［19-20］，本試驗(yàn)結(jié)果表明，28℃處理下百合葉片SOD活性明顯高于對(duì)照且達(dá)到峰值，在37～40℃處理階段，SOD活性又有緩慢上升趨勢(shì)，雜交種耐熱性均高于其親本，溫度處理末雜交種及親本SOD活性均高于對(duì)照處理，這與在翦股穎［4］、菊花［5］、杜鵑［6］、一串紅［7］、紅掌［21］和水稻［22］的研究結(jié)果一致，表明高溫脅迫可以提高植物的耐熱性，但與黃顯波［23］等研究高溫脅迫下水稻幼苗相關(guān)生理指標(biāo)結(jié)果不同，可能由于高溫脅迫處理的時(shí)間和條件不同所導(dǎo)致。百合各種(品種)POD酶活性呈先上升后下降的變化趨勢(shì)，處理末雜交種POD酶活性均高于親本。這與戚甫友等［4］、劉輝等［7］、江萍等［15］結(jié)果一致，說明隨著溫度升高，百合細(xì)胞活性氧的產(chǎn)生和消除的平衡被打破，為了消除過量的活性氧，維持其自由基代謝系統(tǒng)的平衡，POD酶活性有所增加，這是百合對(duì)高溫變化的生理響應(yīng)。

可溶性蛋白作為植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，其含量變化可反應(yīng)植物的代謝能力，抗性強(qiáng)的植株在高溫下可保持較高的蛋白合成速率與較低的蛋白降解速率［24］。本研究發(fā)現(xiàn)在溫度處理下，百合葉片可溶性蛋白含量呈起伏變化，28℃處理時(shí)，可溶性蛋白含量極顯著下降達(dá)到谷值，隨后呈現(xiàn)升-降-升的變化趨勢(shì)，處理末可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)均低于對(duì)照，這與張樂華等［6］、劉雪凝等［24］研究杜鵑和百合種球耐熱性結(jié)果不盡一致，可能是研究物種或處理方式不同，同時(shí)高溫脅迫可能增加了某些抗逆性酶的含量和活性，或是高溫誘導(dǎo)了某些新蛋白的合成，例如有可能合成熱激蛋白(HSP)［21］。HSP的合成途徑以及在細(xì)胞中的選擇定位，則對(duì)植物耐熱性獲得至關(guān)重要。但目前其相關(guān)機(jī)理還不明確，有待于進(jìn)一步研究。

根系活力泛指根系的吸收、合成、氧化和還原能力等，是一種客觀地反映根系生命活動(dòng)的生理指標(biāo)［25］。本研究得出，幼苗在31℃處理時(shí)，根系活力極顯著上升，兩雜交種分別比對(duì)照提高了380.2%與254.9%，隨后緩慢下降至處理末。百合幼苗根系活力呈現(xiàn)先增后降的趨勢(shì)，說明百合對(duì)溫度脅迫有一定的應(yīng)激能力，在較高的溫度脅迫下，百合根系能夠保持較高的根系活力，保持較高的吸收、運(yùn)輸?shù)裙δ埽S著脅迫溫度的增加，根系受到損傷，活力下降，這意味著百合的根系活力與耐熱性是密切相關(guān)的，這與劉雪凝等［24］對(duì)百合研究結(jié)果一致。

光合作用是植物生長的生理基礎(chǔ)，可以作為判斷植物生長勢(shì)和抗逆性強(qiáng)弱的指標(biāo)［7，26］。高溫脅迫可以使植物光合速率下降，生長減緩，出現(xiàn)氧化傷害癥狀。高溫是不利于植物生長的重要的環(huán)境因素之一，直接影響植物光合機(jī)構(gòu)的形成與功能。本研究中，31～34℃處理階段，F(xiàn)o與Fm均呈緩慢下降的趨勢(shì)，反映出此段時(shí)間熱脅迫不僅降低了葉片類囊體結(jié)構(gòu)的損傷，同時(shí)可提高PSⅡ的電子傳遞活性。在高溫下，F(xiàn)o上升被認(rèn)為 PSⅡ反應(yīng)中心失活［27］，而Fv/Fm伴隨Fo猝滅是光系統(tǒng)抵御脅迫的一種保護(hù)機(jī)制［28］，本試驗(yàn)中，溫度處理初期，F(xiàn)v/Fm呈緩慢上升降的趨勢(shì)，表明PSⅡ的潛在活性恢復(fù)，至31℃處理時(shí)，系統(tǒng)開始啟動(dòng)保護(hù)機(jī)制，提高熱耗散，從而避免受到高溫傷害。處理末，F(xiàn)o驟升，且Fv/Fm低于對(duì)照。處理過程中，F(xiàn)v/Fm變化與對(duì)照差異不顯著，表明溫度脅迫對(duì)PSⅡ最大原初光能轉(zhuǎn)換效率影響不大，這與高溫脅迫下兩品種一串紅及新鐵炮百合幼苗光合特性的研究結(jié)果一致［7，29］。

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