“理囊散”中揮發(fā)油提取工藝及促孕活性研究

曾云軍 ，李炳奇 ，陳韓英 ，劉 紅

（1.石河子大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院/新疆兵團(tuán)化工綠色過(guò)程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，新疆石河子 832003；2.石河子大學(xué)藥學(xué)院，新疆石河子 832003；3.石河子大學(xué)理學(xué)院，新疆石河子 832003）

治療奶牛不孕的中藥復(fù)方“理囊散”，由香附子、莪術(shù)、三棱等十余味中藥組成，主要用于治療卵巢囊腫和排卵延遲等原因造成的奶牛不孕癥，該復(fù)方作用效果持久，副作用小，具有促孕作用[1]，其中揮發(fā)油是其主要活性成分之一。

目前，揮發(fā)油的提取方法一般有水蒸氣蒸餾法、有機(jī)溶劑萃取法、超臨界流體萃取法，有機(jī)溶劑萃取法容易引入新的雜質(zhì)，造成有機(jī)溶劑殘留[2]，超臨界流體萃取法的成本較高且不適用于工廠生產(chǎn)[3]，而水蒸氣蒸餾法操作簡(jiǎn)便，基本無(wú)污染，是《中國(guó)藥典》中揮發(fā)油含量測(cè)定方法。本實(shí)驗(yàn)以揮發(fā)油得率為考察指標(biāo)，采用水蒸氣蒸餾法，單因素、正交設(shè)計(jì)考察了提取時(shí)間、加水量和浸泡時(shí)間對(duì)理囊散揮發(fā)油提取率的影響，確定了水蒸氣蒸餾法提取理囊散揮發(fā)油的最佳提取工藝?？疾炝死砟疑]發(fā)油對(duì)21日齡雌性昆明種小鼠子宮系數(shù)和卵巢卵泡發(fā)育的影響。以期為理囊散開發(fā)成新劑型提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

揮發(fā)油提取器（烏魯木齊市醫(yī)藥公司）；KMD型電熱套（武漢精華科技有限公司）；電子天平(北京賽多利斯天平有限公司)；AR-2140型萬(wàn)分之一電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司制造）；顯微鏡（Olympus）。

苯甲酸雌二醇注射液（上海通用藥業(yè)股份有限公司，每支 1mL，含雌二醇 2mg，批號(hào)：110514，用甘油稀釋成50 g·mL-1)；21日雌性昆明種小鼠（由石河子大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，分籠飼養(yǎng)，自由飲水和進(jìn)食）；中藥復(fù)方由石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院提供；蒸餾水（自制）。

1.2 方法

1.2.1 揮發(fā)油的提取

準(zhǔn)確稱取100 g中藥復(fù)方粉末，按照《中國(guó)藥典》2010版一部“附錄”X D揮發(fā)油測(cè)定法提取揮發(fā)油[4]，冷卻后讀取其體積數(shù)，再按下式計(jì)算揮發(fā)油得率。

1.2.2 揮發(fā)油提取的單因素實(shí)驗(yàn)

預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，揮發(fā)油得率與加水倍數(shù)、浸泡時(shí)間、提取時(shí)間有關(guān)系，因此先通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)考察提取理囊散揮發(fā)油的最佳工藝條件范圍。

（1）對(duì)加水倍數(shù)的考察 按照“1.2.1”項(xiàng)下方法，分別加入 8、10、12、14、16倍蒸餾水，浸泡 2h，提取3h，測(cè)定揮發(fā)油提取量并計(jì)算揮發(fā)油得率，以確定最佳加水倍數(shù)范圍。

（2）對(duì)浸泡時(shí)間的考察 按照“1.2.1”項(xiàng)下方法，加入12倍蒸餾水，分別浸泡0h、1h、2h、3h、4h，提取3h，測(cè)定揮發(fā)油提取量并計(jì)算揮發(fā)油得率，以確定最佳浸泡時(shí)間范圍。

（3）對(duì)蒸餾時(shí)間的考察 按照“2.1”項(xiàng)下方法，加入12倍蒸餾水，浸泡2h，分別提取0h，2h，4h，6h，8h，10h，12h，測(cè)定揮發(fā)油提取量并計(jì)算揮發(fā)油得率，以確定最佳提取時(shí)間范圍。

1.2.3 正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取影響揮發(fā)油提取效果的加水倍數(shù)（A）、浸泡時(shí)間（B）、提取時(shí)間（C）作為考察因素，每一個(gè)因素設(shè)3個(gè)水平，以揮發(fā)油得率為考察指標(biāo)，選用L9（34）正交表，因素水平表見表1。

表1 因素水平表

1.2.4 揮發(fā)油成分的促孕活性研究

準(zhǔn)確稱取“理囊散”中藥粉末適量，按正交試驗(yàn)選出的最優(yōu)工藝提取揮發(fā)油，收集揮發(fā)油待用。

（1）揮發(fā)油對(duì)小鼠子宮系數(shù)的影響試驗(yàn) 取雌性小鼠50只，體重9-12 g，隨機(jī)分為5組，分別為揮發(fā)油高、中、低劑量組（6 g/kg、4 g/kg、2 g/kg)，空白對(duì)照組及陽(yáng)性對(duì)照組。揮發(fā)油組灌服給藥，每天1次，連續(xù)給藥7 d；陽(yáng)性對(duì)照組從第4天開始腹腔注射雌二醇，0.5mg/kg，連續(xù)給藥7 d；空白對(duì)照組給予等體積蒸餾水。各組小鼠于末次給藥后24小時(shí)頸椎脫臼處死，剖開腹腔，摘取子宮，迅速稱子宮濕重，計(jì)算子宮系數(shù)[5]。

（2）揮發(fā)油對(duì)小白鼠卵巢的影響試驗(yàn) 取雌性小鼠50只，體重9-12 g，隨機(jī)分為5組，分別為揮發(fā)油高、中、低劑量組（6 g/kg、4 g/kg、2 g/kg)，空白對(duì)照組及陽(yáng)性對(duì)照組。揮發(fā)油組灌服給藥，每天1次，第4天劑量加倍，連續(xù)給藥7 d；陽(yáng)性對(duì)照組從第4天開始腹腔注射雌二醇，0.5mg/kg，連續(xù)給藥7 d；空白對(duì)照組給予等體積蒸餾水；各組小鼠于末次給藥后24小時(shí)頸椎脫臼處死，剖開腹腔，立即摘取卵巢，投入10%中性福爾馬林中固定48 h，常規(guī)石蠟切片，蘇木素-伊紅染色，顯微鏡下觀察卵泡直徑并進(jìn)行分類計(jì)數(shù)[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 對(duì)加水倍數(shù)的考察

圖1 加水倍數(shù)對(duì)揮發(fā)油得率的影響

由圖1可知，加水量在12倍時(shí)理囊散揮發(fā)油的收率為最高，可以認(rèn)為加水量過(guò)多導(dǎo)致精油在水中的溶解量也隨之增大，影響提取效果，必將降低出油率；反之，水散作用進(jìn)行不徹底，也將降低出油率，故選擇加水量為12倍左右進(jìn)行正交。

2.1.2 對(duì)浸泡時(shí)間的考察

圖2 浸泡時(shí)間對(duì)揮發(fā)油得率的影響

由圖2實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得，理囊散揮發(fā)油提取率隨著浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，在3h后基本不再增加，浸泡理論認(rèn)為浸泡可使植物細(xì)胞間隙變大，組織細(xì)胞充分膨脹，加速細(xì)胞內(nèi)、外液動(dòng)態(tài)交換而有利于揮發(fā)油的提取[7]。因此，可以認(rèn)為理囊散浸泡3h組織已經(jīng)充分膨脹，本著工業(yè)生產(chǎn)節(jié)約時(shí)間原則，浸泡時(shí)間選擇1、2、3h進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

2.1.3 對(duì)蒸餾時(shí)間的考察

圖3 蒸餾時(shí)間對(duì)揮發(fā)油得率的影響

觀察圖3提取過(guò)程可以看出，蒸餾2h前揮發(fā)油蒸餾出的比較多，6h后隨著蒸餾的增加，蒸餾出來(lái)的揮發(fā)油量增加緩慢。這是由于隨時(shí)間延長(zhǎng)，料液中油類組分減少，因此揮發(fā)油蒸餾出的量減少，故選擇2、4、6h進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)

表2 L9（34）正交設(shè)計(jì)表及結(jié)果

表3 方差分析

由直觀分析（表2）可知，各因素影響的主次順序?yàn)镃>B>A，由方差分析（表3）可得C因素具有顯著性影響(P<0.05)，最優(yōu)水平為A2B3C3，即加水量12倍，浸泡時(shí)間3h，提取6h。

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為確證該工藝的正確和穩(wěn)定性，考慮到實(shí)驗(yàn)誤差和實(shí)際生產(chǎn)，在上述正交實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，按優(yōu)選的最佳工藝條件，進(jìn)行了重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。即稱取中藥復(fù)方粉末100 g，按正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)3次，揮發(fā)油得率分別為0.54%、0.53%、0.54%，均高于正交實(shí)驗(yàn)中的各組實(shí)驗(yàn)值?？梢?，在最佳工藝條件下進(jìn)行理囊散揮發(fā)油的提取，不但揮發(fā)油得量高，而且重復(fù)性較好。

2.4 揮發(fā)油成分的促孕活性研究

2.4.1 各組對(duì)雌性小鼠子宮系數(shù)的影響 結(jié)果見表4。

表4 各組對(duì)雌性小鼠子宮系數(shù)的影響

由表4可知，與空白對(duì)照組相比，揮發(fā)油和理囊散高、中、低劑量組子宮系數(shù)明顯增加（P<0.05），用藥效果與藥物劑量呈正相關(guān)，但都低于陽(yáng)性對(duì)照組，說(shuō)明揮發(fā)油組能夠提高小鼠子宮系數(shù)。

表5 小鼠卵巢中各種類型卵泡百分比及最大卵泡直徑

2.4.2 小鼠卵巢中各種類型卵泡百分比及最大卵泡直徑 結(jié)果見表5。

從表5可以看出，與空白對(duì)照組相比，揮發(fā)油高、中、低3個(gè)劑量組中大型卵泡的百分比均顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05)；而中型卵泡和小型卵泡的百分比均顯著低于空白對(duì)照組(P<0.05)；揮發(fā)油中、低劑量組的最大卵泡直徑對(duì)空白組沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

揮發(fā)油為理囊散的主要有效成分之一，采用水蒸氣法提取揮發(fā)油，方法經(jīng)典成熟，不易造成污染，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。提取過(guò)程中發(fā)現(xiàn)有些藥材易浮于水面上，因此可在浸泡過(guò)程中不斷攪拌，使藥材組織細(xì)胞充分膨脹。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明，理囊散揮發(fā)油的提取工藝是合理、可行的。

小鼠子宮增重法是一種最常用的評(píng)價(jià)雌激素作用的方法，其原理主要是子宮組織含有大量的雌激素受體，雌激素或具有雌激素活性的化合物通過(guò)與受體結(jié)合，可誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)的反應(yīng)，使子宮組織的誘導(dǎo)蛋白含量增加，表現(xiàn)為子宮組織增生變厚而使子宮增重[8,9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，“理囊散”揮發(fā)油能明顯使幼鼠子宮系數(shù)增加(P<0.05)，且成劑量依賴性。提示“理囊散”揮發(fā)油具有促進(jìn)小鼠子宮發(fā)育的作用。

卵泡成熟的程度是判斷卵巢發(fā)育的程度的重要依據(jù)之一。本實(shí)驗(yàn)的小鼠卵巢變化結(jié)果表明，揮發(fā)油組發(fā)生了類似于雌二醇組的變化，其顯著特點(diǎn)是成熟卵泡比例，卵泡直徑均顯著高于陰性對(duì)照組，提示理囊散揮發(fā)油能促進(jìn)卵巢發(fā)育，使其提前出現(xiàn)性成熟后的形態(tài)學(xué)特征。

綜述所述，本實(shí)驗(yàn)確認(rèn)了“理囊散”中揮發(fā)油具有明顯的促孕活性，為理囊散開發(fā)成新劑型提供理論支持。

[1]羅瑞卿,谷新利.理囊散治療奶牛卵巢疾病性不孕癥的試驗(yàn)研究[J].乳業(yè)科學(xué)與技術(shù),2009,(5):243-245.

[2]張志軍,劉西亮,李會(huì)珍,等.植物揮發(fā)油提取方法及應(yīng)用研究進(jìn)展[J].中國(guó)糧油學(xué)報(bào),2011,26(4):5.

[3]溫悅,宋潔.揮發(fā)油提取分離研究概況[J].中國(guó)藥業(yè),2011,20(5):78-80.

[4]國(guó)家藥典委員會(huì)編.中華人民共和國(guó)藥典[M].北京;中國(guó)醫(yī)藥科技出版社.2010.

[5]劉勤興,李炳奇,邵會(huì)娟,等.促孕灌注液中黃酮對(duì)小白鼠卵巢、子宮及激素的影響[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2010,19(5):32-34.

[6]胡元亮,王小龍.中藥促孕液對(duì)小白鼠生殖器官發(fā)育和結(jié)構(gòu)的影響 [J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2001,32(05):426-433.

[7]鄭勇,張志蘭.正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)選豆蔻揮發(fā)油提取工藝[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2006,17(4):596.

[8]趙丕文,王大偉,王玲巧,等.用小鼠子宮增重法篩選淫羊藿等10種中藥雌激素樣作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2006,29(10):686-689.

[9]郝慶秀,王繼峰,牛建昭,等.四物湯及組方中藥植物雌激素活性的實(shí)驗(yàn)研究[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2009,(04):738-741.